Способ микробиологического синтеза рибофлавина

 

4 йсеооюзнал е :" о"технип:чооквл

6 бли еке А

389l32

ИЗОБРЕТЕНИЯ

Союз советских Социалистических

Республик

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

Зависимое от авт. свидетельства №

Заявлено 01 1!1.1971 (№ 1631379/30-15) с присоединением заявки №

Приоритет

Опубликовано 05.VII.1973. Бюллетень ¹ 29

Дата опубликования описания 15.XI.1973

М. Кл. С 12d 5/04

Государственный комитет

Совета Министров СССР по делам изобретений и открытий

УДК 663:577.164.12 (088.8) Авторы изобретения

С. И. Алиханян, А. И. Степанов, В. Г. Жданов и Л. А. Минеева

Всесоюзный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов

Заявитель

СПОСОБ МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОГО СИНТЕЗА

РИБОФЛАВИНА

Известны способы многоступенчатого выращивания гриба Eremothecium ashbyii в микробиологическом производстве рибо|флавина на питательных средах, содержащих мясной бульон.

Так, например, культуру, гриба Eremotheс1птп ashbyii (вторая генерация), выращенную

iIa косяках с агаризованной соевой средой, засевают в колбы с мясным бульоном. До момента передачи культуры II посевные аппара I û проходит пять †се дней, что отрп цательfIIo влияет на ее качество и соответственно на уровень синтеза витамина. В процессе многократных пересевов культуры накапливаются низкоактивные формы, что снижает ее.продуктивность. Указанный недостаток существующей технологии приготовления посевного материала для заводских аппаратов является одной из главных причин, низкого уровня синтеза витамина в промышленных условиях.

Кроме того, существующий способ не обеспечивает его стандартность и стерильность, что в значительной мере, нарушает ритмичность работы микробиологических предприятий, производящих рибофлавин.

Предлагаемый способ микробиологического синтеза рибофлавина включает приготовление посевного материала, ферментацию, высушивание культуральной жидкости и мицелию гриба.

Приготовление посевного материала вклю. чает три стадии:

1) выращивание культуры гриба- продуцента на косяках с питательной агаризованной средой;

2) приготовление пшена н выращивание на нем гриба-продуцента;

3) засев посевных аппаратов суспензией спор, смытых с пшена. ю

1. Выфащнвание культуры продуцента на косяках с питательной агаризованной средой.

Суспензию спор гриба готовят с выращенной на соевых косяках культурой и рассевают

15 в чашки Петри с дрозкжевой агарпзованной средой, содержащей, г:

Дрожжевой экстракт 2

Пептон 3

Глюкоза 10

Агар 20.

На 1 л водопроводной воды рН среды 6,5—

6,7. Стерллнзуют при 0,5 ать в течение 30 ли и.

После семи-восьми дней .инкубацин в термостате при 30 С выросшие колонии в количестве 10 шт.,пересевают на косяки с соевой агаризованной средой, содержащей, г:

Соевая мука 50

Саха,р 10

Агар 20, 3891 32 рН 6,6 — 6,7

ЦНИИПИ Заказ 30!3, 11 Изд. Ка 794 Тираж 467 Подписное

Сапунова, 2

Типография, пр.

На 1 л водопроводной воды рН 6,8 — 7,0.

Стерилизуют при 0,5 ати 30 мин.

Культуру с каждого косяка проверяют на уровень образования рибофлавина. Для этого семисуточную культуру продуцента, выращенную на косяках, пересевают в колбы Эрленмейера на 750 мл, содержащих 100 мл питательной среды следующего состава, г/л водопроводной воды:

Соевая мука 25

Гидрол 30

Кукурузный экстракт 30

Сахар 5

Солод 2,5

Мел (CaCO3) 5

NaC1 1

Дрожжи сухие 1

FeSO4 0,05

Z SO,, МпЬО, 0,025

MgSO» 0,7

С аС12 0,5

Среду стерилизуют при 1 ати в течение

3 мин., Культуру в колбах выращивают в течение

96 час при 30 С на качалке 200 — 220 об(мин.

Синтез витамина определяют флуорометрическим методом. Лучшие по активности вариа нты используют,для получения культуры второй генерации. Для этого косяки с соевой агаризованной средой засевают водной суспензией спор,:и мицелия культуры первой генерации. Засев пшена производят водной сус. пензией спор и мицелия продуцента с косяков второй генерации после их инкубации (7 — 8 дней при 30 С), 2. Приготовление пшена и выращивание на нем гриба Е. ashbyii.

Пшенную крупу промывают холодной водой до полного удаления механических примесей и грязи в промывной воде. Промытое пшено заливают свежеприготовленной молочной сывороткой. Пшено выдерживают;на кипящей водяной бане .в закрытой эмалированной посуде 30 мин до полного набухания зерен. После 10 — 15 мин выдерживания пшено распределяют равным тонким слоем на пергаментную бумагу (не должно быть комков), подсушивают 10 — 15 мин и,расфасовывают по 50 г в стерильные стеклянные флаконы объемом

500 мл. Приготовленное таким образом пшено трехкратно стерилизуют в автоклаве при

110 С по 1 час в,течение трех дней. Пшено перед засевом культуры должно быть слабо разваренное, сыпучее, светлое. Перед засевом пшено проверяют на стерильность. Для засева пшена используют водную суспензию спор и мицелия культуры второй генерации. 5 мл суспензии спор и мицелия культуры стерильно переносят в каждый флакон, после чего пшено во флако|нах встряхивают. Затем фла5

4Î

60 коны в горизонтальном положении помещают в термостат при 30 С на семь-восемь дней при ежедневном встряхивании. Пшено после прорастания гриба приобретает желтый цвет. Содержание спор в каждом флаконе равно

4 — 5 10 . Подсчет спор проводят в камере Горяева, а также рассевом в чашки Петри с дрожжевой агаризован ной средой. Пшено со спорами гриба высушивают в вакууме прн разрежении 0,8 атм в течение 10 — 12 час и температуре 20 — 25 С, Посевной материал должен быть проверен на отсутствие посторонней микрофлоры, жизнеспособность и способность к синтезу,рибофлавина. Срок хранения высушенного пшена три месяца, без подсушивания — месяц, в запарафинированных флаконах при комнатной температуре, в темноте.

3. Засев посевных аппаратов суспензией спор гриба, смытых с пшена.

Культуру, выращенную на пшене, используют для засева питательной среды посевных аппаратов (среда аналогична составу среды, описанной в разделе 1). Засев производят водной суспензией спор гриба, смытых с пшена. Для активации прорастания спор водную суспензию обрабатывают 1,5 -ным .раствором перекиси водорода (конечная .концентрация) в течение 1 мин. Для нормального развития гриба в посевных аппаратах необходимо создать концентрацию спор порядка 100 †2 спор на .1 мл среды. Например, в посевные аппараты объемом 1 м необходимо засеять

2 10 опор, Та ким образом, для засева одного аппарата объемом 1 м достаточно одного флакона с пшеном.

Предмет изобретений

1, Способ микробиологического сийтеза ри бофлавина на питательной среде, включаю. щей в качестве основных источников углеводов, азота и фосфора гидрол, соевую муку и кукурузный экстракт соответственно, при аэробных условиях выращивания культуры продуцента:и ферментации, отличающийся тем, что, с целью получения качественного и стандарпного посевного материала продуцснта рибофлавина аскомицета Eremothecium

ashbyii, â качестве органического субстрата для выращивания культуры используют пшено, приготовленное на молочной сыворотке.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что для засева пшена используют культуру второй генерации, выращенную на косяках с соевой агаризованной средой.

3. Способ по .п п. 1 и 2, отличающийся тем, что, с целью активации прорастания спор гриба, производят обработку водной суспензии спор перекисью водорода в конечной концентрации 1,5o в течение 1 мин, а засев осуществляют водной суспензией спор, смытых с пшена.