Способ получения l-карнозина и его гомологов

 

Использование: в медицинской химии. Сущность: усовершенствованный способ получения L-карнозина и его гомологов общей ф-лы NH₂(CH₂)_nCO-HiS, где n 2-5. Реагент 1: производное T-защищенной аминокислоты ф-лы I. Реагент 2: гидрохлорид метилового эфира L-гистирина. Процесс ведут в апротонном органическом растворителе, полученный N-защищенный тритильной группой метиловый эфир производного L-карнозина промывают щелочным водным раствором при pH-7,5-11, экстрагируют кислым водным раствором при pH 0,5-3, деблокируют. Выход 82-97%. Продукт высокой степени чистоты LD ₅₀ 10000-12000 мг/кг. 1 табл.

Изобретение относится к области синтеза биологически активных пептидов, конкретно к усовершенствованному химическому способу получения L-карнозина и его гомологов общей формулы I: где n= 2-5.

L-карнозин является природным дипептидом структуры β-AlaHis и обладает противоопухолевой /1/, антинистаминной /2/, иммуномоделирующей /3/, антистрессорной /4/, противоязвенной /5/ активностью, а также ранозаживляющим /6/ и антинеопластическим /7/ действием. Один из гомологов L-карнозина - L-гомокарнозин (n=3), содержащий вместо b -аланина 4-аминобутановую кислоту, обладает близким спектром активности /8/.

Известны многочисленные способы получения L-карнозина, основанные на взаимодействии N-защищенного производного b -аланина или b -замещенной пропионовой кислоты с L-гистидином или его метиловым эфиром. Так, L-карнозин получают взаимодействием b -йодопропионилхлорида с L-гистидином с последующей обработкой аммиаком /9/, реакцией N-фталоил-b-аланилхлорида с L- гистидином с последующим удалением защитной группы /10/, взаимодействием N-карбобензоксипропионилазида с метиловым эфиром L-гистидина с последующим деблокированием полученного пептида /11/, взаимодействием L-гистидина с тетрагидро-1,3-триазин-2,4-дионом в водной среде при pH 8,5 9,5 /12/ и др. Гомологи L-карнозина получают методами, обычно применяемыми для синтеза самого карнозина без их существенной модификации /13/. Так, гомокарнозин получают методом смешанных ангидридов из N-карбобензокси-4-аминобутановой кислоты и метилового эфира L-гистидина /14/.

Наиболее близким по технической сущности к описываемому является способ получения L-карнозина /15/, основанный на взаимодействии метилового эфира L-гистидина с паранитрофениловым эфиром N-фталоил-b-аланина в хлороформе с последующей перекристаллизацией защищенного дипептида, удалением метильной группы в щелочных условиях, отщеплением фталоильной группы гидразинолизом и перекристаллизацией целевого продукта. Способ позволяет получать L-карнозин с выходом 54% Недостатком всех ранее описанных способов получения синтетического L-карнозина и его гомологов является невозможность получения чистых пептидов без близких к ним по структуре примесей и с высоким выходом. Это обусловлено как наличием побочных реакций, протекающих в основном с участием имидазольного цикла гистидина /16/, так и невозможностью отделения L-карнозина и его гомологов от токсичных примесей (их рацемических форм, N-имидазольных изомеров и др.) вследствие близких физико-химических свойств этих примесей и свободного или защищенного L-карнозина и его гомологов. В результате наличия примесей синтетический L-карнозин и его гомологи начинают проявлять токсичность, не свойственную чистым препаратам /17/.

Предлагаемый способ получения L-карнозина и его гомологов общей формулы I заключается в том, что гидрохлорид метилового эфира L-гистидина формулы II: HisOMe·2РСl (II) конденсируют с N-тритил- b -аланилимидазолом или его гомологом общей формулы III: где n имеет указанные значения, в среде апротонного органического растворителя, полученный защищенный дипептид промывают от примесей водным щелочным раствором при pH 7,5-11, экстрагируют кислым водным раствором при pH 0,5-3, деблокируют в стандартных условиях и целевой продукт перекристаллизовывают.

В отличие от известного /15/, в заявляемом способе используются другие исходные соединения: N-тритил- β -аланин или его гомолог, активированный по C-концу имидазолом (или аналогом имидазола) и гидрохлорид метилового эфира L-гистидина. В результате образуется новый промежуточный продукт Trit-NH(CH₂)_n CO-HisOMe (n=2-5), который перед деблокированием сначала промывают от примесей водным щелочным раствором при pH 7,5-11, а затем экстрагируют кислым водным раствором при pH 0,5-3. Использование в описываемом способе исходных и промежуточных соединений иной структуры, нежели в известном способе, а также иных условий выделения промежуточных защищенных дипептидов позволяет предотвратить образование многочисленных примесей и загрязнение ими целевых продуктов.

Известно, что в ходе синтеза гистидинсодержащих пептидов, как правило, образуется целый ряд побочных продуктов, таких как дикетопиперазиды и соединения типа: где n 2 5 а X TritNH(CH₂)_n -
Однако в нашем случае образование таких примесей либо не происходит, либо они отделяются при экстракции, что подтверждается данными ТСХ, ЯМР-¹Н-спектров и исследования токсичности целевых пептидов.

Используемые в синтезе N-тритил- β -аланилимидазол и его гомологи являются новыми соединениями. Следует отметить, что возможность успешного получения и использования в синтезе таких соединений представлялась сомнительной, т.к. стерические затруднения, создаваемые тритильной группой, могут частично или полностью препятствовать синтезу дипептида, так и N-тритил- b -аланилимидазола и его гомологов. Еще более сомнительной представлялась возможность отделения промежуточного дипептида от близких по физико-химическим свойствам примесей при помощи простой экстракции.

Согласно данному изобретению L-карнозин и его гомологи общей формулы I получают по следующей схеме:

Сначала проводят активацию N-тритил- β -аланина или его гомолога тионилимидазолом или другими производными имидазола или бензимидазола в среде апротонного органического растворителя при -5^oC +40^oC в течение 10 - 90 мин. В качестве растворителя используют дихлорметан, хлороформ, этилацетат, тетрагидрофуран, диметилформамид и т. п. Затем к реакционной смеси добавляют гидрохлорид метилового эфира L-гистидина, триэтиламин и перемешивают в течение 36 ч при комнатной температуре до завершения реакции. Раствор, содержащий защищенный дипептид IV, отфильтровывают от выпавших солей, осадок промывают. Раствор защищенного дипептида IV промывают несколько раз водным щелочным раствором при рН 7,5 11, например раствором бикарбоната или карбоната натрия или калия. После этого экстрагируют защищенный дипептид IV из органической фазы кислым водным раствором при рН 0,5 3, например 20% -ной уксусной кислотой. Деблокируют дипептид IV в стандартных условиях и целевой продукт перекристаллизовывают.

Изобретение иллюстрируется нижеследующими примерами.

Пример 1. L-карнизон (NH₂(CH₂)₂CO-His).

3 г (44 ммоль) Имидазола и 7 мл (50 ммоль) триэтиламина растворяют в 10 мл дихлорэтана, в течение 20 мин добавляют смесь 5 мл дихлорметана с 1,46 мл хлористого тионила и перемешивают при 20^oC 50 мин. Затем к полученной реакционной массе добавляют 8 г (24 ммоль) N-тритил- b -аланина в 5 мл ДМФ, перемешивают 1 ч, добавляют 5,24 г (21,7 ммоль) гидрохлорида метилового эфира L-гистидина и 7 мл триэтиламина и перемешивают в течение 36 ч. Выпавшие соли отфильтровывают, промывают на фильтре 3 х 10 мл дихлорметана, затем объединенные фильтраты промывают 3 х 10 мл воды и 2 х 10 мл насыщенного NaHCO₃ (рН 8,6). Экстрагируют дипептид Trit b AlaHisOMe 20%-ным раствором уксусной кислоты (рН 2,3) и оставляют при 85^oC до полного отщепления тритильной группы. Тритиловый спирт экстрагируют 3 х 10 мл этилацетата, реакционную смесь упаривают досуха, добавляют 40 мл воды, упаривают повторно, смешивают с раствором 4,2 г LiOH·H₂O в 100 мл воды и оставляют перемешиваться на 2 ч. Затем через раствор пропускают СО₂ до рН 8, упаривают воду до объема 20 мл, отфильтровывают Li₂CO₃, добавляют 100 мл метанола и отфильтровывают выпавший осадок Li₂CO₃. К метанольному раствору добавляют 300 мл изопропанола, упаривают метанол и остатки воды на роторе до объема 100 мл, при этом выпадает осадок L-карнозина. Выход 4,5 г (92%).

Пример 2. L-карнозин ( NH₂(CH₂)₂CO-His).

3 г (44 ммоль) Имидазола и 7 мл (50 ммоль) триэтиламина растворяют в 10 мл метиленхлорида, в течение 20 мин при перемешивании добавляют смесь 5 мл метиленхлорида с 1,46 мл хлористого тионила и перемешивают при 18^oС 50 мин. Затем к полученной реакционной массе добавляют 8 г (24 ммоль) N-тритил- b -аланина в 5 мл ДМФ, перемешивают 1 ч, добавляют 5,24 г (21,7 ммоль) гидрохлорида метилового эфира L-гистидина и 11мл триэтиламина и перемешивают в течение 36 ч. Выпавшие соли отфильтровывают, промывают на фильтре 4 х 5 мл метиленхлорида, затем объединенные фильтраты промывают 2 х 10 мл 10% водным раствором Na₂CO₃ (рН 10,9). Экстрагируют дипептид Trit b AiaHisOMe 5% -ным водным раствором HCl (рН 0,3) при 0^oC и оставляют перемешиваться при комнатной температуре на ночь до полного отщепления тритильной группы. Тритиловый спирт экстрагируют 3 х 10 мл этилацетата, реакционную смесь упаривают досуха, добавляют 100 мл воды,повторно упаривают досуха, добавляют 200 мл Doweх I в ^-OH-форме и перемешивают при 50^oC в течение 2 ч до полного отщепления метильной группы. Смолу насыщают СО₂ до нейтрального pH зерен смолы, L-карнозин смывают 0,2 М раствором NH₄HCO₃, воду упаривают и L-карнозин перекристаллизовывают из этанола. Выход 4,45 г (90,7%).

Пример 3. L-карнозин (NH₂(CH₂)₂CO-His).

3 г (44 ммоль) Имидазола и 7 мл (50 ммоль) триэтиламина растворяют в 10 мл дихлорэтана, в течение 20 мин добавляют смесь 5 мл дихлорметана с 1,46 мл хлористого тионила и перемешивают при 20^oC 50 мин. Затем к полученной реакционной массе добавляют 8 г (24 ммоль) N-тритил- b аланина в 5 мл ДМФ, перемешивают 1 ч, добавляют 5,24 г (22,7 ммоль) гидрохлорида метилового эфира L-гистидина и 12 мл триэтиламина и перемешивают в течение 36 ч. Выпавшие соли отфильтровывают, промывают на фильтре 3 х 5 мл дихлорметана, затем объединенные фильтраты промывают 3 х 10 мл воды и 2 х 10 мл насыщенного KHCO₃ (pH 9,8). Экстрагируют дипептид Trit b AlaHisoMe 3 х 20 мл 20%-ным водным раствором уксусной кислоты (pH 2,3) и оставляют при 85^oC до полного отщепления тритильной группы. Тритиловый спирт экстрагируют 3 х 10 мл этилацетата, реакционную смесь упаривают досуха, добавляют 40 мл воды, упаривают повторно, смешивают с раствором 4,2 г LiOH·H₂O в 100 мл воды и оставляют перемешиваться на 2 ч. Затем через раствор пропускают СO ₂ до pH 8, упаривают воду до объема 20 мл, отфильтровывают Li ₂CO₃, добавляют 100 мл метанола и отфильтровывают выпавший осадок Li ₂CO₃. Фильтрат наносят на колонку 50 х 8 c 50 мл Dowex 50 в H⁺-форме, элюируют L-карнозин 2М раствором NH₄OH, фракции, содержащие L-карнозин объединяют, упаривают и перекристаллизовывают из изопропанола. Выход 4 г (82%).

Пример 4. L-гомокарнозин (NH₂(CH₂)₃CO-His).

3 г (44 ммоль) Имидазола и 12 мл (85 ммоль) триэтиламина растворяют в 10 мл метиленхлорида, в течение 20 мин при перемешивании добавляют смесь 5 мл метиленхлорида с 1,46 мл хлористого тионила и перемешивают при 18^oC 50 мин. Затем к полученной реакционной массе добавляют 8 г (24 ммоль) N-тритил-4-аминобутановой кислоты в 5 мл ДМФ, перемешивают 1 ч, добавляют 5,24 г (21,7 ммоль) гидрохлорида метилового эфира L-гистидина и 7 мл триэтиламина и перемешивают в течение 6 ч. Выпавшие соли отфильтровывают, промывают на фильтре 4 х 5 мл метиленхлорида, затем объединенные фильтраты промывают 3 х 10 мл воды, 2 х 10 мл 10% водным раствором NaHCO₃ (pH 8,6). Экстрагируют дипептид Trit-NH(CH₂)₃ CO-HisOME 4 х 20 мл 25%-ным водным раствором уксусной кислоты (pH 2,4) при 0^oC и оставляют перемешиваться при комнатной температуре на ночь до полного отщепления тритильной группы. Тритиловый спирт экстрагируют 3 х 10 мл этилацетата, реакционную смесь упаривают досуха, добавляют 4 х 20 мл воды, повторно упаривают досуха, добавляют 200 мл Dowex I в ^-OH-форме и перемешивают при 50^oC в течение 4 ч до полного отщепления метильной группы. Смолу насыщают СО₂ до нейтрального pH зерен смолы, L-гомокарнозин смывают 0,2 М раствором NH ₄HCO, воду упаривают и L-гомокарнозин перекристаллизовывают из изопропанола. Выход 4,56 г (87,5%).

Пример 5. 6-Аминокапроил-L-гистидин (NH₂(CH₂)₅CO-His).

3 г (44 ммоль) имидазола и 11 мл (78 ммоль) триэтиламина растворяют в 10 мл метиленхлорида, в течение 20 мин при перемешивании добавляют смесь 5 мл метиленхлорида с 1,46 мл хлористого тионила и перемешивают при 18^oC 50 мин. Затем к полученной реакционной массе добавляют 8 г (24 ммоль) N-тритил-6-аминогексановой кислоты в 5 мл ДМФ, перемешивают 1 ч, добавляют 5,24 г (21,7 ммоль) гидрохлорида метилового эфира L-гистидина и 7 мл триэтиламина и перемешивают в течение 36 ч. Выпавшие соли отфильтровывают промывают на фильтре 4 х 5 мл метиленхлорида, затем объединенные фильтраты промывают 3 х 10 мл воды, 2 х 10 мл 10% водным раствором NaHCO₃ (pH 8,6). Экстрагируют дипептид Trit-NH(CH₂)₅ CO-HisOMe 2 х 20 мл 25%-ным водным раствором уксусной кислоты (pH 2,4) при О^oC и оставляют перемешиваться при комнатной температуре на ночь до полного отщепления тритильной группы. Тритиловый спирт экстрагируют 3 х 10 мл этилацетата, реакционную смесь упаривают досуха, добавляют 10 мл воды, повторно упаривают досуха, добавляют 200 мл Dowex I в ^-ОН-форме и перемешивают при 50^oC в течение 3 ч до полного отщепления метильной группы. Смолу насыщают СО₂ до нейтрального pH зерен смолы, пептид NH₂(CH₂)₅COHis смывают 0,2 раствором NH₄HCO₃, воду упаривают и перекристаллизовывают целевой продукт из изопропанола. Выход 4,96 г (85,2%).

Физико-химические характеристики целевых и промежуточных соединений приведены в таблице.

ТСХ осуществляли на пластинах Merck Art N 5724, проявление веществ производили раствором, содержащим 1% NaI и 1% крахмала, или бензидиновым реактивом после обработки хлором, а также йодом для обнаружения неполярных примесей. ЯМР-¹H- спектры снимали в D₂O.

Данные ЯМР-¹H-спектроскопии и ТСХ подтверждают отсутствие примесей в целевых продуктах (отсутствие в ЯМР- ¹H-спектрах сигналов в областях, не характерных для L-карнозина и его гомологов и лишних пятен на хроматограммах).

Испытание острой токсичности L-карнозина и его гомологов проводили на белых мышах (самцах) линии FI(СВАхС57ВI) массой 28-30 г (4-10 животных в группе). Препараты вводили внутрибрюшинно в дозе 75 500 мг/мышь в 0,5 мл физиологического раствора. Время от момента введения препарата до окончания наблюдения составляло 7 суток. Были испытаны L-карнозин (препарат 1) и гомокарнозин (препарат 2), полученные по описываемому способу. Для сравнения использовали синтетический L-карнозин, полученный по способу-прототипу (препарат 3), L-карнозин, полученный препаративно из мяса крупного рогатого скола на Ленинградском заводе медпрепаратов (препарат 4), а также препарат L-карнозина, выпускаемый фирмой Serva.

Показано, что препарат 3 является токсичным в дозе 75 мг/мышь: гибель всех мышей наблюдалась через 5 мин после введения препарата.

Препараты 1 и 4 и являются малотоксичными: их LD₅₀ составляет 10000 мг/кг и 12000 мг/кг соответственно. Препарат фирмы Serva является более токсичным: его LD₅₀ составляет 5000 мг/кг.

Введение препарата 2 в дозе 200 мг/мышь не сказывается на самочувствии животных в течение всего срока наблюдения.

Таким образом, синтетические препараты L-карнозина и гомокарнозина, полученные по заявляемому способу, нетоксичны так же, как и природный L-карнозин (препарат 4), что наряду с данными ТСХ и ЯМР-¹H-спектроскопии подтверждает чистоту пептидов, получаемых согласно изобретению.

Формула изобретения

Способ получения L карнозина и его гомологов общей формулы I

где n 2 5,
включающий конденсацию производного N-защищенной аминокислоты с производным L-гистидина в апротонном органическом растворителе, деблокирование защищенного дипептида и перекристаллизацию целевого продукта, отличающийся тем, что в качестве производного N-защищенной аминокислоты используют соединение общей формулы II

а в качестве производного L-гистидина-гидрохлорид метилового эфира L-гистидина формулы III
His OMe · 2 HCl
с получением защищенного дипептида общей формулы IY

где n 2 5,
который промывают от примесей водным щелочным раствором при рН 7,5 11 и экстрагируют кислым водным раствором при рН 0,5 3, а затем деблокируют.

РИСУНКИ

Рисунок 1