Трансплантация гемопоэтических клеток

 

Изобретение относится к коррекции чувствительной, двигательной и/или когнитивной недостаточности с помощью интрацеребральной трансплантации клеток, а также к клеткам и лекарственным средствам для осуществления указанной трансплантации. Представлена трансплантация гемопоэтических стволовых клеток для лечения поврежденного головного мозга. При этом гемопоэтическая стволовая клетка является условно иммортализованной, может включать чувствительный к температуре онкоген, который не экспрессируется при температуре выше 35^oС и экспрессирует Т-антиген SV40. Гемопоэтическая стволовая клетка может быть генетически трансформирована для экспрессии терапевтического гетерологичного генного продукта. Технический результат: интрацеребральная трансплантация гемопоэтических стволовых клеток может быть использована для лечения болезни Альцгеймера, болезни Паркинсона и болезни Крейцфельда-Якоба. 2 с. и 10 з.п. ф-лы.

Область изобретения Настоящее изобретение относится к коррекции чувствительной, двигательной и/или когнитивной недостаточности с помощью интрацеребральной трансплантации клеток, а также к клеткам и лекарственным средствам для осуществления указанной трансплантации.

Предпосылки к созданию изобретения Чувствительная, двигательная и/или когнитивная недостаточность вызываются многими заболеваниями, а также могут вызываться травмой головного мозга. Например, двигательная дисфункция является одним из симптомов болезни Паркинсона. В большинстве случаев до сих пор не существует удовлетворительного лечения.

Bjornson et al., Science (1999) 283:534-537, описывает способность нейрональных стволовых клеток вырабатывать разнообразные типы клеток крови, включая миелоидные, лимфоидные и гемопоэтические клетки. Считается, что нейрональные стволовые клетки содержат соответствующие механизмы, которые требуются для экспрессии в норме "молчащей" генетической информации отвечать на сигналы, которые в норме стимулируют стволовые клетки кроветворения. Этот эксперимент предполагает, что система крови у взрослых содержит мощные сигналы, которые "активируют" нейрональные стволовые клетки.

Гемопоэтические клетки являются клетками-предшественниками для всех клеток крови, включая лейкоциты и эритроциты. Трансплантация таких клеток была предложена, например, в WO-A-92/11355 в связи с нарушениями гемопоэза, включая серповидно-клеточную анемию и гемофилию. Способы культивирования и генетического изменения гемопоэтических стволовых клеток описаны в WO-A-92/11355 и WO-A-93/18137.

Краткое описание изобретения Настоящее изобретение частично основано на том наблюдении, что после трансплантации в поврежденный или пораженный участок мозга, гемопоэтические стволовые клетки, как оказалось, отвечают на сигналы от поврежденного или пораженного участка мозга, проявляя фенотип, который способен заменить или компенсировать функциональную недостаточность, которая обусловлена указанным повреждением или заболеванием.

Для использования по настоящему изобретению гемопоэтические стволовые клетки должны обладать способностью дифференцироваться в клетки, подходящие для восстановления или компенсации повреждения или заболевания в зоне-мишени головного мозга. Следует оценить тот факт, что клетки для трансплантации не должны обладать способностью дифференцироваться во все типы или фенотипы нейрональных клеток.

Указанное лечение можно осуществлять любому млекопитающему, но настоящее изобретение особенно касается лечения человека, особенно лечения человеческими клетками, и человеческими клетками, и клеточными линиями.

Клетки по настоящему изобретению способны корректировать чувствительную, двигательную и/или когнитивную недостаточность после имплантации в поврежденную область головного мозга человека. Термин "повреждение", используемый в настоящем документе, включает снижение или утрату функции. Этот термин включает также утрату клеток. Повреждение может быть вызвано любым из различных факторов, включая физическую травму, гипоксию (недостаток кислорода), химические агенты, например повреждение может быть вызвано лекарственной зависимостью, а также болезнью. Следующие заболевания и патологические состояния являются примерами заболеваний или состояний, которые приводят к чувствительной, двигательной и/или когнитивной недостаточности, которые можно лечить в соответствии с настоящим изобретением: травматическое повреждение мозга, инсульт, перинатальная ишемия, включая церебральный паралич, болезнь Альцгеймера, болезнь Пика и родственные им нейродегенеративные заболевания, связанные с деменцией, мультиинфарктная деменция, болезнь Паркинсона и болезни типа Паркинсона, болезнь Гентингтона, болезнь Корсакова и болезнь Крейцфельда-Якоба. Амнезию, особенно после транзиторной обширной ишемии, такой как ишемии, вызванной остановкой сердца или операции коронарного шунтирования, также можно лечить в соответствии с настоящим изобретением.

Клетки можно вводить также в области, удаленные от истинного участка повреждения, например клетки можно вводить в контралатеральный относительно поврежденного участок.

Настоящее изобретение относится к применению гемопоэтических стволовых клеток необязательно в выделенной форме для производства лекарственного средства, для лечения чувствительной, двигательной и/или когнитивной недостаточности. Лекарственное средство, предназначенное для введения, включает гемопоэтические стволовые клетки.

Настоящее изобретение относится также к применению условно иммортализованных гемопоэтических стволовых клеток для производства лекарственного средства для лечения чувствительной, двигательной и/или когнитивной недостаточности. Лекарственное средство, предназначенное для введения, включает условно иммортализованные гемопоэтические стволовые клетки.

Условно иммортализованные клетки по настоящему изобретению и применяемые по настоящему изобретению могут происходить из клональных клеточных линий или могут представлять собой смешанную популяцию. Клетки из клональных клеточных линий могут быть предпочтительными. Можно использовать клетки из одной клеточной линии или смесь клеток из двух или более клеточных линий.

Настоящее изобретение относится также к фармацевтическому препарату, включающему клетки по настоящему изобретению и фармацевтически приемлемый носитель.

Описание изобретения Настоящее изобретение основано на открытии того, что после имплантации в поврежденный участок мозга гемопоэтические стволовые клетки дифференцируются в такую форму клеток, которая способна восстанавливать повреждение и улучшать функцию. Фенотип дифференцированных клеток может быть таким же, как у поврежденных или утраченных клеток, однако дифференцированные клетки могут иметь другой фенотип или ряд фенотипов. В любом случае клетки принимают такой фенотип, который способен функционально интегрироваться и компенсировать поврежденные или утраченные клетки. Этому способствует склонность этих клеток, которую открыли заявители, находить и мигрировать в поврежденную ткань.

Применение стволовых клеток означает, что с помощью одной клональной клеточной линии становится возможным восстановление повреждения ряда различных областей головного мозга. Это означает также, что если для восстановления повреждения в данной области требуется более одного конкретного клеточного типа, то единственная клеточная линия будет способна дифференцироваться в различные типы требующихся клеток.

Условно иммортализованные клетки представляют собой клетки, которые являются бессмертными при определенных разрешающих условиях, но не являются бессмертными при неразрешающих условиях. В настоящем случае это означает, что путем условной иммортализации стволовых клеток и поддержания их при разрешающих условиях развитие стволовых клеток может быть приостановлено на выбранной стадии, и они могут размножаться в течение длительного периода времени. Применение условной иммортализации позволяет развивать клональные линии, которые легко развиваются in vitro. Если условия, при которых поддерживаются клетки, изменяются на неразрешающие, возможно дальнейшее развитие клеток. Если созданы правильные условия, клетки будут продолжать развиваться и дифференцироваться.

Иммортализованные клетки обычно получают путем транс-дукции онкогена в клетки. Таким образом, имеется риск образования опухолей через определенное время, поэтому такие клетки не являются предпочтительными для применения по настоящему изобретению.

Условно иммортализованные клетки обладают преимуществами иммортализованных клеток в том, что они являются "замороженными" на желательной стадии развития, легко поддерживаются и хорошо размножаются при разрешающих условиях, но их можно использовать в трансплантатах до тех пор, пока в среде, в которую их трансплантировали, имеются неразрешающие условия. В случае клеток по настоящему изобретению ген, который используется для сообщения клеткам условного бессмертия, следует выбирать таким образом, чтобы условия, имеющиеся в головном мозге, соответствовали неразрешающим условиям.

Примером подходящего условно иммортализованного онкогена является такой онкоген, который экспрессирует не связывающийся с ДНК, чувствительный к температуре Т-антиген; его описание можно найти в US-A-5688692 или WO-A-97/10329.

Если используются неиммортализованные клетки, тогда их можно поддерживать in vitro в культуральной среде с добавлением факторов роста, как описано в WO-A-92/11355 и WO-A-93/18137.

Ген, который используется для придания условного бессмертия, можно встроить в клетки после экстракции из костного мозга животного.

Клетки, которые используются для лечения человека, следует предпочтительно получать из клеток человека, чтобы свести к минимуму проблемы, связанные с иммунным отторжением. Это требует извлечения клеток из костного мозга человека.

Однако клетки необязательно должны быть условно иммортализованными и могут быть получены непосредственно от пациента, подвергаемого лечению.

Для лечения пациента обычно полезно знать, где именно в головном мозге имеет место повреждение. После того как наличие повреждения было установлено, находится ли оно на изолированном участке или на нескольких участках, можно осуществлять лечение имплантацией клеток в поврежденный участок. Во многих случаях, однако, локализация и/или тип поврежденной ткани может быть неизвестен или плохо охарактеризован. Например, нейродегенеративные заболевания могут приводить к обширному повреждению различных типов клеток. Лечение такого повреждения все же возможно, и ему способствует способность гемопоэтических стволовых клеток активно мигрировать после трансплантации и находить поврежденную ткань. Стволовые клетки можно трансплантировать в один участок или предпочтительно в множество участков, и они могут мигрировать в участок (участки) повреждения и уже там дифференцироваться в ответ на локальную микросреду в необходимый фенотип или фенотипы для улучшения или восстановления функции.

После лечения за улучшением состояния пациента можно наблюдать с помощью чувствительных, двигательных и/или когнитивных методик, и/или, если желательно, с помощью методик, позволяющих изучать активность головного мозга в выбранных областях головного мозга. Например, тесты на когнитивную функцию можно выполнять до и после трансплантации.

Предпочтительно лечение будет существенно корректировать чувствительную, двигательную и/или когнитивную недостаточность (поведенческую и/или психологическую недостаточность). Однако это может быть не всегда осуществимо. Лечение по настоящему изобретению и с применением клеток, лекарственных средств и фармацевтических препаратов по настоящему изобретению может приводить к улучшению функции без полной коррекции. Такое улучшение все же будет иметь смысл и ценность.

Количество клеток, которое будет использоваться, будет варьировать в зависимости от характера и объема поврежденной ткани. Обычно количество клеток, используемых для трансплантации, будет в пределах приблизительно от ста тысяч до нескольких миллионов. Нет необходимости ограничивать лечение единственным трансплантатом. Для дальнейшего улучшения функции можно осуществлять дополнительные трансплантации.

Для изучения трансплантации на экспериментальных животных можно использовать тесты, описанные в Hodges et al., Pharmacology, Biochemistry and Behaviour (1997) 56(4):763-780. В одном тесте используют крыс, у которых методика окклюзии четырех сосудов (4 VO), имитирующая сердечный инфаркт у человека, вызывает относительно ограниченное и специфическое повреждение пирамидных клеток СА 1 дорсальной области гиппокампа, с проявлениями когнитивной недостаточности в виде трудностей при поиске погруженной под воду и невидимой платформы в плавательном бассейне. Это создает модель когнитивной дисфункции, которая наблюдается как следствие распространенной формы повреждения головного мозга, т. е. временного прекращения кровоснабжения головного мозга, например такого, которое наблюдается во время остановки сердца.

Способы трансплантации клеток человеку и животным известны специалистам и описаны в специальной литературе. Термин "трансплантация", используемый в настоящем документе, включает трансплантацию клеток, которые были выращены in vitro и могли быть генетически модифицированы, а также трансплантацию материала, извлеченного из другого организма. Клетки могут быть трансплантированы путем имплантации посредством инфузии микрошприцем известного количества клеток в область-мишень, где они должны нормально распределиться вокруг участка инъекции. Их можно также имплантировать в полость желудочков головного мозга. Если их имплантируют новорожденному, то они могут распределиться по всему головному мозгу.

Выражение "интрацеребральная трансплантация", используемое в настоящем документе, включает трансплантацию в любую часть головного мозга. Трансплантация не ограничивается лобной и самой большой частью мозга.

О пригодности настоящего изобретения к настоящему времени независимо сообщено Chopp et al. , Society for Neuroscience (1999), vol. 25, реферат 528.2. Этот реферат был опубликован после даты приоритета настоящей заявки, и в нем подробно описана интрацеребральная трансплантация гемопоэтических стволовых клеток у мышей.

Как подробно описано в указанном реферате, взрослым мышам осуществляли окклюзию средней мозговой артерии (МСАо), и культивированные стволовые клетки (с инфузией фактора роста) трансплантировали в ишемизированное полосатое тело (через 4 дня после МСАо). Специфичные в отношении клеточного типа маркеры использовали для идентификации донорских клеток после трансплантации. Результаты показали, что донорские клетки пережили трансплантацию и были морфологически различимы в ишемизированном полосатом теле, проявляя фенотип нейрональных клеток и астроцитов.

Для специалиста в данной области будут очевидны подходящие наполнители, разбавители и носители, а также композиции, подходящие для интрацеребральной трансплантации.

Стволовые клетки по настоящему изобретению могут быть генетически трансформированы для экспрессии гетерологичного генного продукта, в частности терапевтического генного продукта, который оказывает свое действие в участке повреждения. Примеры подходящих генных продуктов описаны в US-A-5958767.

В предпостительном варианте осуществления изобретения столовые клетки могут включать чувствительный к температуре выше 35^oС. В особенно предпочтительном варианте осуществления указанный онкоген экспрессирует Т-антиген SV40.

Формула изобретения

1. Применение гемопоэтических стволовых клеток для производства лекарственного средства для лечения чувствительной, двигательной и/или когнитивной недостаточности.

2. Применение по п. 1 для интрацеребральной трансплантации в поврежденный головной мозг.

3. Применение по п. 1 или 2 для лечения болезни Альцгеймера, болезни Паркинсона, болезни Корсакова или болезни Крейцфельда-Якоба.

4. Применение по любому из предшествующих пунктов, отличающееся тем, что гемопоэтическая стволовая клетка является условно иммортализованной.

5. Применение по п. 4, отличающееся тем, что клетка включает чувствительный к температуре онкоген, который не экспрессируется при температуре выше 35^oС.

6. Применение по п. 5, отличающееся тем, что онкоген экспрессирует Т-антиген SV40.

7. Применение по любому из предшествующих пунктов, отличающееся тем, что гемопоэтическая стволовая клетка генетически трансформирована для экспрессии терапевтического гетерологичного генного продукта.

8. Способ лечения чувствительной, двигательной и/или когнитивной недостаточности, включающий интрацеребральную трансплантацию гемопоэтических стволовых клеток.

9. Способ по п. 8, отличающийся тем, что гемопоэтическая столовая клетка является условно иммортализованной.

10. Способ по п. 9, отличающийся тем, что клетка включает чувствительный к температуре онкоген, который не экспрессируется при температуре выше 35^oС.

11. Способ по п. 10, отличающийся тем, что онкоген экспрессирует Т-антиген SV40.

12. Способ по любому из пп. 8-11, отличающийся тем, что гемопоэтическая стволовая клетка генетически трансформирована для экспрессии терапевтического гетерологичного генного продукта.