Способ получения комплекса биологически активных полипептидов для нормализации функций головного мозга и фармацевтическое средство на его основе
Группа изобретений относится к химико-фармацевтической промышленности и касается выделения биологически активных веществ из органов животных. Выделенный целевой продукт может использоваться в медицине, фармацевтике и ветеринарии как фармацевтическое средство, способное нормализовать функции головного мозга. Сущность заявляемого способа получения препарата состоит в том, что кору головного мозга убойных животных замораживают, замороженную ткань гомогенизируют, проводят экстракцию гомогената раствором уксусной кислоты в присутствии хлористого цинка, сепарируют, обрабатывают надосадочную жидкость ацетоном, промывают образовавшийся осадок ацетоном, высушивают осадок, проводят экстракцию полипептидов из высушенного порошка водой для инъекций с последующей фильтрацией, стерилизацией и лиофилизацией целевого продукта, но в отличие от известных способов часть операций изменена. Для производства используют кору головного мозга скота до 12-месячного возраста. Операцию замораживания ткани мозга осуществляют при температуре не выше -18°С. Замороженную кору головного мозга используют не ранее чем через 2 месяца и не позднее чем через 8 месяцев. Экстракцию полипептидов из высушенного порошка осуществляют водой для инъекций в две стадии. На первой стадии экстракцию проводят при рН 5,5-6,5 и температуре 18-22°С. После отделения экстракта проводят вторую стадию экстрагирования полипептидов водой для инъекций при тех же условиях. Способ обеспечивает повышение качества и процента выхода целевого продукта. Фармацевтическое средство для нормализации функций головного мозга, содержит в качестве активного начала целевой продукт, полученный предложенным способом и представляющий собой комплекс биологически активных полипептидов с мол.м. 500-15000 Дальтон, изоэлектрической точкой 3,5-9,5 и максимумом поглощения в УФ-спектре, при длине волны 275±6 нм. 2 н.п.ф-лы, 10 табл.
Изобретение относится к химико-фармацевтической промышленности и касается выделения биологически активных веществ из органов животных. Выделенный целевой продукт может использоваться в медицине, фармацевтике и ветеринарии как фармацевтическое средство, способное нормализовать функции головного мозга.
Известно несколько способов получения биологически активного пептидного препарата из тканей различных участков головного мозга. Все они предусматривают операции гомогенизации ткани, кислотную экстракцию, отделение осадка и выделение из него целевого продукта (см., например [1], [2], [3], [4[, [5]). Способы различаются условиями проведения операций и веществами, которые используются в процессе проведения операций.
В заявке на изобретение РФ №96102207 ([4]) в способ включены также операции замораживания и размораживания сырья.
Известен способ получения препарата [6] из коры головного мозга убойных животных, обладающего восстанавливающей активностью при нарушении функций головного мозга, который включает все указанные выше операции. Исходное сырье (ткань, содержащая серое вещество полушарий головного мозга) обрабатывают ацетоном при температуре от -10 до -4°С и соотношении ткани мозга и ацетона 1:5 в течение 18-30 ч, далее проводят операции гомогенизации и экстрагирования гомогената 2-4%-ным раствором уксусной кислоты в течение 48-72 ч при рН 3,5-4,5 в присутствии хлористого цинка в концентрации 0,6-1,2 г/л и при соотношении гомогената и раствора уксусной кислоты 1:(8-4), центрифугирования, осаждения биологически активных веществ ацетоном при температуре от -3 до -5°С и соотношении супернатанта и ацетона 1:(7-5) и ионообменной хроматографии полученного осадка на катионите "Биокарб". В результате ионообменной хроматографии получают фракцию, содержащую щелочные полипептиды, которые обладают стимулирующим (или восстанавливающим при снижении активности мозга) действием на клетки коры головного мозга.
Однако описанный известный способ не позволяет извлечь из коры головного мозга кислые и нейтральные полипептиды и получить биологически активные вещества, обладающие другим действием (например, противосудорожной активностью).
Наиболее близким решением к предлагаемому является способ по патенту РФ №2104702 [7]. В соответствии с патентом ткань головного мозга замораживают при -40°С, измельчают, экстрагируют раствором уксусной кислоты в присутствии хлористого цинка 30-48 ч при 10-15°С, обрабатывают ацетоном, после высушивания надосадка порошок растворяют в дистиллированной воде рН 5,5-6,5 при 18-22°С, удаляют вещества с мол. м. более 15000 Да. В результате получают фармацевтическое средство, содержащее в качестве активного начала выделенный целевой продукт в виде комплекса биологически активных полипептидов с мол.м. от 500 до 15000 Да и изоэлектрической точкой 3,5-9,5.
Однако в результате многочисленных опытов были выявлены недостатки данного способа, устранение которых позволило повысить процент выхода готовой продукции из обработанного сырья и повысить ее качество.
Задача предлагаемого решения состоит в повышении качества и процента выхода целевого продукта.
Сущность заявляемого способа получения препарата состоит в том, что кору больших полушарий головного мозга убойных животных замораживают, замороженную ткань гомогенизируют, проводят экстракцию гомогената раствором уксусной кислоты, содержащей хлористый цинк в концентрации 1,2 г/л при массовом соотношении гомогената и раствора уксусной кислоты 1:5, сепарируют, обрабатывают надосадочную жидкость ацетоном, промывают образовавшийся осадок ацетоном, высушивают осадок, проводят экстракцию полипептидов из высушенного порошка водой для инъекций с последующей фильтрацией, стерилизацией и лиофилизацией целевого продукта, но в отличие от известных способов часть операций изменена. Для производства используют кору головного мозга скота до 12-месячного возраста. Операцию замораживания ткани мозга осуществляют при температуре не выше -18°С. Замороженную кору головного мозга используют не ранее чем через 2 месяца и не позднее чем через 8 месяцев. Экстракцию полипептидов из высушенного порошка осуществляют водой для инъекций в два этапа. На первом этапе экстрагирование высушенного осадка проводят водой для инъекций при рН 5,5-6,5 и температуре 18-22°С в течение 30 минут, полученный экстракт отделяют от осадка центрифугированием, после отделения экстракта из оставшегося осадка проводят повторное экстрагирование полипептидов в течение 20 мин при тех же условиях, первичный и вторичный экстракты объединяют и подвергают дальнейшей обработке.
Фармацевтическое средство для нормализации функций головного мозга содержит в качестве активного начала целевой продукт, полученный предложенным способом и представляющий собой комплекс биологически активных полипептидов с мол.м. 500-15000 Дальтон, изоэлектрической точкой 3,5-9,5 и максимумом поглощения в УФ-спектре при длине волны 275±6 нм.
Таким образом, в заявляемом способе, в отличие от известного, часть операций изменена и введены новые операции выделения целевого продукта. Для производства используют кору головного мозга скота до 12-месячного возраста. Операцию замораживания ткани мозга осуществляют при температуре не выше -18°С. Замороженную кору головного мозга используют не ранее чем через 2 месяца и не позднее чем через 8 месяцев. Экстракцию полипептидов из высушенного порошка осуществляют водой для инъекций в две стадии. На первой стадии экстракцию проводят при рН 5,5-6,5 и температуре 18-22°С 30 минут. После отделения экстракта проводят вторую стадию экстрагирования полипептидов из осадка водой для инъекций при тех же условиях в течение 20 минут.
Использование предлагаемого режима замораживания обеспечивает более глубокое промораживание тканей мозга, способствующее более эффективному уничтожению вредных микробов и микроорганизмов, которые могут находиться в сырье. Подобный режим замораживания легче проконтролировать, что позволит повысить качество сырья. Кроме того, он соответствует современному обеспечению холодильными установками скотобоен.
Таким образом, подобный режим замораживания позволяет получить сырье для производства целевого продукта в большем объеме, так как производств с морозильными камерами в этих пределах замораживания больше, чем производств с камерами глубокого замораживания.
Проведение экстракции полипептидов в два этапа обеспечивает существенное повышение процента выхода целевого продукта. Как показали испытания, на первой стадии экстрагирования нужный комплекс полипептидов мог быть получен только в объеме не более 8%, а после второго этапа экстрагирования количество нужных полипептидов увеливается до 37%.
Целевой продукт представляет собой лиофилизированный порошок белого или белого с желтоватым оттенком цвета и содержит комплекс биологически активных полипептидов. При добавлении растворителя препарат умеренно растворим в воде, 0,9%-ном растворе NaCl, 0,25-0,5%-ном растворе новокаина. Раствор препарата прозрачен. Цвет раствора не превышает эталон 56 (ГФХ1, с.194-197).
Изобретение иллюстрируется примером конкретного выполнения способа. Исходное количество головного мозга 1 кг. Ткань мозга очищают от сгустков крови, жировой клетчатки, промывают водой и укладывают на поддон слоем не выше 40-50 мм. В течение часа сырье должно поступить на заморозку. Указанная высота слоя сырья должна обеспечить однородность промораживания. Замораживают сырье при температуре не выше -18°С и хранят не менее 2-х месяцев при температуре также не выше -18°С, но не более 8-ми месяцев, что обеспечивает глубину промерзания и эффективность уничтожения вредных элементов и повышает качество сырья.
Далее сырье подвергают гомогенизации до получения гомогенной массы с помощью мясорубки (измельчителя или дробилки) и проводят экстракцию 3%-ным раствором уксусной кислоты (рН 3,5), содержащей хлористый цинк в концентрации 1,2 г/л при массовом соотношении измельченной массы и раствора уксусной кислоты 1:5. Массу постоянно перемешивают при охлаждении до t= от 7 до 16°С в течение 48 ч. Такой режим обеспечивает полноту извлечения биологически активных веществ. По окончании процесса экстрагирования дают осесть основной массе диспергированной ткани, а экстракт подают на сепаратор.
На сепараторе происходит освобождение экстракта от балластных веществ. Используется режим сепаратора от 1000 до 2000 об/мин.
Осветленный и очищенный на сепараторе экстракт поступает в реактор, где его обрабатывают ацетоном при t=-3-5°C и массовом соотношении экстракта и ацетона 1:5. Смесь перемешивают и оставляют на 4 часа для формирования осадка.
Полученный осадок промывают охлажденным ацетоном до тех пор, пока осадок не приобретет светло-серый или белый цвет (примерно 2-4 раза), что зависит от наличия жира в сырье. Затем осадок протирают через металлическое сито, сушат при t=35°C до остаточной влажности не более 10% и получают порошок.
Порошок засыпают в 200 мл очищенной воды или воды для инъекций (рН 6,5) при t=18-22°С и в течение 30 мин смесь перемешивают. Происходит экстракция полипептидов из порошка. Жидкая составляющая смеси содержит нужный комплекс пептидов, но как показали исследования, их удельный вес составляет всего 8%. Для увеличения выхода целевого продукта проводят второй этап экстрагирования полипептидов из порошка. С этой целью полученный в результате экстракт отделяют от осадка центрифугированием, переливают его в емкость, а из осадка проводят вторую стадию экстрагирования. Осадок заливают водой для инъекций при t=18-22°С и перемешивают в течение 20 мин. Фильтрат, полученный в результате этой дополнительной операции, содержит около 37% нужных пептидов. Первичный и вторичный экстракты объединяют и подвергают их операциям очистки.
Объединенный экстракт очищают от высокомолекулярных белков с молекулярной массой более 15000 Да методом ультрафильтрации на мембранах. В очищенный раствор добавляют глицин (аминоуксусную кислоту) для стабилизации раствора и предотвращения гидролиза. Далее проводят операцию стерилизующей фильтрации путем пропускания раствора через мембрану с отверстиями не более 0,22 мм, чем достигается удаление микроорганизмов.
Очищенный раствор разливают по флаконам без крышек или с негерметично закрепленными крышками и замораживают до t=-45-55°С, снижая температуру постепенно в течение 24 часов от +20°С до -55°С. Далее следует операция сублимационной сушки (на современном оборудовании обе операции совмещены), и получается целевой продукт в виде порошка. Флаконы с порошком герметизируют.
Для сравнения известного и заявляемого способов предлагаем рассмотреть примеры производства целевого продукта указанными способами.
Известный способ (прототип).
Для производства одной серии продукта при известном способе для экстракции в одну стадию используется объем воды для инъекций V=30 литров, при закладке порошка 120 г/л необходимо 3,6 кг порошка. Экстракцию проводят при рН 5,5-6,5 и температуре Т=18-22°С в течение 1 часа. Экстракт отделяют от осадка центрифугированием. Проведя все последующие технологические операции (ультрафильтрацию, стерилизующую фильтрацию), в результате получают объем конечного раствора V=26 литров с содержанием основного вещества (комплекс биологически активных полипептидов) от 16 до 17 мг/мл. Далее проводят асептический розлив раствора и сублимационную сушку. Теоретический выход при дозе розлива на флакон 0,6 мл - 43000 флаконов с лиофильно высушенным порошком с номинальным содержанием основного вещества (около 10 мг/флакон).
Заявляемый способ.
Для производства одной серии продукта процесс экстракции осуществляют в две стадии. При этом распределяют общий объем воды для инъекций. Для первой стадии используется объем воды для инъекций V=23 литрам. При закладке порошка 120 г/л необходимо 2,76 кг порошка. Процесс экстракции проводят при Т=18-22°С в течение 30 минут. По окончании первой стадии экстракции проводят процесс центрифугирования, т.е. стандартную операцию отделения экстракта. Образовавшийся экстракт сливают в емкость для продукта, а из осадка проводят вторую стадию экстракции водой для инъекций V=7 литрам при Т=18-22°С в течение 20 минут. После центрифугирования полученный экстракт объединяют с экстрактом, образовавшимся на первой стадии. Проведя процессы ультрафильтрации и стерилизующей фильтрации, получают объем конечного раствора V=26 литров с содержанием основного вещества (комплекс биологически активных полипептидов) от 19 до 21 мг/мл (в прототипе от 16 до 17 мг/мл). Далее проводят асептический розлив и процесс сублимации. Теоретический выход при дозе розлива 0,5 мл составляет 52000 флаконов с лиофильно высушенным целевым продуктом с номинальным содержанием того же количества основного вещества (около 10 мг/флакон).
Анализируя результаты, можно отметить, что заявленным способом можно получить из меньшего количества порошка (израсходовано меньше на 0,840 кг) на 9000 флаконов с лиофильно высушенным целевым продуктом больше, чем известным способом. При этом положительным эффектом является тот факт, что для обеспечения номинальной концентрации биологически активных полипептидов во флаконе (около 10 мг), доза розлива целевого продукта, полученного заявленным способом, равна 0,5 мл во флакон против 0,6 мл во флакон продукта, полученного известным способом. Уменьшение дозы позволяет снизить время сушки и энергозатраты на удаление лишней влаги.
Целевой продукт представляет собой порошок в количестве 3000-3600 мг белого или белого с желтоватым оттенком цвета. Цвет 1%-ного раствора препарата не превышает эталон 56 (ГФХ1).
Далее проводят контроль параметров полученного продукта.
Тестирование на отсутствие высокомолекулярных белковых компонентов осуществляют путем добавления к 1%-ному раствору препарата 10%-ного раствора трихлоруксусной кислоты. Сохранение прозрачности раствора подтверждает отсутствие в нем высокомолекулярных белковых компонентов.
Для определения в препарате пептидных связей к 1 мл 1%-ного раствора препарата добавляют биуретовый реактив в количестве 4 мл. Окрашивание раствора в фиолетовый цвет свидетельствует об имеющихся в препарате полипептидных связях. Для приготовления биуретового реактива 0,75 г меди сульфата и 3,0 л натрия (калия) виннокислого растворяют в 250 мл воды. К полученному раствору добавляют 150 мл 10%-ного раствора NaOH и 1 г калия иодида. Затем объем раствора доводят водой до 1000 мл.
Для определения в препарате полипептидов и их фракций используют методы ультрафиолетовой спектрофотометрии, гельхроматографии, изоэлектрического фокусирования и их модификации.
Ультрафиолетовый спектр препарата в воде снимают в области длин волн от 250 до 350 нм. Содержимое 5 флаконов (в одном флаконе вместимостью 5 мл содержится 10 мг биологически активного вещества) растворяют в мерной колбе вместимостью 100 мл и доводят объем раствора до водной метки. На спектрофотометре снимают УФ-спектр раствора препарата в воде, который дает максимум поглощения при 275±6 нм.
Для характеристики компонентов препарата, полученного заявляемым способом, по заряду и изоэлектрическим точкам (pI) проводят исследование методом изоэлектрического фокусирования. Для этого препарат растворяют в 8 М мочевине, содержащей 3% NP-40 и 10% бета-меркаптоэтанола, и наносят в концентрации 50 мг/мл на пластину Ampholine PAG plate с диапазоном рН 3,5-9,5. Фракционирование препарата проводят на приборе "Multiphor" (LKB, Швеция) в течение 12 ч при напряжении 200 В и t=3°C. Далее гель окрашивают кумасси ярко-синим R-250 и денситометрируют при длине волны 600 нм. Исследование методом изоэлектрического фокусирования показывает, что в состав препарата, полученного заявляемым способом, входят полипептиды с pl от 3,5 до 9,5.
Молекулярную массу полипептидов, входящих в препарат, определяют методом гель-хроматографии на сефадексах G-25 и G-50 ("Pharmacia", Швеция). Для калибровки колонки используют Peptide Molecuar Weight Kit MS III ("Serva", Германия). Установлено, что препарат, полученный заявляемым способом, методом гель-хроматографии может быть разделен на 3 фракции, содержащие полипептиды с мол.м. от 500 до 15000 Дальтон.
Таким образом, проведенные испытания подтвердили качественные показатели целевого продукта, аналогичные показателям продукта, полученного по прототипу.
Полученный заявляемым способом целевой продукт был проверен на биологическую активность. Биологическую активность продукта оценивают по влиянию на рост нервных элементов или выселяющихся клеток в зоне роста в культуре ткани коры головного мозга куриных эмбрионов. Исследование проводят прижизненно с помощью светового микроскопа. Непосредственно перед испытанием содержимое 1 флакона препарата растворяют в 10 мл питательной среды. Для разведения препарата до концентрации 10 мкг/мл 1 мл полученного раствора переносят в стерильную мерную колбу вместимостью 100 мл и доводят объем раствора питательной средой до метки. 1 мл раствора с концентрацией целевого продукта 10 мкг/мл переносят в мерную колбу вместимостью 100 мл и доводят объем раствора питательной средой до метки. 20 мл раствора с концентрацией 100 нг/мл переносят в мерную колбу вместимостью 100 мл и доводят объем раствора питательной средой до метки. Таким образом, получают питательную среду для культивирования культуры ткани, содержащую целевой продукт в концентрации 20 нг/мл. В чашку Петри помещают стекла с коллагеновой подложкой с прикрепленными фрагментами коры головного мозга куриных эмбрионов, заливают приготовленной питательной средой с целевым продуктом в объеме, достаточном для полного покрытия стекол, и культивируют в термостате при температуре (36,7±1)°С в течение (48±2) часов. Параллельно проводят контрольный опыт, внося в чашку Петри с фрагментами культуры ткани питательную среду, не содержащую препарат, в том же объеме.
Для количественной оценки влияния продукта на рост ткани коры головного мозга применяют морфометрический метод.
Интенсивность роста ткани коры головного мозга оценивают по величине индекса площади (ИП), который рассчитывается как отношение площади всего фрагмента ткани коры головного мозга, включая периферическую зону роста, к исходной площади фрагмента ткани.
За условную единицу площади принимают квадрат окуляр-сетки микроскопа (сторона квадрата при увеличении 3,5×10 равна 150 мкм). Значение ИП выражают в процентах, принимая контрольное значение ИП за 100%.
Препарат считают биологически активным, если ИП ткани коры головного мозга после культивирования с добавлением целевого продукта в концентрации 20 нг/мл не менее чем на 20% больше ИП в контрольной группе, без целевого продукта (Таблица 1).
| Таблица 1 Определение биологической активности Препарат: Целевой продукт, полученный заявленным способом. | |||||
| Контрольные данные (без целевого продукта | Опытные данные (с целевым продуктом) | ||||
| Min (нач. площадь) | Мах (площадь после опыта) | Max/min | Min (нач. площадь.) | Мах (площадь после опыта) | max/min |
| 436 | 884 | 2,0 | 573 | 1829 | 3,2 |
| 566 | 1152 | 2,0 | 480 | 1189 | 2,5 |
| 637 | 1300 | 2,0 | 848 | 1892 | 2,2 |
| 792 | 1416 | 1,8 | 463 | 1383 | 3,0 |
| 975 | 1982 | 2,0 | 635 | 1422 | 2,2 |
| 495 | 150 | 2,3 | 886 | 2016 | 2,3 |
| 644 | 1189 | 1,8 | 432 | 1467 | 3,4 |
| 733 | 1666 | 2,3 | 774 | 1584 | 2,0 |
| 693 | 1312 | 1,9 | 412 | 1401 | 3,4 |
| 532 | 1236 | 2,3 | 308 | 917 | 3,0 |
| 636 | 1539 | 2,4 | 413 | 882 | 2,1 |
| Среднее значение 2,1 | Среднее значение 2,7 |
Результат: увеличение ИП на (2,7-2,1):2,1×100=29%
Для наглядного подтверждения роста нервных элементов в зоне роста культуры ткани прилагаются фотографические снимки.
Для более полной характеристики полученного целевого продукта по заявленному способу были проведены сравнительные испытания с продуктом, полученным по способу, описанному в прототипе. Сравнительные характеристики представлены в таблице 2.
Представленные в таблице 2 данные демонстрируют, что полученный заявленным способом целевой продукт имеет аналогичные качественные и количественные характеристики, а по некоторым параметрам заявленный продукт превосходит известный.
В процессе работы проводились экспериментальные исследования общей токсичности (острой, подострой и хронической) заявленного целевого продукта. Изучение возможного токсического действия препарата на организм было выполнено ФГУН «Институт токсикологии» в соответствии со следующими нормативными документами:
«Руководящие методические материалы по экспериментальному и клиническому изучению новых лекарственных средств», части 1, 3 (Официальное издание Фармакологического комитета, М., 1985);
«Правила доклинической оценки безопасности фармакологических средств (GLP)» (РД 64-126-91, М., 1992);
«Правила доклинической оценки исследований безопасности и эффективности фармакологических веществ» (М., Минздрав РФ, «Ремедиум», 2000, 7-17);
«Методические указания по изучению общетоксического действия фармакологических веществ»(там же, с.18-24).
Цель исследований состояла в определении переносимых токсических доз препарата, оценке степени и характера патологических изменений в различных органах и системах организма животных, а также зависимости токсических эффектов от дозы и длительности применения.
Для определения показателей острой токсичности целевой продукт растворяли в воде для инъекций и вводили белым мышам и крысам обоего пола внутримышечно (в/м) в возрастающих дозах по методу Литчфилда-Уилкоксона. Расчеты средних летальных доз проводили по методу В.Б.Прозоровского (Фармакология и токсикология, 1978, №4, с.497-502). Для достижения больших доз препарата введение осуществляли повторно с интервалом 20-30 минут в течение 4 часов. Контрольные животные получали аналогичные по объемам введения растворителя - воды для инъекций.
Период наблюдения составлял 14 дней. Регистрируемые показатели: летальность, время гибели, симптоматика отравления, ежедневное наблюдение общего состояния и поведения, взвешивание до введения, на 7 и 14 дни наблюдения, объемы потребления корма и воды (для этого животные помещались в обменные клетки итальянской фирмы «Texnoplast»), вскрытие и макроскопическое исследование всех погибавших и выживших животных в конце исследования (эвтаназия грызунов осуществлялась передозировкой эфира), определение массовых коэффициентов внутренних органов.
| Таблица 3 Токсичность целевого продукта при в/м введении мышам-самцам | |||||||
| Доза, мг/кг | 500 | 632 | 796 | 1000 | 1226 | 1588 | 2000 |
| Эффект: пало/всего | 0/5 | 0/5 | 1/5 | 2/5 | 3/5 | 4/5 | 5/5 |
ЛД50=1064±100 мг/кг
| Таблица 4 Токсичность целевого продукта при в/м введении мышам-самкам | |||||||
| Доза, мг/кг | 200 | 500 | 632 | 796 | 1226 | 1588 | 2000 |
| Эффект: пало/всего | 0/5 | 0/5 | 0/5 | 1/5 | 3/5 | 4/5 | 5/5 |
ЛД50=1190±75 мг/кг
Проведенные экспериментальные исследования показали, что целевой продукт при остром введении экспериментальным животным практически не оказывает токсического действия.
Результаты токсикометрии, данные некропсии и наблюдений за экспериментальными животными в постинтоксикационном периоде острого отравления позволяют отнести препарат к IV классу малотоксичных лекарственных веществ. Состояние переживших острую интоксикацию животных свидетельствует о хорошей переносимости и безвредности целевого продукта в дозах, превышающих терапевтические в тысячи раз. Терапевтический индекс препарата составляет порядка 3000 (разовая доза для человека 0,15 мг/кг, а ЛД50 для мышей при в/м введении - порядка 1000 мг/кг).
Учитывая малую токсичность, показанную в эксперименте при определении острой токсичности, рекомендации нормативных документов Фармакологического комитета и правил GLP для оценки хронической токсичности был выбран период 3 месяца.
В опытах на грызунах (крысы обоего пола) целевой продукт вводился в/м ежедневно на протяжении 90 дней в 3 дозах: в 10 раз большей терапевтической для человека - 1,5 мг/кг; максимальной 150 мг/кг (в 1000 раз большей терапевтической для человека, не вызывает гибели у крыс при однократном введении) и промежуточной - 15 мг/кг.
Исследования проводились в соответствии с экспериментальной программой:
Животные - крысы самки, крысы самцы.
Путь введения - внутримышечный.
Дозы: 1 доза - 1,5 мг/кг; 2 доза - 15 мг/кг; 3 доза - 150 мг/кг.
Частота введения - в течение 90 дней.
Растворитель - вода для инъекций.
Число животных - 1 доза - 20 самцов, 20 самок;
2 доза - 20 самцов, 20 самок;
3 доза - 20 самцов, 20 самок.
Общее количество - 160, из них 40 - контрольная группа.
В процессе эксперимента проводили оценку следующих показателей: общее состояние, взвешивание, потребление воды, гематологические, биохимические исследования, физиологические исследования, макроскопическое исследование и взвешивание внутренних органов, гистологические исследования.
По итогам исследования было установлено, что целевой продукт у крыс обоих полов в/м один раз в сутки в течение 90 дней в дозах 1,5; 15; 150 мг/кг не влияет на внешний вид, общее состояние и поведение животных, не оказывает негативного влияния на биохимические параметры крови и основные физиологические функции организма, не вызывает патоморфологических изменений, что свидетельствует о хорошей переносимости и безвредности препарата.
Таким образом, целевой продукт, полученный предлагаемым способом, соответствует всем параметрам фармацевтического препарата, полученного способом, предложенным в прототипе. Однако предлагаемый способ обеспечивает более высокий процент выхода готового целевого продукта. А предложенный режим замораживания и ограничение по возрасту животных, мозг которых используется в качестве сырья, исключает наличие в нем вирусов тяжелых заболеваний, а также способствует более эффективному уничтожению вредных микробов и микроорганизмов, что обеспечивает повышение качества сырья и, в конечном итоге, качества получаемой продукции.
Фармацевтическое средство, выполненное на основе заявляемого способа, содержит в качестве активного начала целевой продукт, полученный предложенным способом, и фармацевтически приемлемый компонент. Заявленное фармацевтическое средство представляет собой комплекс биологически активных полипептидов с мол.м. 500-15000 Дальтон, изоэлектрической точкой 3,5-9,5 и максимумом поглощения в УФ спектре при длине волны 275±6 нм.
Для подтверждения биологической активности заявленного фармацевтического средства и его способности нормализации функций головного мозга были проведены исследования по изучению фармакологической активности на разных моделях.
Модель 1. Острая черепно-мозговая травма (ОЧМТ).
Для моделирования черепно-мозговой травмы использовалась специальная установка, состоящая из металлической трубки длиной 0,5 м, диаметром 2 см и стального шарика весом 0,03 кг. Для фиксации головы крысы помещались в стандартные домики из плексигласа, в передней части которых находилось отверстие, соответствующее диаметру трубки. Травма наносилась при падении шарика на теменную область черепа животных. После нанесения травмы у крыс наблюдались мышечная релаксация, кратковременная потеря сознания, сопорозное состояние и кратковременные судороги. В течение 30-40 минут у крыс сохранялась атаксия, а рефлекторные реакции были нарушены в течение 1,5-3 часов.
Целевой продукт, полученный заявленным способом, начинали вводить в/м со следующего дня после острой травмы в дозах 1,5 мг/кг 1 раз в день на протяжении 7 дней.
Об эффективности лечения судили по клинической картине, динамике массы тела, относительной массы головного мозга (таблица 5), функциональному состоянию центральной нервной системы (таблица 6), показателям тканевого дыхания, активности метаболических процессов в головном мозге и гистологической картине мозга.
| Таблица 5 Масса тела и относительная масса мозга экспериментальных животных после острой травмы и лечения целевым продуктом | |||
| Показатели | Экспериментальные группы | ||
| Интактные (здоровые) | Без лечения (через 7 суток) | Лечение целевым продуктом (через 7 суток) | |
| Масса тела, г | 185±10 | 170±5 | 182±8 |
| Относит. масса мозга, мг/100 г массы тела | 9,7±0,3 | 14±1,2 | 10,3±1,1 |
В таблице 6 показано состояние при ОЧМТ функций центральной нервной системы (нарушения процессов обучения, памяти, возбуждения и торможения) без лечения и после применения целевого продукта.
| Таблица 6 Показатели функционального состояния центральной нервной системы (СПП, УРПИ, тест открытого поля) экспериментальных животных при ОЧМТ и лечении целевым продуктом | |||
| Показатели | Экспериментальные группы | ||
| Интактные (здоровые) | Без лечения (через 7 суток) | Лечение целевым продуктом (через 7 суток) | |
| СПП, В | 9,1±1,7 | 15,5±1,5 | 10,3±0,5 |
| УРПИ | |||
| Латентный период реакции перехода, сек | 71±4 | 128±9 | 72±5 |
| Время пребывания в светлой камере, сек | 82±4 | 42±6 | 76±6 |
| Время пребывания в темной камере, сек | 3,4±0,5 | 19,9±1,3 | 3,9±0,4 |
| Число обученных животных (% ко всей группе) | 10 (100) | 2 (20) | 10 (100) |
| Открытое поле, регистрация в течение 5 минут | |||
| Горизонтальная активность | 33±3 | 8±1 | 28±2 |
| Вертикальная активность | 14±2 | 4±1 | 11±1 |
| Норковый рефлекс | 13±3 | 3±1 | 15±1 |
| Болюсы | 7±1 | 3±1 | 4±1 |
| Интегральная активность | 60±4 | 16±2 | 54±2 |
| Примечания: СПП - суммационно-подпороговый показатель; УРПИ - условный рефлекс пассивного избегания. |
Из данных таблицы 6 видно, что применение целевого продукта, полученного заявленным способом, способствовало нормализации функций центральной нервной системы.
Данные таблицы 7 показывают, что в результате ОЧМТ тонус мышц увеличивался, а величина реакции на механическое раздражение заметно снижалась, что свидетельствует о нарушениях сопряжения рефлекторных процессов в центральной и периферической нервных системах. Применение целевого продукта способствует нормализации периферической нервной системы и мышц.
| Таблица 7 Величина физической выносливости крыс по продолжительности висения (мин) в тесте статической силовой нагрузки собственным весом | |||
| Показатели | Экспериментальные группы | ||
| Интактные (здоровые) | Без лечения (через 7 суток) | Лечение целевым продуктом (через 7 суток) | |
| Время висения, мин | 22,3±1,7 | 6,5±0,5 | 20,3±1,2 |
Вывод: Представленные результаты свидетельствуют о высокой эффективности фармацевтического средства, полученного заявленным способом, при лечении последствий острой черепно-мозговой травмы. Это позволяет рекомендовать его к применению в острый и подострый периоды травматической энцефалопатии.
Модель 2. Нарушение мозгового кровообращения.
Для проведения экспериментальных работ были использованы крысы линии Вистар, самцы в возрасте 3-4 месяца, массой от 185 до 275 г.
Для проведения исследований было сформировано 2 группы, экспериментальная группа включала 10 животных, в контрольной группе 12 животных.
В течение 5 дней до начала эксперимента животным контрольной группы вводили 0,9% физиологический раствор внутримышечно, животным экспериментальной группы вводили внутримышечно целевой продукт 1,5 мг/кг.
Одновременно производился контроль: масса тела крыс до начала приема препарата и после 5-дневного периода (таблица 8), артериальное давление в бедренной артерии наркотизированных уретаном крыс и частота сердечных сокращений в начале эксперимента (таблица 9).
Динамика массы тела экспериментальных животных представлена в таблице 8.
| Таблица 8 Изменение массы тела у крыс линии Вистар в процессе применения целевого продукта | |||
| Группа животных | Срок | Среднее значение | Доверительный интервал |
| Контрольная | До | 212 | 25 |
| Через 5 дней | 212 | 33 | |
| Экспериментальная (получавшая целевой продукт) | До | 218 | 17 |
| Через 5 дней | 238 | 17 |
Достоверных изменений массы тела при применении целевого продукта не отмечено.
Системное артериальное давление (АД) измерялось прямым инвазивным методом в бедренной артерии наркотизированных уретаном (125 мг/100 г массы тела) крыс посредством электроманометра, АД регистрировалось на ленте самописца.
Частота сердечных сокращений (ЧСС), уд/минут рассчитывалась по кривой артериального давления для каждой крысы, затем эти данные обрабатывались статистически для каждой группы животных (таблица 9).
| Таблица 9 Артериальное давление и частота сердечных сокращений у наркотизированных уретаном крыс, получавших целевой продукт в течение 5 дней перед экспериментом | |||
| Группа животных | Показатели | Среднее значение | Доверительный интервал |
| Контрольная | АД, мм рт.ст. | 73 | 6 |
| ЧСС, уд./мин | 414 | 58 | |
| Экспериментальная | АД, мм рт.ст. | 75 | 12 |
| ЧСС, уд./мин | 387 | 67 |
Из данных таблицы 9 видно, что достоверных различий между контрольной и группой, получавшей целевой продукт, по артериальному давлению нет. Частота сердечных сокращений находилась в пределах нормы.
На следующий день после окончания курса терапии животное взвешивали, наркотизировали внутрибрюшинным введением уретана в дозе 125 мг/100 г массы тела и проводили хирургическую операцию: трахеотомию, выделение и катетеризацию бедренной артерии для прямой регистрации артериального давления (АД), трепанацию теменной части области черепа с последующим удалением твердой мозговой оболочки. Животное фиксировали на специально сконструированном станке и помещали под модифицированный микроскоп, позволяющий сканировать значительную поверхность мозга. Пережатие артерии (окклюзия) проводилось на прямолинейном участке артерии. Эффективность пережатия артерии контролировали визуально. Наблюдению подверглись прямолинейные участки артерий дистальнее места окклюзии перед окклюзией, через 30 и 60 с после восстановления кровотока в данном участке.
Для оценки изменения степени участия миогенного механизма регуляции в поддержании сосудистого тонуса под влиянием целевого продукта важно оценить вклад вазолидации артерий в общую картину постокклюзионных реакций сосудов мягкой оболочки головного мозга. Для решения вопроса о способности сосудов к ауторегуляции кровотока при прекращении (кратковременном пережатии артерии) и последующем восстановлении кровотока следовало оценить динамику изменения просвета артерий, поэтому наблюдения проводились в течение 1 минуты и показатели снимались на 30-ю и 60-ю секунды после прекращения окклюзии. Данные эксперимента представлены в таблице 10.
В контрольной группе доля расширенных артерий и степень их расширения во всех генерациях примерно одинаковы и через 30 с и через 60 с после окклюзии.
На фоне введения целевого продукта наблюдалась другая картина. Через 30 секунд после окклюзии степень расширения артерий всех четырех генераций была достоверно в 2,5 раза больше по сравнению с контролем. Доля таковых артерий была достоверно в 1,5 раза больше по сравнению с контролем. Через 60 секунд после окклюзии степень расширения артерий всех генераций практически не изменилась (достоверно выше в 2,5 раза, чем в контроле). Доля расширенных артерий немного уменьшилась (достоверно в 1,5 раза по сравнению со сроком наблюдения 30 секунд), однако оставалась выше в 1,5-2 раза по сравнению с таковым показателем в контрольной группе.
По итогам проведенных исследований можно сделать следующее заключение: целевой продукт, полученный заявленным способом, обеспечивает стойкое достоверное расширение сосудов всех генераций, не подавляет миогенный тонус артерий. Фармацевтическое средство на основе заявленного способа в равной степени положительно влияет на тонус магистральных и периферических мозговых артерий. На основании этого можно заключить, что указанное средство улучшает кровоток магистральных и периферических сосудов и может применяться в качестве лекарственного средства для профилактики и терапии нарушений мозгового кровообращения.
Таким образом, фармацевтическое средство, выполненное на основе целевого продукта, полученного заявляемым способом, обеспечивает нормализацию функций головного мозга и может найти широкое применение в лечебной практике.
Источники информации
1. Патент РФ N 2082429, кл. А 61 К 38/16, 1992 г.
2. Патент РФ N 2074726, кл. А 61 К 35/30, 1993.
3. Заявка на изобретение РФ N 96107657, кл. А 61 К 35/30.
4. 3аявка на изобретение РФ N 96102207, кл. А 61 К 35/30.
5. Патент РФ N 2128511, кл. А 61 К 35/30, 1997 г.
6. Патент РФ №1298979, кл. А 61 К 35/30, 1984 г.
7. Патент РФ №2104702, кл. А 61 К 35/30, 1996 г.
1. Способ получения комплекса биологически активных полипептидов для нормализации функций головного мозга, включающий операции замораживания коры головного мозга животного, гомогенизации замороженной ткани, экстракции гомогената раствором уксусной кислоты, содержащей хлористый цинк в концентрации 1,2 г/л при массовом соотношении гомогената и раствора уксусной кислоты 1:5, обработки надосадочной жидкости ацетоном, промывки образовавшегося осадка ацетоном, высушивания осадка, экстракции полипептидов из высушенного осадка водой для инъекций с последующей очисткой, стерилизацией и лиофилизацией целевого продукта, отличающийся тем, что в качестве сырья используют кору головного мозга скота до 12-месячного возраста, операцию замораживания коры головного мозга осуществляют при температуре не выше -18°С не менее 2-х и не более 8-ми месяцев, а экстракцию полипептидов из высушенного осадка осуществляют водой для инъекций в два этапа, на первом этапе экстрагирование высушенного осадка проводят водой для инъекций при рН 5,5-6,5 и температуре 18-22° в течение 30 мин, полученный экстракт отделяют от осадка центрифугированием, после отделения экстракта из оставшегося осадка проводят повторное экстрагирование полипептидов в течение 20 мин при тех же условиях, первичный и вторичный экстракты объединяют и подвергают дальнейшей обработке.
2. Фармацевтическое средство для нормализации функций головного мозга, содержащее активное начало и фармацевтически приемлемый компонент, отличающееся тем, что в качестве активного начала содержит в эффективном количестве целевой продукт, полученный способом по п.1 и представляющий собой комплекс биологически активных полипептидов с мол.м. 500-15 000 Дальтон, изоэлектрической точкой 3,5-9,5, максимумом поглощения в УФ-спектре при длине волны 275±6 нм.
