Раствор для консервирования лейкоцитов при околонулевой температуре

Изобретение относится к физиологии и медицине и касается создания раствора для консервирования лейкоцитов при околонулевой температуре и сохранения их в физиологически активном состоянии после отогрева. Раствор содержит в оптимальном соотношении гексаметиленбистетраоксиэтилмочевину, глюкозу, оксиметилэтилпиридина сукцинат, желатиноль, трехзамещенный цитрат натрия и воду для инъекций. Его рН составляет 7,0-7,4. Изобретение обеспечивает создание раствора для консервирования лейкоцитов при околонулевой температуре. Данный раствор обеспечивает сохранность высокого процента функционально активных лейкоцитарных клеток. 3 табл.

 

Изобретение относится к физиологии и медицине, а именно к созданию раствора для консервирования лейкоцитов, в частности человека.

Известен консервирующий раствор для лейкоцитной массы следующего состава: сахароза - 9,0 г, глюкоза - 0,4 г, аскорбиновая кислота - 0,2 г, этилендиаминтетраацетат Na₂ - 0,1 г, левомицетин - 0,002 г, желатины 10% раствор для внутривенного ведения - 35 мл, бидистиллированная вода до 100 мл (Материалы по вопросам службы крови. - М.: Медицина, 1970 - с.306).

Существенным недостатком раствора является то, что он предназначен для консервирования лейкоцитной массы при положительной температуре, что может вызвать развитие патогенной микрофлоры, а также содержит токсичный антикоагулянт этилендиаминтетраацетат Na₂, антибиотик левомицетин, который может вызвать аллергические реакции, и желатину, которая по причине большой молекулярной массы способна седиментировать эритроциты при внутривенном введении. Раствора для консервирования лейкоцитов при околонулевой температуре из известных источников информации нам обнаружить не удалось.

Техническим результатом настоящего изобретения является создание раствора для консервирования лейкоцитов при околонулевой температуре. Данный раствор обеспечивает сохранность высокого процента функционально активных лейкоцитарных клеток.

Технический результат достигается тем, что в раствор для консервирования включены: 1) гексаметиленбистетраоксиэтилмочевина, нетоксична и не требует отмывания перед внутривенным введением лейкоцитного концентрата; 2) реставрирующая добавка - оксиэтилметилпиридина сукцинат, обладающий антиоксидантным, мембраностабилизирующим действием, восстанавливающим функции мембран клеток и ингибирующим процессы перекисного окисления липидов; 3) желатиноль - гидролизат желатины, положительно влияющий на микроциркуляцию и дезагрегацию форменных элементов крови.

В раствор для консервирования лейкоцитов при околонулевой температуре включены следующие ингредиенты: протектор - гексаметиленбистетраоксиэтилмочевина (кратко ГМБТОЭМ); углеводный раствор для инфузии - раствор глюкозы, который наряду с энергетической и пластической функциями (Кровезаменители, консерванты крови и костного мозга. / Под. ред. Г.Н.Хлябича. - М.: Медицина, 1997. - с.96-99) обладает также слабым протекторным действием (Белоус А.М., Грищенко В.И. Криобиология. - Киев: Наукова думка, 1994. - с.88-90); вещество - оксиметилэтилпиридина сукцинат (кратко ОМЭПС), обладающее, кроме антиоксидантного, мембраностабилизирующим действием, восстанавливающее нарушенные структуры и функции мембран клеток, а также тормозящее процессы перекисного окисления липидов. Сукцинат - производное янтарной кислоты (Несмеянов А.Н., Несмеянов Н.А. Начало органической химии. Книга 1. - М.: Химия, 1974. - с.314-315, с.436-437) участвует в энергетическом обмене клетки, обеспечивающем ее жизнедеятельность, а пиридин в нуклеиновом обмене (Герман А.С. Пиридин. Большая медицинская энциклопедия. - М.; 1981. - Т.17. - с.1054-1055). Также в состав раствора введен кровезаменитель «желатиноль» - 8% раствор гидролизованной пищевой желатины в 0,9% растворе натрия хлорида (Кровезаменители, консерванты крови и костного мозга. / Под. ред. Г.Н.Хлябича. - М.: Медицина, 1997. - с.49-51). «Желатиноль» имеет существенно меньшую молекулярную массу (20000±5000 Д), чем желатина (от 30 до 100 кД), является нетоксичным, не вызывает седиментации эритроцитов при внутривенном введении, обладает слабым антигенным свойством, не нарушает функции печени. В качестве антикоагулянта использован 0,2% раствор трехзамещенного цитрата натрия. Консервирующий раствор имеет рН среды 7,0-7,4, самый благоприятный для клеток крови. Ингредиенты в данном растворе тропны лейкоцитарным клеткам и производятся в России.

Пример использования средства

Консервирующий раствор, содержащий ГМБТОЭМ в концентрации 20%, оксиметилэтилпиридина сукцинат 0,2%, желатиноль - 16%, глюкозу - 0,7%, трехзамещенный цитрат натрия 0,2%, воду для инъекций до 100 мл и имеющий рН 7,0-7,4, смешивают в отношении 1:1 с концентратом лейкоцитов. Смесь, выдержав 20 мин при комнатной температуре, разливали в пластиковые пробирки на 1,5 мл и переносили для охлаждения и дальнейшего хранения в электрический морозильник с температурой 0+2°С. Отогревали образцы при комнатной температуре (+21°С) при покачивании контейнера 1-2 раза/сек, в течение 5 мин. Определяли морфологическую сохранность лейкоцитарных клеток, их жизнеспособность по витальному красителю (с 1% раствором эозина) и фагоцитарную активность нейтрофилов в пробе с латексом (по Потаповой С.Г. и соавт., Проблемы гематологии и переливания крови. - 1977. - N9. - с.58-59). Расчет выражали в процентах в сравнении с аналогичными показателями клеток до охлаждения.

Экспериментальные исследования выполнены на базе лабораторий криофизиологии крови Института физиологии Коми НЦ УрО РАН и консервирования крови и тканей ФГУ «Кировский НИИ гематологии и переливания крови Росздрава».

Изучены три варианта консервирующего раствора для лейкоконцентрата, различающихся по концентрации входящих в них ингредиентов. Состав вариантов раствора представлен в таблице 1.

Таблица 1 Характеристика состава различных вариантов раствора для консервирования лейкоцитов при околонулевой температуре, в расчете на 100 г сухого вещества (в г).
Номер варианта консервирующего раствора	Состав консервирующего раствора
ГМБТОЭМ в %	ОМЭПС в %	Глюкоза в %	Желатиноль в %	Трехзамещенный цитрат натрия в %	Вода для инъекций, в мл
1	14,00	0,15	0,70	16,00	0,2	До 100
2	20,00	0,20	0,70	16,00	0,2	До 100
3	26,00	0,70	0,70	16,00	0,2	До 100

Конечная концентрация веществ, входящих в состав растворов N1, N2 и N3 после смешивания 1:1 с лейкоконцентратом, оказывалась в 2 раза ниже исходной (таблица 2), рН среды не изменялась, оставаясь в пределах 7,0-7,4.

Таблица 2 Конечная концентрация ингредиентов в различных вариантах консервирующего раствора после смешивания с лейкоцитным концентратом.
Номер варианта консервирующего раствора	Конечная концентрация ингредиентов в различных вариантах консервирующего раствора после смешивания с лейковзвесью
ГМБТОЭМ в %	ОМЭПС в %	Глюкоза в %	Желатиноль в %	Трехзамещенный цитрат натрия в %	Вода для инъекций в мл
1	7,00	0,075	0,35	8,00	0,1	До 200
2	10,00	0,100	0,35	8,00	0,1	До 200
3	13,00	0,350	0,35	8,00	0,1	До 200

Охлаждение и хранение в течение 6 суток производили в пластиковых пробирках в электроморозильнике при температуре 0+2°С. Отогревали образцы при комнатной температуре (+21°С) при покачивании контейнера 1-2 раза в сек в течение 5 мин. Исследования лейкоцитов выполняли на морфологическую сохранность, жизнеспособность и функциональную активность (табл.3).

Таблица 3 Результаты после охлаждения до 0+2°С, хранения при данной температуре в течение 6 суток и отогрева лейкоцитов с различными вариантами предложенного консервирующего раствора
Вариант консервирующего раствора	Показатели, в % к исходному уровню. n=5
Жизнеспособность лейкоцитов	Морфологическая сохранность гранулоцитов	Фагоцитарная активность нейтрофилов
Нижний предел дозировок ингредиентов раствора	84,8±3,6	51,5±6,6*	32,5±6,2*
Оптимальное соотношение ингредиентов раствора	86,2±7,8	61,9±2,1	56,7±8,6
Верхний предел дозировок ингредиентов раствора	66,4±8,2*	36,4±9,3*	37,0±1,4*
* - различие достоверное (p<0,05)

Основным критерием оценки биологической полноценности лейкоцитов, прежде всего нейтрофилов, является определение их фагоцитарной активности. Этот тест, наиболее надежно характеризующий физиологические свойства клеток, был лучшим после охлаждения - хранения - отогрева биообъекта при использовании раствора с оптимальным соотношением ингредиентов и достоверно отличался от данных, полученных при использовании консервирующего раствора с верхним и нижним пределами дозировок ингредиентов.

Готовый оптимальный раствор прозрачен, с легким желтоватым оттенком, без запаха, pH 7,0-7,4, хорошо смешивается во всех соотношениях с лейкоцитным концентратом, не вызывает конгломерацию клеток и обеспечивает функциональную и морфологическую сохранность при положительной температуре до охлаждения. Раствор обладает ограждающим действием при охлаждении лейкоцитов до 0+2°С.

Таким образом, предложенный консервирующий раствор позволяет сохранять высокий процент физиологически активных лейкоцитарных клеток при температуре 0+2°С в течение 6 дней. Данный раствор может быть применен в учреждениях медицинского и биологического профиля для сохранности биообъектов в условиях бытового холодильника.

Раствор для консервирования лейкоцитов при околонулевой температуре, характеризующийся тем, что он содержит гексаметиленбистетраоксиэтилмочевину, глюкозу, оксиметилэтилпиридина сукцинат, желатиноль, трехзамещенный цитрат натрия и воду для инъекций при следующем соотношении ингредиентов, %:

Гексаметиленбистетраоксиэтилмочевина	26,0-14,0
Глюкоза	0,7
Оксиметилэтилпиридина сукцинат	0,7-0,15
Желатиноль	16,0
Трехзамещенный цитрат натрия	0,2
Вода для инъекций	до 100 мл
При этом рН раствора	7.0-7,4