Криоконсервант для лейкоцитов
Владельцы патента RU 2301524:
Институт физиологии Коми научного центра Уральского отделения Российской академии наук (RU)
ФГУ "Кировский НИИ гематологии и переливания крови" Росздрава" (RU)
Изобретение относится к области медицины и физиологии. Криоконсервант содержит в оптимальном соотношении лемнан, глицерин, оксиметилэтилпиридина сукцинат, воду для инъекций и гидроксид натрия (для доведения рН раствора до 7,0-7,4). Экспозиция лейкоконцентрата с криоконсервантом в течение 18 мин, охлаждение по экспоненциальной программе до -10°С. Изобретение обеспечивает при быстром отогреве сохранить 99,75±0,71% физиологически полноценных лейкоцитов нейтрофильных клеток. 3 табл.
Изобретение относится к медицине и физиологии и касается создания криоконсерванта для лейкоцитов.
В качестве прототипа нами выбран протекторный раствор для консервирования лейкоцитов при температуре -10°С (Патент на изобретение №2261595), который включает модежель, глицерин и оксиметилэтилпиридина сукцинат.
Существенным недостатком прототипа является то, что данный раствор не может быть реализован, т.к. модежель, входящий в него, перестал выпускаться промышленностью, кроме того, модежель не обладает стимулирующим действием на фагоциты, в частности, на нейтрофилы.
Техническим результатом настоящего изобретения является создание криоконсерванта для лейкоцитов, позволяющего сохранить лейкоциты в физиологически полноценном состоянии при температуре -10°С.
Технический результат достигается тем, что в предложенный криоконсервант для лейкоцитов включены следующие ингредиенты: растительный полисахарид - лемнан, обладающий как полисахарид (пектин) экзоцеллюлярным криопротекторным действием, что гармонично дополняет эндоцеллюлярное хладоограждающее влияние глицерина на клетки и делает комбинированный криоконсервант более полноценным, дающим при охлаждении лейкоцитов до -10°С выраженный криобиологический (технический) эффект и оказывающий стимулирующее влияние на фагоцитарную активность нейтрофилов: под действием лемнана увеличивается способность нейтрофилов поглощать частицы латекса на 20-50% (Ovodov Yu.S. et.al. // XIX Intern. Carbohydr. Symp. August 9-14, 1998, San Diego, 1998 - P.DPO 41; Попов С.В. Функциональные реакции нейтрофилов и макрофагов на растительные полисахариды: Автореф....дис. канд. биол. наук; Сыктывкар, 1999-19 с.), поэтому включение лемнана в криоконсервант, не требующий отмывания после выхода нейтрофильных клеток из криогипобиоза, усиливает и активизирует их фагоцитарную способность и способствует 100% их морфологической сохранности; глицерин высшего сорта - криопротектор эндоцеллюлярного действия (Пушкарь Н.С., Шраго М.И., Белоус А.М., Калугин Ю.В. Криопротекторы: Киев: Наукова думка, 1978. - с.5-64) и производное янтарной кислоты оксиметилэтилпиридина сукцинат (кратко ОМЭПС), обладающий антиоксидантным и мембраностабилизирующим действием, восстанавливает нарушенные функции мембран клеток, тормозит перекисное окисление липидов. Сукцинат участвует в энергетическом обмене клетки (Мецлер Д. Биохимия. Химические реакции в живой клетке. Т.2. - М.: Мир, 1980. - с.317-319 и с.321-322).
Криоконсервант имеет рН среды 7,0-7,4, самый благоприятный для клеток крови. Его ингредиенты тропны лейкоцитарным клеткам и производятся в Российской Федерации.
Пример использования средства
Консервант, содержащий лемнан в концентрации 0,3%, глицерин - 7%, оксиметилэтилпиридина сукцинат - 0,3%, воду для инъекций до 100 мл и 4 М. раствор гидроксид натрия (1-2 кап.) до рН раствора 7,0-7,4, смешивают в отношении 1:1 с концентратом лейкоцитов в полимерном контейнере «Компопласт». Смесь, выдержав 18 мин при комнатной температуре, помещают на 24 часа в электрический морозильник (в 3-литровую ванну с этиловым 96° спиртом, охлажденным до -10°С). Размораживание проводят в 20-литровой водяной ванне при температуре +38°С в течение 2-3 секунд при интенсивном покачивании контейнера (3-4 раза в сек). Температура оттаянного лейкоконцентрата в контейнере должна быть в пределах +2÷+4°С. Затем определяют морфологическую сохранность размороженных лейкоцитарных клеток, их жизнеспособность по витальному красителю (с 1% раствором эозина) и фагоцитарную активность нейтрофилов в пробе с латексом (по Потаповой С.Г. и соавт., ж. Проблемы гематологии и переливания крови. - 1977. - N 9. - с.58-59). Расчет выражают в процентах в сравнении с аналогичными показателями клеток до замораживания.
Экспериментальные исследования выполнены на базе лабораторий криофизиологии крови Института физиологии Коми НЦ УрО РАН и консервирования крови и тканей ФГУ «Кировский НИИ гематологии и переливания крови Росздрава».
Изучены три варианта консерванта для лейкоконцентрата, различающихся по концентрации входящих в них ингредиентов. Состав вариантов представлен в таблице 1.
| Таблица 1 | ||||
| Характеристика состава различных вариантов криоконсерванта для сохранения лейкоцитов при температуре -10°С в расчете на 100 г сухого вещества (в г) | ||||
| Номер варианта криоконсерванта | Состав хладоограждающего раствора | |||
| Лемнан, в% | Глицерин, в% | ОМЭПС, в% | Вода для инъекций, в мл. | |
| 1 | 0,20 | 7,0 | 0,30 | До 100 |
| 2 | 0,30 | 7,0 | 0,30 | До 100 |
| 3 | 0,40 | 7,0 | 0,40 | До 100 |
Конечная концентрация веществ, входящих в состав вариантов криоконсерванта N1, N2 и N3, после смешивания 1:1 с лейкоконцентратом оказывалась в 2 раза ниже исходной (таблица 2), рН среды не изменялась, оставаясь в пределах 7,0-7,4.
| Таблица 2. | ||||
| Конечная концентрация ингредиентов в различных вариантах криоконсерванта после смешивания с лейкоцитным концентратом | ||||
| Номер варианта криоконсерванта | Конечная концентрация ингредиентов в различных вариантах криоконсерванта после смешивания с лейковзвесью | |||
| Лемнан, в% | Глицерин, в% | ОМЭПС, в% | Вода для инъекций, в мл. | |
| 1 | 0,10 | 0,35 | 0,15 | До 200 |
| 2 | 0,15 | 0,35 | 0,15 | До 200 |
| 3 | 0,20 | 0,35 | 0,20 | До 200 |
Исследования лейкоцитов производили на морфологическую сохранность и функциональную активность (табл.3).
| Таблица 3. | |||
| Результаты после замораживания до -10°С и оттаивания лейкоцитов с различными вариантами предложенного криоконсерванта | |||
| Вариант консервирующего раствора | Показатели, в % к исходному уровню. n=7 | ||
| Жизнеспособность лейкоцитов | Морфологическая сохранность гранулоцитов | Фагоцитарная активность нейтрофилов | |
| Верхний предел дозировок ингредиентов раствора | 83,50±12,15* | 95,50±5,75 | 98,75±2,99 |
| Оптимальное соотношение ингредиентов раствора | 97,58±1,73 | 100,00±0,00 | 99,75±0,71 |
| Нижний предел дозировок ингредиентов раствора | 81,62±15,96* | 78,86±10,54* | 86,14±5,61* |
| * - различие достоверное (р<0,05) |
Основным критерием оценки биологической полноценности лейкоцитов, прежде всего нейтрофилов, является определение их фагоцитарной активности. Этот тест, наиболее надежно характеризующий физиологические свойства клеток, был лучшим после охлаждения - отогрева при использовании криконсерванта с оптимальным соотношением ингредиентов.
Готовый оптимальный вариант криоконсерванта прозрачен, с желтоватым оттенком, без запаха, рН 7,0-7,4, хорошо смешивается во всех соотношениях с лейкоцитным концентратом, не вызывает конгломерацию клеток и обеспечивает функциональную и морфологическую сохранность при положительной температуре до замораживания. Криоконсервант проявляет выраженное хладоограждающее свойство при охлаждении лейкоцитов до -10°С.
Таким образом, разработанный криоконсервант при замораживании лейкоконцентрата до -10°С обеспечил сохранность высокого процента физиологически активных лейкоцитарных клеток. Он может быть применен в учреждениях медицинского и биологического профиля.
Криоконсервант для лейкоцитов, характеризующийся тем, что он содержит лемнан, глицерин, оксиметилэтилпиридина сукцинат и воду для инъекций при следующем соотношении ингредиентов, %:
| Лемнан | 0,2-0,4 |
| Глицерин | 7,0 |
| Оксиметилэтилпиридина сукцинат | 0,3-0,4 |
| Вода для инъекций | До 100 мл |
| Гидроксид натрия 1 М раствор | До рН 7,0-7,4 |
