Способ определения мутаций гена mtrnr1 при острой нейросенсорной тугоухости, вызванной применением антибиотиков из группы аминогликозидов

Изобретение относится к медицине, а именно к медицинской генетике и оториноларингологии. Предложен новый способ определения мутаций гена MTRNR1, позволяющий сократить время исследования до 2-х суток. Изобретение может быть использовано для диагностики острых форм тугоухости. 2 ил., 1 табл.

 

Изобретение относится к медицине, а именно к медицинской генетике и оториноларингологии, может быть использовано для диагностики острых форм тугоухости на фоне применения антибиотиков из группы аминогликозидов у человека.

Антибиотики группы аминогликозидов широко применяются в медицинской практике как бактерицидные препараты при различных тяжелых, в том числе анаэробных, инфекциях. Применение ототоксических антибиотиков, таких как канамицин, гентамицин, неомицин и др. приводит к возникновению острой нейросенсорной тугоухости у 12% пациентов. Преобладает, как правило, тяжелая степень нейросенсорной тугоухости (III степень потери слуха наблюдается в 44% случаев, IV - в 35%).

Острая нейросенсорная тугоухость относится к числу наиболее распространенных и тяжелых заболеваний, как среди детей, так и среди взрослых. Высокая распространенность и неуклонный рост в последние десятилетия данной патологии, а также высокая степень инвалидизации больных с внезапными формами потери слуха определяют важное социально-экономическое и медицинское значение этой проблемы, необходимость исследования механизмов развития данного заболевания с целью разработки эффективных методов диагностики, профилактики и патогенетической терапии с учетом этнической принадлежности и генетической предрасположенности каждого больного. Несмотря на острую социальную значимость проблемы, до сих пор не разработаны способы ранней диагностики и система профилактических мероприятий острой нейросенсорной тугоухости на фоне лечения антибиотиками из группы аминогликозидов.

Острая нейросенсорная тугоухость, развивающаяся на фоне приема аминогликозидов, относится к тем заболеваниям, в которых анамнестические и клинические данные представляют довольно скудный материал для постановки правильного диагноза с определением этиологии заболевания. Вместе с тем, своевременная и точная диагностика этого наследственного дефекта позволит избежать потери слуха у пациента при своевременной отмене терапии аминогликозидами, а при возникновении ототоксического эффекта от лечения позволит наиболее качественно и в самые ранние сроки начинать реабилитационные мероприятия для обеспечения полноценной социальной адаптации лиц с повреждением процесса звуковосприятия.

Преимущества предлагаемой разработки перед существующими аналогами заключаются в оптимальности разрабатываемых подходов ДНК-диагностики заболеваний, основанных на выявлении существующего своеобразия генофонда народов Волго-Уральского региона. Ряд генов митохондриального генома принимает участие в функционировании процесса звуковосприятия у человека. Это гены MTRNR1, tRNALeu, tRNALys, MTTS1, tRNAGlu, отвечающие за различные рРНК и тРНК (del Castillo et al., 2002; Campos et al., 2002). Ототоксичность антибиотиков аминогликозидового ряда для человека обусловлена рядом изменений митохондриального генома. Мутация A1555G гена МТRNR1 была впервые идентифицирована Prezant et al. в 1993 году в многочисленной арабской семье с наследственной несиндромальной глухотой, возникающей после применения антибиотиков из группы аминогликозидов. Частота данной мутации среди больных несиндромальной сенсоневральной глухотой в состоянии гомоплазмии составляет, в среднем, 0,05, тогда как в популяциях Китая и Японии в состоянии гетероплазмии A1555G наблюдается у 1 из 200 слышащих индивидов (Hutchin et al., 1993). Также мутация A1555G достаточно часто встречается во многих европейских и азиатских популяциях. Bacino с соавторами в 1995 году обнаружили мутацию del961T(ins)_n гена MTRNR1 в 35 китайских семьях с глухотой, возникающей после приема антибиотиков-аминогликозидов. По литературным данным, частота данной мутации от 10 до 50% у больных с острой нейросенсорной тугоухостью, возникающей на фоне антибиотикотерапии. Также в некоторых этнических группах (китайцы, японцы, монголы, индонезийцы) у больных острой нейросенсорной тугоухостью на фоне антибиотикотерапии аминогликозидами идентифицируется мутации С1494Т и Т1095С гена MTRNR1, встречающиеся с частотой около 1%.

Известен способ детекции мутации A1555G гена MTRNR1 посредством рестрикционного анализа с помощью рестриктазы HaeIII (Prezant Т. R., Agapian J. V., Bohlman M. С.et al. Mitochondrial ribosomal RNA mutation associated with both antibiotic-induced and non-syndromic deafness. 1993. Nature Genet. V.4. P.289-294). Однако данный метод позволяет выявить только мутацию A1555G, а мутации del961T(ins)_n, C1494T и Т1095С остаются за пределами амплифицируемого участка, оставаясь недосягаемыми для детекции.

Прототипом изобретения является работа Orita M. с соавторами, предложенная в 1989 году (Orita M., Iwahana H., Kanazawa H., Sekya Т. Detection of polymorphism of human DNA by gel electrophoresis as single cell conformation polymorphism. // Protocols Natl. Acad. Sci. - 1989. - V.86. - P.2766-2770). Разработанный Orita M. с соавторами метод выявления однонуклеотидных замен и делеций позволяет идентифицировать различные мутации в ДНК. Время исследования составляет 4 дня.

Техническим результатом изобретения является сокращение времени исследования до 2-х суток.

Указанный технический результат достигается тем, что в способе, включающем выделение ДНК из лимфоцитов периферической крови, проведение полимеразной цепной реакции, идентификацию мутаций A1555G, del961T(insC_n), C1494T, Т1095С, амплификацию проводят с помощью специфических олигонуклеотидов:

A1555G (F) 5' gctcagcctatataccgccatcttcagcaa 3'

A1555G (R) 5' tttccagtacacttaccatgttacgactgg 3'

del961T(F) 5' ccaccgcggtcacacgattaa 3'

del961T(R) 5' ttctggcgagcagttttgttga 3', после чего для идентификации данных мутаций проводят анализ конформации одноцепочечных фрагментов (SSCP-анализ).

Способ осуществляется следующим образом.

ДНК выделяют из лимфоцитов периферической крови. В качестве консерванта используют раствор следующего состава: 0,48% лимонной кислоты, 1,32% цитрата натрия, 1,47% глюкозы. При заборе крови к 1 мл консерванта добавляют 4 мл венозной крови и хорошо перемешивают.

Для получения ДНК необходимой степени чистоты и достаточного молекулярного веса используют метод выделения ДНК из крови фенольно-хлороформной экстракцией, описанный Метью (Mathew C.C. The isolation of high molecular weight eucariotic DNA. // Methods in Molecular Biology /Ed. Walker J.M.Y.L.: Human Press. 1984. - V.2. - P.31-34).

1. Кровь в пробирке с консервантом тщательно перемешивают и переливают в центрифужный стакан объемом 50 мл, туда же добавляют 30 мл охлажденного лизирующего буфера, содержащего 320 мМ сахарозы, 1% раствор тритона Х-100, 5 мМ MgCl₂, 10 мМ трис HCl (рН 7,6).

2. Смесь центрифугируют 20 мин при 4000 об/мин.

3. Надосадочную жидкость сливают, к получившемуся осадку приливают 0,4 мл 10% SDS и протеиназу К (концентрация 10 мг/мл). Смесь для лизиса оставляют на 16 часов в термостате при температуре 37°С. Экстракцию ДНК осуществляют в следующем порядке:

4. К лизату добавляют 0,5 мл фенола, насыщенного 1М трисHCl до рН 7,8.

5. Смесь встряхивают на шейкере и центрифугируют 10 мин при 6000 об/мин.

6. Отбирают водную фазу, содержащую ДНК и неденатурированные белки.

7. Отобранную фазу обрабатывают смесью фенол-хлороформа (1:1), а затем хлороформом.

8. Препараты осаждают двумя объемами охлажденного этанола 96%.

9. Образовавшийся осадок ДНК растворяют в 1,5 мл деионизированной Н₂О; раствор хранят при -20°С.

В дальнейшем полученную ДНК используют в качестве матрицы для полимеразной цепной реакции (ПЦР) для амплификации нужного фрагмента кодирующего региона гена MTRNR1. Специфические последовательности олигонуклеотидных праймеров для детекции мутаций del961T(ins)_n и Т1095С гена MTRNR1 и их оптимальные концентрации в реакционной смеси подобраны с помощью пакета биологических программ DNASTAR (Primer select 5.05 1993-2002). Последовательности олигонуклеотидных праймеров, используемые для рестрикционного анализа мутации A1555G, предложенные Prezant Т. R. с соавторами (1993), также могут быть использованы для детекции мутаций С1494Т и A1555G гена MTRNR1 посредством SSCP анализа. Используют следующие последовательности олигонуклеотидов:

A1555G (F) 5' gctcagcctatataccgccatcttcagcaa 3'

A1555G (R) 5' tttccagtacacttaccatgttacgactgg 3'

del961T(F) 5' ccaccgcggtcacacgattaa 3'

del961T(R) 5' ttctggcgagcagttttgttga 3'.

Состав реакционной смеси: 0,8 мкг геномной ДНК, соответствующее кол-во каждого олигонуклеотида (Таблица), 125 мкМ каждого дезоксинуклеозидтрифосфата (Promega, USA) помещают в 12,5 мкл однократного буфера для ПЦР следующего состава: 67 mM Tris-HCl, pH 8.8, 6.7 mM MgCl₂, 16,6 mM (NH₄)₂SO₄, 0.01% Tween-20. К полученной смеси прибавляют 5 единиц термофильной ДНК-полимеразы, 20-30 мкл стерильного минерального масла. Режим амплификации: предварительная денатурация 4 минуты при 94°С, затем 30 циклов со следующими параметрами - 94°С - 45 секунд, 58°С - 45 секунд, 72°С - 1 минута. После 30-го цикла проводят инкубацию при 72°С в течение 7 минут. После проведения ПЦР 10 мкл амплификата смешивают с 3,3 мкл 0,5М NaOH и 0,3 мкл 0,5М ЭДТА и нагревают в течение 15 минут при 43°С. После этого к амплификатам добавляют 3 мкл формамида, смешанного с 0,5% раствором бромфенолового синего и 0,5% раствором ксиленцианола, и наносят на 10% полиакриламидный гель (исходное соотношение акриламида и метиленбисакриламида 29:1, 49:1) с 5% глицерином (Savov et al., 1992; Spinardi et al., 1991).

В качестве электрофорезного буфера используют 0,5хТВЕ. Электрофорез в геле длиной 23 см, толщиной 1 мм проходит при температуре +4°С (в холодильной камере) при напряжении 100 В в течение 48 часов. Затем фрагменты ДНК в геле фиксируют в 10% растворе уксусной кислоты в течение 30 минут при непрерывном покачивании на шейкере. После этого гель промывают три раза дистиллированной водой в течение двух минут, инкубируют в 0,1% водном растворе AgNO₃, содержащем 0,15% формалин и 0,02% тиосульфата натрия. После проявления гель заливают 10% раствором уксусной кислоты для остановки окраски. Время исследования составляет 2 дня. Идентификацию генотипов проводят по критерию присутствия или отсутствия дополнительных полос в сравнении с контрольной ДИК (норма) и панели образцов ДНК с мутациями A1555G, del961T(ins)_n, C1494T и Т1095С гена MTRNR1.

На фигурах 1 и 2 представлен SSCP-анализ продуктов амплификации гена MTRNR1. Фигура 1. SSCP-анализ участка 1 гена MTRNR1. Дорожка 1 - молекулярный маркер λpUC19/Pstl; дорожка 2 - образец, содержащий мутацию Т1095С, дорожки 3, 4 - образцы, содержащие мутацию del961TinsC_n, дорожка 5 - образец с нормальной последовательностью ДНК. Фигура 2. SSCP-анализ участка 2 гена MTRNR1. Дорожка 1 - молекулярный маркер λpUC19/Pstl; дорожка 2 - образец, содержащий мутацию A1555G в состоянии гомоплазмии, дорожка 3 - образец, содержащий мутацию A1555G в состоянии гетероплазмии, дорожка 4 - образец, содержащий мутацию C1494T.

В качестве конкретных примеров в целом были обследованы 70 неродственных пациентов с острой нейросенсорной тугоухостью, возникшей на фоне применения антибиотиков из группы аминогликозидов, а также 231 пробанд с диагнозом двухсторонняя нейросенсорная тугоухость предположительно наследственной этиологии, состоящих на учете в Республиканском сурдологическом центре Республиканской детской клинической больницы г.Уфы, членов их семей, а также здоровых доноров, проживающих в Волго-Уральском регионе. Диагноз глухоты или тугоухости устанавливался на основе данных тональной пороговой аудиометрии (аудиометр «GSI-61», Grason Stadler Instruments, USA), акустической импедансометрии (импедансометр «Zodiac 901», Дания) и регистрации отоакустической эмиссии (система «ILO 92», Otodynamics Ltd., Великобритания). Наследственный характер глухоты в семьях устанавливали на основании генеалогических данных и ретроспективного анализа анамнеза больных с целью исключения возможного влияния факторов внешней среды во время пренатального и постнатального развития: учитывали отсутствие инфекций, травм слухового аппарата.

Молекулярно-генетический анализ частот мутаций A1555G, del961T(ins)_n, C1494T и Т1095С гена MTRNR1 проводился у больных, страдающих сенсоневральной тугоухостью третьей и четвертой степени и глухотой, предположительно наследственной этиологии, возникшей после терапии аминогликозидами.

Мутации A1555G, C1494T и Т1095С гена MTRNR1 не обнаружены ни у одного из обследуемых нами пациентов и в группе контроля.

В гене MTRNR1 у четырех обследуемых была выявлена мутация del961TinsC_n. У двух пациентов данная мутация находилась в состоянии гомоплазмии и у двух - в состоянии гетероплазмии. Двум пациентам татарской и русской этнической принадлежности, несущим мутацию del961TinsC_n в состоянии гетероплазмии, диагноз нейросенсорной несиндромальной формы глухоты был поставлен в первые месяцы жизни. Терапию аминогликозидами больные отрицают, однако указывают на тяжелые инфекционные заболевания в возрасте до года. Двое других пациентов - носителей мутации del961TinsC_n в состоянии гомоплазмии русской этнической принадлежности, указывали на тяжелую форму гриппа, перенесенную в раннем детстве. На фоне лечения осложнений после гриппа у данных больных развилась острая нейросенсорная тугоухость. Также были обнаружены мутации 961Т→G и 961Т→А у больных русской этнической принадлежности с диагнозом острой нейросенсорной тугоухости неясной этиологии. Мутация 961Т→G, по литературным данным, характерна для больных острой нейросенсорной тугоухостью из европейских популяций [Mishmar et al., 2003; Achilla et al., 2004]. Тогда как del961TinsC_n чаще встречается у больных из Японии [Tanaka et al., 2004], Кореи и Тайвани [Mishmar et al., 2003], Пакистана [Achilli et al., 2005]. Изменение нуклеотидной последовательности митохондриальной ДНК 961Т→А гена MTRNR1 было выявлено впервые у больного острой нейросенсорной тугоухостью на фоне применения аминогликозидов. Таким образом, частота мутации del961TinsC_n среди пациентов с острой нейросенсорной тугоухостью составила 0,028 (2,8%), а среди пациентов с наследственной несиндромальной глухотой - 0,008 (0,8%). Мутации 961T→G и 961Т→А были выявлены с частотой 0,014 (1,4%) в группе пациентов с острой нейросенсорной тугоухостью.

Полученные высокие значения частоты мутации del961TinsC_n среди больных острой нейросенсорной тугоухостью в Башкортостане подтверждают важность определения этой делеции в гене MTRNR1 при медико-генетическом консультировании пациентов с потерей слуха на фоне лечения антибиотиками из группы аминогликозидов. Поскольку применение антибиотиков аминогликозидового ряда, таких как стрептомицин, канамицин, гентамицин, клиндомицин и др., широко распространено в нашей стране, изучение частоты мутации del961TinsC_n гена MTRNR1 является актуальным для оценки риска возникновения сенсоневральной глухоты в семьях, где данная мутация находится в состоянии гетероплазмии, а также разработки схемы дородовой диагностики повреждений гена MTRNR1 у плода.

Пример 1. Больной Ф.И., 1990 год рождения, город Туймазы, Республика Башкортостан. Диагноз острой нейросенсорной двухсторонней глухоты установлен в 1992 году после курса гентамицина по поводу острой двухсторонней пневмонии. Острая нейросенсорная тугоухость наступила после двух первых инъекций препарата, однако лечение продолжали на основании тяжелого соматического состояния больного. В настоящее время пациент использует слуховой аппарат. Со стороны родителей и ближайших родственников - наследственность не отягощена. Нарушений слуха у родных пациента не выявлено. При молекулярно-генетическом тестировании у больного и его родителей было взято по 8 мл венозной крови с последующим выделением ДНК и амплификацией двух участков кодирующего региона гена MTRNR1 в реакционной смеси, содержащей 0,8 мкг геномной ДНК, соответствующее кол-во каждого олигонуклеотида (Таблица), 125 мкМ каждого дезоксинуклеозидтрифосфата в 12,5 мкл однократного буфера для ПЦР. Затем провели SSCP-анализ амплифицированных ПЦР-продуктов при постоянном напряжении 100 В. После окончания электрофореза гель окрасили раствором 0,1% водного раствора AgNO₃, содержащего 0,15% формалина и 0,02% тиосульфата натрия. Исследование ДНК больного и его родителей выявило наличие мутации del961TinsC_n у матери в состоянии гетероплазмии. У пациента была выявлена мутация del961TinsC_n в состоянии гомоплазмии, которая явилась причиной глухоты в ответ на терапию антибиотиками аминогликозидового ряда. Время исследования составило 2 дня.

Пример 2. Пациентка А.А., 1978 год рождения, город Уфа, Республика Башкортостан. Слух нормальный, беременность 8 недель. Со стороны мужа наследственность по врожденной глухоте не отягощена. Выявлены нарушения слуха у сына сестры пациентки. Больной был проведен амниоцентез и взята ворсина хориона. Также у супругов взяли по 8 мл венозной крови с последующим выделением ДНК и амплификацией двух участков гена MTRNR1 в реакционной смеси, содержащей 0,8 мкг геномной ДНК, соответствующее кол-во каждого олигонуклеотида (Таблица), 125 мкМ каждого дезоксинуклеозидтрифосфата в 12,5 мкл однократного буфера для ПЦР. Затем провели SSCP-анализ амплифицированных ПЦР-продуктов при постоянном напряжении 100 В. После окончания электрофореза гель окрасили раствором 0,1% водного раствора AgNO₃, содержащего 0,15% формалина и 0,02% тиосульфата натрия. При исследовании ДНК ворсины хориона была обнаружена мутация del961TinsC_n гена MTRNR1 в состоянии гетероплазмии у пациентки и в состоянии гомоплазмии у плода, что явилось свидетельством о возможном возникновении острой нейросенсорной тугоухости у будущего ребенка в случае применения антибиотиков аминогликозидового ряда. Время исследования составило 2 дня.

Таким образом, нами проведено молекулярно-генетическое изучение распространенности часто встречающейся в нашем регионе мутации del961TinsC_n гена MTRNR1 у 70 больных острой нейросенсорной тугоухостью и глухотой и у 231 неродственного индивида с наследственной несиндромальной глухотой, проживающих на территории республики Башкортостан. Полученные данные позволяют оценивать вероятность возникновения острой нейросенсорной тугоухости и глухоты при антибиотикотерапии аминогликозидами у детей практически с первых дней жизни. Установление с помощью молекулярно-генетических методов вероятности повреждения слуха при проведении антибиотикотерапии с самого рождения позволяет предотвратить повреждение процесса звуковосприятия, а также снизить экономические затраты на проведение дорогостоящих диагностических процедур.

Реакционная смесь для ПЦР
Мутация	ПЦР буфер (х10), мкл	Смесь dNTP, мкл	Праймер F, мкл	Праймер R, мкл	Объем Taq-полимеразы, мкл (ЕД)	Объем Н2О, мкл	Кол-во ДНК, мкг
961delTinsCn	1,25	0,5	0,19	0,18	0,25 (5ЕД)	10,38	0,8
A1555G	1,25	0,5	0,25	0,25	0,25 (5ЕД)	9,35	0,8

Данные приводятся из расчета на 1 образец ДНК. Реакция проводится в 12,5 мкл реакционной смеси

Способ определения мутаций гена MTRNR1 при острой нейросенсорной тугоухости на фоне применения антибиотиков из группы аминогликозидов, включающий выделение ДНК из лимфоцитов периферической венозной крови, идентификацию мутаций A1555G, del961T(ins)_n, C1494T и Т1095С, отличающийся тем, что амплификацию проводят с помощью полимеразной цепной реакции синтеза дНК и специфических олигонуклеотидов:

A1555G (F) gctcagcctatataccgccatcttcagcaa,

A1555G (R) tttccagtacacttaccatgttacgactgg,

de1961T(F) ccaccgcggtcacacgattaa,

de1961T(R) ttctggcgagcagttttgttga,

после чего проводят SSCP анализ, а идентификацию генотипов осуществляют по критерию присутствия или отсутствия дополнительных полос в сравнении с контрольной ДНК и панелью образцов ДНК с мутациями A1555G, de1961T(ins)_n, C1494T и Т 1095С гена MTRNR1.