Иммобилизованный антибиотик и способ его получения

Изобретение относится к области лекарственных средств, в частности к иммобилизованному антибиотику общей формулы B-F-A, где В - основа, представляющая собой фосфат или гидроксифосфат (гидроксилапатит) кальция или их смеси, F - привитая к поверхности В группа -Р-O-, А - остаток антибиотика, содержащего непротонированные амино- и/или спиртовые группы, и способу получения иммобилизованного антибиотика, включающего обработку фосфата или гидроксифосфата кальция или их смесей сшивающим агентом с последующим взаимодействием с антибиотиком, содержащим непротонированные амино- и/или спиртовые группы, где в качестве сшивающего агента используют пентахлорид фосфора, и все операции проводят в апротонном растворителе. Техническим результатом является увеличение времени смывания антибиотика с поверхности, выделение антибиотика с поверхности в исходном виде и отсутствие токсичных продуктов гидролитического разложения иммобилизованного антибиотика. 2 н. и 3 з.п. ф-лы, 8 табл.

 

Изобретение относится к области химии поверхности, в частности к химии поверхности биосовместимых фосфатов кальция, применяемых в качестве покрытий ортопедических имплантантов, наполнителей полимерных костных цементов, носителей клеточных культур и лекарственных препаратов. Настоящее изобретение позволяет изменять адсорбционные характеристики поверхности биосовместимых фосфатов кальция, что может быть использовано при разработке лекарственных препаратов местного пролонгированного действия.

В литературе (пат. США №6.821.528 и №6.767.550, статьи Pham H.H, Luo Р, Ginin F, Dash A.K. Synthesis and Characterization of Hydroxyapatite-Ciprofloxacin Delivery Systems by Precipitation and Spray Drying Technique. AAPS PharmSciTech. 2002; 3(1), Murugan R., Rao K.P. Controlled release of antibiotic from surface modified coralline hydroxya-patife. Trends Biomaterials Artif. Organs, v.l6 (2002) 43-45, A.C.Queiroz, J.D.Santos, F.J.Monteiro, J.C.Knowles, I.R.Gibson, Adsorption and release studies of sodium ampicillin from hydroxyapatite and glass reinforced hydroxyapatite. Biomaterials 22 (2001) 1393-1400) описан ряд методов нанесения различных лекарственных препаратов на импланты из гидроксилапатита (ГАП).

Недостатком этих методик является быстрое смывание лекарственных препаратов межтканевой жидкостью с поверхности имплантов (от нескольких часов до недели, в то время как резорбция импланта за период времени до года). Применение биополимеров позволяет лишь незначительно улучшить ситуацию, кроме того, внесение в организм посторонних белков и нерезорбируемых частиц может быть нежелательно.

В литературе описаны примеры успешного модифицирования поверхности ГАП различными органическими соединениями (Tanaka H., Watanabe Т., Chikazawa М., Kandori К., Ishikawa Т. Surface structure and properties of calcium hydroxyapatite modified by hexamethyldisilazane. Journal of Colloid and Interface Science. 1998; 206:205-11; L. Borum, О. С. Wilson, Surface modification of hydroxyapatite. Part II. Silica. Biomaterials 2003, 24:3681-8; Tanaka H., Yasukawa A., Kandori K., Ishikawa Т., Surface modifications of calcium hydroxyapatite with hexyl and decyl phosphate. Colloids and surfaces, 1997; 125:53-62). Показано, что модифицирование поверхности ГАП изменяет адсорбционные характеристики материала, и может быть проведено в условиях, не затрагивающих кристаллическую структуру фосфата кальция.

Решение, наиболее близкое по своей технической сущности к настоящему изобретению, описано в статье Ginalzka G., Osin'ska M., Uryniak А., A Covalent Method of Gentamicin Boding to Silica Supports. J. Biomaterials Application, 2004, Vol.18, p.279-289. Авторы предлагают ковалентно пришивать антибиотик гентамицин к предварительно силанизированной поверхности. В качестве сшивающего агента используется аминопропил-триэтоксисилан.

Серьезным недостатком этого метода является необходимость покрывать поверхность импланта чужеродным препаратом, играющим роль связующего агента. Также, в ходе иммобилизации необратимо нарушается молекулярная структура прививаемого антибиотика. Кроме того, антибиотик выделяется в организм вместе с остатком сшивающего агента.

Задачей, решаемой настоящим изобретением, является: разработка метода модифицирования поверхности фосфатов кальция при помощи соединений, не образующих при разложении в организме токсичных и/или инородных продуктов; разработка метода нанесения лекарственных препаратов на модифицированную поверхность фосфата кальция; увеличение времени смывания лекарственного препарата с модифицированной поверхности.

Поставленная задача решается настоящим изобретением, в частности, иммобилизованными антибиотиками общей формулы В-F-А, где В - основа, представляющая собой фосфат или гидроксифосфат (гидроксилапатит) кальция или их смеси, F - привитая к поверхности В группа -Р-О-, А - остаток антибиотика, содержащего непротонированные амино- и/или спиртовые группы, предпочтительно содержащие 0,5-2 мас.% F. Поставленная задача также решается способом получения иммобилизованных антибиотиков общей формулы В-F-А, включающим обработку фосфата или гидроксифосфата кальция или их смесей сшивающим агентом с последующим взаимодействием с антибиотиком, содержащим непротонированные амино- и/или спиртовые группы, характерным тем, что в качестве сшивающего агента используют пентахлорид фосфора, и все операции проводят в апротонном растворителе. Предпочтительно использовать пентахлорид фосфора в количестве до 7 мас.% от количества фосфата или гидроксифосфата кальция или их смесей, оптимально - в количестве 0,5-7 мас.% от количества фосфата или гидроксифосфата кальция или их смесей.

Таким образом, для решения задачи предлагается создавать промежуточный привитый слой на поверхности фосфатов кальция, способный реагировать с лекарственными препаратами. Эффект увеличения времени смывания лекарственного препарата достигается за счет образования химических связей поверхность-лекарственный препарат (преимущественно ковалентных P-N и/или Р-O связей), которые в присутствии воды медленно гидролизуются (с образованием Р-О-Н групп на поверхности и исходных N-H и/или O-Н групп в молекуле лекарственного препарата) с высвобождением лекарственного препарата в ткани организма.

Для этого предлагается использовать в качестве модификатора пентахлорид фосфора PCl₅. В качестве носителя используется ГАП или иной биосовместимый фосфат кальция в виде порошка, гранул произвольной формы или покрытия на металлическом или ином импланте. Желательно, чтобы фосфат кальция обладал развитой поверхностью от 10 м²/г. Если количество лекарственного препарата, вводимого с имплантом мало, величина удельной поверхности фосфата кальция может быть меньше. Лекарственный препарат должен содержать в составе активного компонента непротонированные первичные амино - или спиртовые группы. Поскольку модификатор легко гидролизуется, недопустим контакт модификатора, модифицированного фосфата кальция, модифицированного фосфата кальция с нанесенным лекарственным препаратом с водой или иными протонными растворителями.

Перед модифицированием фосфат кальция должен быть тщательно высушен от остатков адсорбированной влаги. Предпочтительная температура просушки - 150-200°С, продолжительность 6-8 ч. Допустимо и желательно высушивать фосфат кальция в вакууме, при этом можно сократить продолжительность процедуры до 0,5-2 ч. Модификатор растворяется в тщательно очищенном и высушенном органическом растворителе. Модифицирование проводится в среде кипящего органического растворителя при слабом перемешивании в течение 4-10 ч. В качестве растворителя предпочтительно применять легкокипящие насыщенные углеводороды (гексан, гептан, октан, петролейный эфир) или CCl₄. Оптимальное количество модификатора составляет 0,01-0,03 ммоль на 1 м² поверхности фосфата кальция. Оптимальное количество растворителя должно составляет 50-100 мл на 1 г фосфата кальция.

После завершения модифицирования растворитель с непрореагировавшим модификатором удаляется, модифицированный фосфат кальция подвергается многократному промыванию (не менее 5-7 раз). В качестве промывной жидкости могут быть использованы тщательно очищенные и высушенные насыщенные углеводороды (гексан, петролейный эфир), CCl₄, хлороформ, хлористый метилен, диэтиловый эфир. Недопустимо использование для промывания воды, спиртов, аминов, кетонов и т.д. Остатки промывной жидкости удаляются горячим фильтрованием на вакуумном фильтре или выпариванием под вакуумом. Высушенный модифицированный фосфат кальция упаковывается в герметичный контейнер, где хранится без потери своих свойств. В ходе подготовки и модифицирования фосфата кальция все операции проводятся в токе воздуха или инертного газа, тщательно осушенного от остатков влаги.

Нанесение лекарственного препарата на модифицированный фосфат кальция проводится следующим образом. Лекарственный препарат растворяется в тщательно очищенном и осушенном апротонном растворителе (ДМСО, диэтиловый эфир, хлороформ, петролейный эфир). Необходимо, чтобы активный компонент лекарственного препарата содержал непротонированные первичные амино- или спиртовые группы. Нежелательно использование лекарственных препаратов в виде солей неорганических кислот (хлоридов, сульфатов и т.д.). Количество лекарственного препарата предпочтительно составляет 0,002-0,03 ммоль на 1 м² поверхности модифицированного фосфата кальция. Количество растворителя определяется исходя из количества лекарственного препарата (оптимально - 10-100 мл на 1 г модифицированного фосфата кальция).

Модифицированный фосфат кальция помещается в раствор лекарственного препарата и выдерживается в течение 1-10 часов при слабом перемешивании. Затем растворитель с остатками лекарственного препарата удаляется, модифицированный фосфат кальция с нанесенным лекарственным препаратом подвергается многократному промыванию. В качестве промывных жидкостей последовательно используются: растворитель, из которого проводилось нанесения лекарственного препарата, диэтиловый эфир, этиловый или изопропиловый спирт, вода (не менее 5 раз каждой жидкостью). Остатки промывной жидкости удаляются горячим фильтрованием на вакуумном фильтре или выпариванием под вакуумом. Высушенный модифицированный фосфат кальция с нанесенным лекарственным препаратом упаковывается в герметичный контейнер или применяется непосредственно по назначению.

При использовании соответствующих реактивов и соединений и надлежащем выполнении всех операций, полученный продукт представляет собой материал с кристаллической структурой исходного фосфата кальция, на поверхности которого плотным слоем ковалентно привиты молекулы лекарственного препарата. Продукт не содержит остатков органических растворителей, использовавшихся на промежуточных стадиях. Привитый модификатор при гидролизе в условиях организма образует фосфат анион, остающийся на поверхности импланта, и хлорид анион, переходящий в межтканевую жидкость. Лекарственный препарат, нанесенный на поверхность модифицированного фосфата кальция, смывается без изменений своего химического состава.

Сущность изобретения может быть проиллюстрирована на следующих примерах.

Пример 1.

1 г ГАП (удельная поверхность 60 м²/г) помещали в трехгорлую колбу и высушивали от остатков влаги под вакуумом (˜0,5 мм рт.ст., 150°С) в течение 1 часа, после чего колбу заполняли воздухом, высушенным над прокаленным CaCl₂. Высушенный ГАП кипятили вместе с 1,3 ммоль PCl₅, растворенного в 85 мл четыреххлористого углерода, в течение 8 ч при слабом перемешивании. После охлаждения раствор декантировали, осадок промывали по 3 раза гексаном, CCl₄ и СН₂Cl₂ и высушивали под вакуумом (˜0,5 мм рт.ст.) на водяной бане. Все операции проводили в потоке воздуха, высушенного над CaCl₂, для предотвращения гидролиза модификатора атмосферной влагой. Рентгенофазовый анализ показал отсутствие пиков примесных фаз, содержание углерода составило <0,01% масс.

Аналогично модифицировали аморфный фосфат кальция (АФК). После модифицирования продукт оставался рентгеноаморфным и не содержал углерода.

Пример 2.

Модифицированные носители из примера 1 помещали в раствор октадециламина (ОДА) или тетраэтиленпентамина (ТЭПА) в толуоле на 8 ч со слабым перемешиванием при комнатной температуре. Амины брали в количестве 0,12 г ОДА в 60 мл толуола и 0,2 мл ТЭПА в 50 мл толуола на 1 г носителя. Все операции с химически модифицированными фосфатами кальция проводили под током воздуха, высушенного над CaCl₂. Затем раствор декантировали, осадок тщательно промывали гексаном и CCl₄ и высушивали под вакуумом на водяной бане. Для сравнения наносили ОДА и ТЭПА на исходные носители.

Пример 3.

50 мг АФК или ГАП, с нанесенными ОДА или ТЭПА из примера 2, помещали в 50 мл дистиллированной воды и выдерживали, периодически перемешивая, при комнатной температуре в течение нужного времени. Осадок фильтровали и высушивали под вакуумом на водяной бане. Содержание ОДА и ТЭПА на поверхности носителя определяли по содержанию углерода. Данные приведены в табл. 1-4 (указано число молекул ОДА и ТЭПА на 1 нм² поверхности).

Табл. 1 Гидролитическая десорбция ОДА с поверхности ГАП
Время десорбции	0 мин (не гидролизован)	1 мин	4 мин	15 мин
ГАП/PCl5	4,2±0,05	4,2±0,05	4,1±0,05	3,6±0,05

Исходный ГАП	5,0±0,05	4,5±0,05	3,4±0,05	2,7±0,05
Табл. 2 Гидролитическая десорбция ТЭПА с поверхности ГАП
Время десорбции	0 мин (не гидролизован)	1 мин	4 мин	15 мин
ГАП/PCl5	9,2±0,1	2,4±0,1	1,9±0,1	1,6±0,1
Исходный ГАП	2,8±0,1	0,9±0,1	1,7±0,1	1,0±0,1
Табл. 3 Гидролитическая десорбция ОДА с поверхности АФК
Время десорбции	0 мин (не гидролизован)	15 мин	60 мин	240 мин
АФК/PCl5	1,4±0,05	1,2±0,05	1,0±0,05	1,0±0,05
Исходный АФК	1,9±0,05	1,8±0,05	1,4±0,05	1,1±0,05
Табл. 4 Гидролитическая десорбция ТЭПА с поверхности АФК
Время десорбции	0 мин (не гидролизован)	15 мин	60 мин	240 мин
АФК/PCl5	3,2±0,1	1,3±0,1	0,9±0,1	1,3±0,1
Исходный АФК	1,5±0,1	0,9±0,1	0,3±0,1	0

Пример 4.

1 г гентамицин-сульфата (содержание активного компонента 600 мг/г) растворяли в 20 мл воды. Затем осаждали сульфат-анионы насыщенным раствором Са(ОН)₂, при этом гентамицин переходил в непротонированную форму. Раствор отфильтровывали и упаривали под вакуумом на водяной бане. Полученный антибиотик растворяли в 250 мл сухого ДМСО. Содержание гентамицина в ДМСО составляло 0,23 г на 100 мл ДМСО. 1 г носителя из примера 1 помещали в 100 мл раствора гентамицина в ДМСО (ГЕНТА/ДМСО) на 4 ч при комнатной температуре и слабом перемешивании. Раствор декантировали, осадок промывали СН₂Cl₂, диэтиловым эфиром и водой и высушивали под вакуумом на водяной бане. Для сравнения наносили аналогично гентамицин на исходные фосфаты кальция.

Пример 5.

100 мг ГАП, с нанесенным гентамицином из примера 4, помещали в 10 и 50 мл дистиллированной воды и выдерживали, периодически перемешивая, при комнатной температуре в течение нужного времени. Осадок фильтровали и высушивали под вакуумом на водяной бане. Содержание гентамицина на поверхности носителя определяли по содержанию углерода. Данные приведены в табл. 5 (указано количество мг гентамицина на поверхности 1 г ГАП).

Табл.5 Гидролитическая десорбция ГЕНТА/ДМСО с поверхности ГАП
Время десорбции, ч	0 (н/г)	0,02	0,25	1	4	16	72	168	288
ГАП(ГАП/вода=1/100)	37±1	-	28	21	17	11	7	0	-
ГАП (ГАП/вода=1/500)	37±1	23	17	12	1	3	-	-	-
ГАП/PCl5 (1/100)	37±1	-	26	25	25	27		19	19
ГАП/PCl5 (1/500)	37±1	25	26	26	28	-	19	-	-

Пример 5.

100 мг ГАП, с нанесенным гентамицином из примера 4, помещали в 10 мл буферных фосфатных растворов с концентрацией 0,1 М и рН=5,5 и 7,0 и выдерживали, периодически перемешивая, при комнатной температуре в течение нужного времени. Осадок фильтровали и высушивали под вакуумом на водяной бане. Содержание гентамицина на поверхности носителя определяли по содержанию углерода. Данные приведены в табл. 6,7 (указано количество мг гентамицина на поверхности 1 г ГАП).

Табл. 6 Десорбция ГЕНТА/ДМСО в фосфатном буфере (0,1 М, рН=7)
Время десорбции, ч	0 (н/г)	1	4	16	72
ГАП	27±1	26	17	10	2
ГАП/PCl5	32	27	14	14	13
Табл. 7 Десорбция ГЕНТА/ДМСО в фосфатном буфере (0,1 М, рН=5,5).
Время десорбции, ч	0 (н/г)	1	4	16	72
ГАП	27±1	19	15	13	5
ГАП/PCl5	27	17	17	16	16

Пример 6.

0,13 г гентамицин сульфата (содержание активного компонента 60%) растворяли в 10 мл воды (ГЕНТА/вода). В раствор помещали 1 г носителя из примера 1 и перемешивали в течение 4 ч при комнатной температуре, затем фильтровали ("свободная адсорбция") или упаривали растворитель под вакуумом на водяной бане ("принудительная адсорбция"). Для сравнения наносили аналогично гентамицин на исходные фосфаты кальция.

Пример 7.

250 мг ГАП, с нанесенным гентамицином из примера 6, помещали в 2,5 мл дистиллированной воды и выдерживали, периодически перемешивая, при комнатной температуре в течение нужного времени. Осадок фильтровали и высушивали под вакуумом на водяной бане. Содержание гентамицина на поверхности носителя определяли по содержанию углерода. Данные приведены в табл. 8 (указано количество мг гентамицина на поверхности 1 г ГАП).

Табл. 8 Гидролитическая десорбция ГЕНТА/вода с поверхности ГАП
Время десорбции	0 мин (не гидролизован)	15 мин	60 мин	240 мин
ГАП (свободная)	12±5	0±2	-	-
ГАП (принудительная)	78±7	10±5	0±2	-
ГАП/PCl5 (свободн.)	27±5	16±5	9±5	0±2
ГАП/PCl5 (принудит.)	78±7	43±6	11±5	4±2

1. Иммобилизованный антибиотик общей формулы B-F-A, где В - основа, представляющая собой фосфат или гидроксифосфат (гидроксилапатит) кальция или их смеси, F - привитая к поверхности В группа -Р-O-, А -остаток антибиотика, содержащего непротонированные амино- и/или спиртовые группы.

2. Иммобилизованный антибиотик по п.1, содержащий 0,5-2 мас.% F.

3. Способ получения иммобилизованного антибиотика общей формулы В-F-A, где В - основа, представляющая собой фосфат или гидроксифосфат (гидроксилапатит) кальция или их смеси, F - привитая к поверхности В группа -Р-O-, А - остаток антибиотика, содержащего непротонированные амино- и/или спиртовые группы, включающий обработку фосфата или гидроксифосфата кальция или их смесей сшивающим агентом с последующим взаимодействием с антибиотиком, содержащим непротонированные амино- и/или спиртовые группы, характерный тем, что в качестве сшивающего агента используют пентахлорид фосфора, и все операции проводят в апротонном растворителе.

4. Способ по п.3, характерный тем, что используют пентахлорид фосфора в количестве до 7 мас.% от количества фосфата или гидроксифосфата кальция или их смесей.

5. Способ по п.4, характерный тем, что используют пентахлорид фосфора в количестве 0,5-7 мас.% от количества фосфата или гидроксифосфата кальция или их смесей.