Способы профилактики и лечения заболеваний, вызванных вирусом гриппа птиц a/h5n1, с использованием индуктора интерферона и ингибитора нейраминидазы

Изобретение относится к области биотехнологии, вирусологии и медицины. Изобретение касается способов профилактики и лечения вирусных заболеваний, в частности, вызванных штаммами субтипа H5N1 вируса гриппа птиц, препаратом индуктора интерферона, обладающего противовирусным действием, или препаратами индуктора интерферона и ингибитора нейраминидазы. Способ включает введение в организм препарата индуктора интерферона или индуктора интерферона и ингибитора нейраминидазы озельтамивира. В качестве индуктора интеферона используют препарат Ридостин. Способы обладают более высокой эффективностью, сниженной токсичностью и хорошей переносимостью путем использования препарата индуктора интерферона на основе двуспиральной и одноцепочечной РНК, полученной из киллерных дрожжей Saccharomyces cerevisiae, совместно с ингибитором нейраминидазы и создания более оптимальной схемы их введения в организм. Изобретение может быть использовано в медицине. 2 н.п. ф-лы, 4 табл.

 

Изобретение относится к медицине, а именно к вирусологии, иммунологии, фармакологии, и касается способов профилактики и лечения вирусных заболеваний, в частности, вызванных штаммами субтипа H5N1 вируса гриппа птиц, препаратом индуктора интерферона, обладающего противовирусным действием, или препаратами индуктора интерферона и ингибитора нейраминидазы.

Актуальность разработки заявляемого способа. Новые эпидемичные штаммы вируса гриппа А возникают каждые 1-2 года в результате точечных мутаций в двух поверхностных белках - гемагглютинине (НА) и нейраминидазе (NA). В декабре 2003 года и первом квартале 2004 года новый вариант субтипа H5N1 вируса гриппа А стал причиной заболевания у людей в 8 странах Юго-Восточной Азии. Во время вспышки во Вьетнаме и Таиланде тяжело заболели 34 человека, более чем в 60% случаев заболевания закончились смертельными исходами. В настоящее время заболевание, вызванное субтипом H5N1 вируса гриппа, зарегистрировано уже в 15 странах, и общее количество заболевших по данным ВОЗ на 19 июля 2008 года составило 385 человек, 243 из них (63%) скончались. Многие эксперты считают, что этот вариант вируса гриппа может стать пандемичным, и одной из приоритетных задач здравоохранения в настоящее время является разработка эффективных профилактических и лечебных препаратов против вируса гриппа А субтипа H5N1.

Известно использование препаратов типа амантадина и ремантадина в качестве противовирусных профилактических и лечебных средств, которые обладают низкой противовирусной активностью в отношении штаммов вируса гриппа птиц [Watts J. Asian nations step up action to curb spread of avian influenza // Lancet. - 2004. - V.363, N 9406. - P.373]. Это связано с мутациями в гене, кодирующем белок М2, которые делают вирус устойчивым к этому классу соединений [Li K.S., Guan Y., Wang J., et al. Genesis of a highly pathogenic and potentially pandemic H5N1 influenza virus in eastern Asia // Nature. - 2004. - V.430, N 6996. - P.209-213], эти мутации возникают примерно в 30% случаев.

Разработан новый противогриппозный препарат Тамифлю, являющийся ингибитором нейраминидазы вирусов гриппа А и В - озельтамивир фосфат (oseltamivir), который, соединяясь с гидрофобным участком активного участка нейраминидазы вируса гриппа, блокирует способность последнего отщеплять остатки сиаловой кислоты с поверхности инфицированной клетки, тем самым подавляя выход из нее новых сформировавшихся вирионов.

Озельтамивир (Тамифлю) в настоящее время считается одним из эффективных противовирусных препаратов. Для озельтамивира характерна низкая способность к селекции устойчивых штаммов вируса гриппа A [Kiso M., Mitamura К., Sakai-Tagawa Y., et al. Resistant influenza A viruses in children treated with oseltamivir: descriptive study // Lancet. - 2004 - V.364 - N 9436 - P.759-765]. Однако полностью вероятность возникновения резистентности к озельтамивиру не исключена [Menno D. de Jong, Tran Tan Thanh, Truong Huu Khanh et al. Oseltamivir Resistance during Treatment of Influenza A (H5N1) Infection // N Engi J Med. - 2005. - N 353. - P.2667-2572], что требует сочетания озельтамивира с другими противовирусными препаратами и/или препаратами интерферонов или их индукторов. Также высказываются сомнения об эффективности озельтамивира по отношению к штаммам, циркулирующим в настоящее время [Smee D.F., Wong M.H., Bailey K.W., et al. Activities of oseltamivir and ribavirin used alone and in combination against infections in mice with recent isolates of influenza A (H1N1) and В viruses // Antivir Chem Chemother. - 2006. - V.17, N4. - P.185-192]. Все вышеизложенное подтверждает необходимость комбинированного лечения гриппозной инфекции, сочетая препараты различной направленности. В последнее десятилетие в комплексное лечение гриппа включают иммунотропные лекарственные средства интерфероны (ИФН) и их индукторы (ИИФН), обладающие комбинированным этиотропным и иммуномодулирующим эффектом [Колобухина Л.В. Клиника и лечение грипп". // РМЖ. - 2001. - Т.9, №16-17. - С.135-136].

Известен способ повышения резистентности организма при вирусных инфекциях путем введения в организм сублингвально гранул, содержащих индуктор интерферона, который использовался по схеме: 5 гранул 1 раз в день утром за 30 минут до еды в течение 10 дней. В качестве индуктора интерферона использовались средства, выбранные из группы: амиксин, циклоферон, неовир, ридостин, полудан, ларифан, кагоцел, а также из группы: дибазол, папаверин, кофеин, курантил. Препарат предлагается использовать для повышения резистентности к инфицированию вирусами и другими инфекционными агентами, такими как вирусы гриппа, парагриппа, аденовирусы, простого герпеса, Эпштейна-Бара, коронавирусы, энтеровирусы, риновирусы, респираторно-синтициальный вирус, хламидии, микоплазмы [Патент РФ 2191594, МПК А61К 38/21, опубл. 27.10.2002 г.].

Однако в этом способе указано только, что содержание индукторов интерферона в сублингвальных гранулах составляет 0,01-5 мг в грануле без рекомендации четкой дозировки для каждого препарата из заявленной группы: амиксин, циклоферон, неовир, ридостин, полудан, ларифан, кагоцел, а также из группы: дибазол, папаверин, кофеин, курантил. Данный способ имеет следующие недостатки: сублингвальные гранулы содержат индуктор интерферона в малых дозах, по этой причине, как указано в патенте, даже для профилактики заболевания необходимо единомоментно использовать до 5 гранул и для достижения эффекта принимать их 1-3 раза в день. Данные об эффективности сублингвальных гранул, содержащих индуктор интерферона, при использовании для лечения заболевания отсутствуют. При этом препарат проявляет заявляемый эффект при совместном использовании с препаратом альфа-2 интерферона. Кроме того, нет сведений о лечебно-профилактическом действии препарата в отношении заболеваний, вызванных штаммами субтипа H5N1 вируса гриппа птиц.

Известен препарат Ридостин и способ его применения, который производит российская фармацевтическая компания ООО «Диа-Фарм» на основе лицензионного договора на передачу прав [по Патенту РФ №2083221, МПК А61К 38/20, опубл. 10.07.1997 г.] с ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора. Известно, что указанный препарат рекомендован для профилактики гриппа и ОРЗ инъекционно в дозе 8 мг на человека 1 раз: до заболевания или в день обращения больного к врачу, а при терапии гриппа и ОРЗ препарат назначают инъекционно по 8 мг на человека 2 раза: в день обращения больного к врачу и через 2 дня.

Однако для профилактики и лечения заболеваний, вызванных штаммами субтипа H5N1 вируса гриппа птиц, такая схема препарата не дает надежного эффекта, особенно при лечении, и требует разработки иной схемы применения данного индуктора интерферона в комбинации с другими противовирусными препаратами.

Наиболее близким аналогом (прототипом) является способ профилактики и лечения противовирусных заболеваний, например, гриппа птиц, в частности заболеваний, вызванных штаммом A/Duck/MN/1525/81, H5N1 [Заявка США №20060035859, МПК А61К 48/00, опубл. 16.02.2006 г.]. Для профилактики и лечения препарат ингибитора нейраминидазы - озельтавир (Тамифлю) предлагают вводить в организм совместно с дсРНК (Ampligen RTM) перорально или сублингвально в дозе до 100 mu.g/ml.

Однако противовирусные свойства этих препаратов исследовались только на перевиваемых культурах клеток Vero или MDCK, что недостаточно для обоснования их противовирусного действия (в частности, на штамме вируса гриппа птиц H5N1) при введении в организм животных или людей. Причем в прототипе используемый штамм A/Duck/MN/1525/81 не является актуальным для современной эпидемиологической ситуации и не отражает резистентность современных штаммов к химиопрепаратам, в том числе Тамифлю. Кроме того, известно, что препарат дсРНК (Ampligen RTM) - это двуспиральная РНК, которая является синтетическим полимером, состоящим из полирибоинозиловых и цитидиловых цепей различной протяженности с включениями урацила или гуанина. Она обладает (см. описание к патенту РФ №2083221) высокой токсичностью и статистически достоверным мутагенным эффектом в виде повышения числа хромосомных аберраций в 2-2,5 раза по сравнению с контролем (интактными животными).

Техническим результатом предлагаемого изобретения является создание способа профилактики и лечения вирусных заболеваний, вызванных современными штаммами субтипа H5N1 вируса гриппа птиц, обладающего более высокой эффективностью, сниженной токсичностью и хорошей переносимостью, путем использования препарата индуктора интерферона на основе двуспиральной и одноцепочечной РНК, полученной из киллерных дрожжей Saccharomyces cerevisiae, совместно с ингибитором нейраминидазы и создания более оптимальной схемы их введения в организм.

Указанный технический результат достигается тем, что в способе профилактики и лечения заболеваний, вызванных штаммами субтипа H5N1 вируса гриппа птиц, с использованием индуктора интерферона и ингибитора нейраминидазы, включающем введение в организм препарата индуктора интерферона или совместно индуктора интерферона и ингибитора нейраминидазы озельтамивира, согласно изобретению в качестве индуктора интеферона используют препарат Ридостин, который при профилактике заболеваний вводят в организм инъекционно в диапазоне доз от 0,05 до 0,5 мг/кг 1 раз в сутки и далее через 1 и 3 суток после первого введения Ридостина. При лечении заболеваний вводят в организм Ридостин инъекционно в диапазоне доз от 0,05 до 0,5 мг/кг 1 раз в сутки в день инфицирования и далее через 1 и 3 суток после инфицирования и ингибитор нейраминидазы озельтамивир перорально в диапазоне доз от 0,2 до 2 мг/кг 2 раза в сутки в течение 5-7 суток после инфицирования вирусом гриппа H5N1.

Индукторы интерферона (ИИФН) более предпочтительны в применении в связи с недостатками препаратов ИФНов: необходимость парентерального применения (в/м, п/к или в/в) высоких доз при лечении различных заболеваний. Между тем парентеральное применение препаратов ИФНов (рекомбинантных и природных) в высоких дозах, как правило, сопровождается развитием гриппоподобного синдрома: повышение температуры тела, ломота, артралгия, катаральные явления, головная боль. Кроме того, многократное введение экзогенных ИФНов приводит к появлению антиинтерфероновых антител, нейтрализующих экзогенный интерферон. К тому же, на сегодняшний день лечение препаратами ИФН остается достаточно дорогим и не всем доступным средством.

Исходя из вышеизложенного, преимуществами индукторов ИФНов, направленных на синтез эндогенного ИФН, перед препаратами экзогенного ИФН (рекомбинантные природные ИФН) являются:

- вырабатывается эндогенный ИФН при введении индукторов ИФН, не обладающий антигенностью;

- не возникает негативных эффектов, присущих препаратам экзогенного ИФН;

- синтез индуцированного ИФН в организме сбалансирован и подвергается контрольно-регуляторным механизмам (репрессор-трансляции), обеспечивающим защиту организма от перенасыщения ИФН;

- однократное введение в организм индуктора ИФН обеспечивает относительно длительную циркуляцию эндогенного ИФН;

- сочетается с различными медикаментозными средствами, традиционно применяемыми в клинике, обеспечивая при комбинированном использовании синергидный эффект [Интерфероногены: перспективы клинического применения. Руководство для врачей под ред. М.Г.Романцева. - Москва - Санкт-Петербург: НТФФ «Полисан», 1998].

Одним из наиболее эффективных ИИФН является Ридостин. Ридостин относится к высокомолекулярным индукторам интерферона природного происхождения, его действующим началом является двуспиральная рибонуклеиновая кислота (дсРНК) киллерных штаммов дрожжей Saccharomyces cerevisiae. Выпускаемый препарат Ридостин представляет собой смесь натриевых солей двуспиральной и одноцепочечной рибонуклеиновой кислоты [«Индуктор интерферона ридостин» Патент РФ №2083221, МПК А61К 38/20, опубл. 10.07.1997 г.].

Поскольку действующее начало имеет физико-химическую структуру, близкую к структуре генетического материала патогенных вирусов и бактерий, то введение Ридостина вызывает мощный иммунный ответ в организме, включающий индукцию интерферона, стимуляцию фагоцитарной активности макрофагов и нейтрофилов периферической крови и другие процессы, противодействующие инфекции.

Было показано, что при внутрибрюшинном введении мышам Ридостина в дозе 5 мг/кг повышение уровня сывороточного интерферона начинается через 3-6 ч, с максимальным уровнем через 8 ч после введения с сохранением повышенного до 24 ч [Масычева В.И., Ершов Ф.И., Малиновская В.В. Результаты клинической апробации индуктора интерферона ридостин / В сб. «Применение ридостина для лечения вирусных и бактериальных инфекций и перспективы его использования при заболеваниях неинфекционной природы». - Бердск, 1998]. Это особенно важно, так как инфекция, вызываемая вирусом гриппа птиц H5N1, носит системный характер с диссеминацией возбудителя в различные органы.

Пример 1. Способ профилактики заболеваний, вызванных штаммами субтипа H5N1 вируса гриппа птиц

В качестве индуктора интеферона используют препарат Ридостин, который вводят в организм человека в виде инъекций при профилактике заболеваний в диапазоне доз от 0,05 до 0,5 мг/кг 1 раз в сутки и далее через 1 и 3 суток после первого введения Ридостина.

Пример 2. Способ лечения заболеваний, вызванных штаммами субтипа H5N1 вируса гриппа птиц

При лечении в организм человека вводят Ридостин в виде инъекций в диапазоне доз от 0,05 до 0,5 мг/кг 1 раз в сутки в день инфицирования и далее через 1 и 3 суток после инфицирования и ингибитор нейраминидазы озельтамивир перорально в диапазоне доз от 0,2 до 2 мг/кг 2 раза в сутки в течение 5-7 суток после инфицирования вирусом гриппа H5N1.

Пример 3. Изучение лечебно-профилактической эффективности заявляемого способа на животных

Для тестирования противовирусной активности препаратов использовали мышей линии Balb/c 6-недельного возраста (самки массой 16-18 г), полученных из вивария ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор» и штамм вируса гриппа A/chicken/Kurgan/05/2005 (H5N1), полученный из отдела «Коллекция микроорганизмов» ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор» и прошедший 1 пассаж на 10 суточных развивающихся куриных эмбрионах (РКЭ).

Индуктор интерферона Ридостин вводили внутрибрюшинно в дозе 5 мг/кг массы мыши, а Тамифлю вводили перорально в дозе 5 мг/кг массы мыши по определенной схеме для каждого препарата (таблица 1).

Титрование вируса производили на 10-суточных РКЭ. Концентрация вируса в вирусаллантоисной жидкости (ВАЖ) составляла 7,8 lgЭИД₅₀/мл (50% эмбриональных инфицирующих доз в мл). 50% летальная доза (ЛД₅₀) вируса гриппа для мышей, оцененная на беспородных мышах и выраженная в lgЭИД₅₀, составляла 0,6 lgЭИД₅₀/мышь. Мышам интраназально вводили 100 ЛД₅₀ или 10 ЛД₅₀ ВГ в объеме 40 мкл суммарно в обе ноздри.

После инфицирования за животными наблюдали в течение 16 суток, оценивали процент (%) гибели и среднюю продолжительность жизни (СПЖ) в контрольной и опытных группах животных. При определении средней продолжительности жизни (СПЖ) в каждой экспериментальной группе учитывали число животных, проживших определенное количество дней после заражения до гибели, и число выживших животных. За максимальное значение продолжительности жизни для выживших животных принимали 16 суток, т.е. следующий день после прекращения гибели инфицированных мышей. Определяли также коэффициент защиты (КЗ) по формуле:

% гибели в контроле - % гибели в опыте.

Статистическая обработка результатов. Статистическую обработку данных проводили общепринятыми методами для биологических исследований [Ашмарин И.П., Воробьев А.А. Статистические методы в микробиологических исследованиях. - Ленинград: «Гос. Изд. Мед. лит.», 1962; Лакин Г.Ф. Биометрия. - Москва: «Высшая школа», 1990], а также с помощью пакета компьютерных программ анализа данных Microsoft Excel по t-критерию Стьюдента и "Statistica 6,0" с помощью критерия Фишера и поправкой Йетца для малых выборок [StatSoft Inc. 1984-2001]. При сравнении показателей между группами оценивали вероятность ошибки - p и достоверность отличия - P. Отличия считались достоверными при p≤0,05, соответственно Р≥95%.

В таблице 1 приведена схема проведения экспериментов на группах мышеи Balb/c при введении Ридостина внутрибрюшинно (в/б) и/или Тамифлю перорально (п/о) до заражения (д/з) или после заражения (п/з) штаммом ВГП A/chicken/Kwgan/05/2005 (H5N1) в дозе 100 ЛД₅₀.

При инфицировании мышей 100 ЛД₅₀ ВГП было обнаружено, что достоверное преимущество по количеству выживших животных по сравнению с контролем (0%) наблюдалось в Группах 1, 2 и 5, получавших Ридостин д/з (35,7%), Ридостин и Тамифлю д/з (26,7%), а также Ридостин и Тамифлю п/з (33,3%) (таблица 2). В соответствии с этим доля (%) павших мышей в Группе 1 была достоверно ниже, чем в Контроле при р=0,0170 (с поправкой Йетца р=0,0586), в Группе 2 - при р=0,0443 (с поправкой Йетца р=0,1417), в Группе 5 - при р=0,0216 (с поправкой Йетца р=0,0715) (таблица 2).

Таблица 1
Схема проведения экспериментов на животных при использовании Ридостина и/или Тамифлю до и после заражения в дозе 100 ЛД50 ВГП A/chicken/kurgan/05/2005 (H5N1)
№ Группы	Препараты	Число мышей (самки Balb/c)
1	Ридостин в/б за 4 ч д/з ВГП, через 1 и 3 сут п/з ВГ	14 гол.
2	Ридостин в/б за 4 ч д/з ВГП, через 1 и 3 сут п/з ВГ + Тамифлю п/о за 4 ч д/з ВГП, дважды в сутки в течение 6 сут п/з ВГ	15 гол.
3	Тамифлю п/о за 4 ч д/з ВГП, дважды в сутки в течение 6 сут п/з ВГ	12 гол.
4	Ридостин в/б через 1 ч п/з ВГП, через 1 и 3 сут п/з ВГ	13 гол.
5	Ридостин в/б через 1 ч п/з ВГП, через 1 и 3 сут п/з ВГ + Тамифлю п/о через 1 ч п/з ВГП, дважды в сутки в течение 6 сут п/з ВГ	15 гол.
6	Тамифлю п/о через 1 ч п/з ВГП, дважды в сутки в течение 6 сут п/з ВГ	14 гол.
7	Контроль ВГП без введения препаратов	13 гол.

Тем не менее, стоит отметить, что совместное введение Ридостина и Тамифлю п/з 100 ЛД₅₀ ВГП в Группе 5 способствовало появлению тенденции к повышению выживаемости мышей (33,3%) по сравнению с Группой 4, получавшей только Ридостин п/з (7,7%, р=0,0991), или с Группой 6, получавшей только Тамифлю п/з (14,3%, р=0,2310) (таблица 2).

В таблице 2 приведены данные по изучению выживаемости в экспериментальных группах мышей Balb/c, получавших Ридостин и/или Тамифлю при заражении ВГП A/chicken/Kurgan/05/2005 (H5N1) в дозе 100 ЛД₅₀.

По показателю СПЖ при заражении 100 ЛД₅₀ ВГП мыши в Группах 1, 2, 3, 5 и 6 были достоверно выше, чем в контрольной Группе 7 (таблица 2). Самой высокой СПЖ была в Группе 5, получавшей Ридостин и Тамифлю п/з, но достоверно она отличалась только от показателей СПЖ в Контроле и в Группе 4, получавшей только Ридостин п/з (таблица 2).

В таблице 3 приведена схема проведения экспериментов на группах мышей Balb/c при введении Ридостина внутрибрюшинно (в/б) и/или Тамифлю перорально (п/о) до заражения (д/з) или после заражения (п/з) штаммом ВГП A/chicken/Kurgan/05/2005 (H5N1) в дозе 10 ЛД₅₀

Таблица 3
Схема проведения экспериментов при использовании дозы заражения 10 ЛД50 ВГ A/chicken/Kurgan/05/2005 (H5N1)
№ Группы	Препараты	Число мышей (самки Balb/c)
1-1	Ридостин в/б за 4 ч д/з ВГП, через 1 и 3 сут п/з ВГП	30 гол.
2-1	Ридостин в/б за 4 ч д/з ВГП, через 1 и 3 сут п/з ВГП + Тамифлю п/о за 4 ч д/з ВГП, дважды в сутки в течение 6 сут п/з ВГ	30 гол.
3-1	Тамифлю п/о за 4 ч д/з ВГП, дважды в сутки в течение 6 сут п/з ВГП	30 гол.
4-1	Ридостин в/б через 1 ч п/з ВГП, через 1 и 3 сут п/з ВГП	30 гол.
5-1	Ридостин в/б через 1 ч п/з ВГП, через 1 и 3 сут п/з ВГП + Тамифлю п/о через 1 ч п/з ВГП, дважды в сутки в течение 6 сут п/з ВГП	30 гол.
6-1	Тамифлю п/о через 1 ч п/з ВГП, дважды в сутки в течение 6 сут п/з ВГП	30 гол.
7-1	Контроль ВГП без введения препаратов	30 гол.

При использовании для заражения мышей 10 ЛД₅₀ВГП было обнаружено, что достоверное преимущество по количеству выживших животных по сравнению с Контролем (10%) наблюдалось у мышей в Группах 2-1, получавших Ридостин и Тамифлю д/з (33,3%), 3-1, получавших только Тамифлю д/з (36,7%), 5-1, получавших Ридостин и Тамифлю п/з (63,3%), и 6-1, получавших только Тамифлю п/з (33,3%) (таблица 4). Согласно этому доля (%) павших мышей в Группе 2-1 была достоверно ниже, чем в Контроле при р=0,0283 (с поправкой Йетца р=0,0601), в Группе 3-1 - при р=0,0146 (с поправкой Йетца р=0,0326), в Группе 5-1 - при р=0,0000 (с поправкой Йетца р=0,0001), в Группе 6-1 - при р=0,0375 (с поправкой Йетца р=0,0791) (таблица 4).

Более того, в Группе 5-1 совместное введение Ридостина и Тамифлю п/з 10 ЛД₅₀ ВГП приводило к достоверному повышению выживаемости мышей (63,3%) по сравнению с Группой 4-1, получавшей только Ридостин п/з (16,7%, р=0,0002, с поправкой Йетца р=0,0006), или с Группой 6-1, получавшей только Тамифлю п/з (32,1%, р=0,0175, с поправкой Йетца р=0,0347) (таблица 4). В ааблице 4 приведены данные по изучению выживаемости в экспериментальных группах мышей Balb/c, получавших Ридостин и/или Тамифлю при заражении штаммом ВГП A/chicken/Kurgan/05/2005 (H5N1) в дозе 10 ЛД₅₀.

Таблица 4
Результаты экспериментов, охарактеризованных в таблице 3
№ группы мышей	Количество погибших мышей по суткам после заражения ВГП	Число выживших	% павших	СПЖ (сут) M±m
7	8	9	10	11	12	13	14	15	16
Гр 1-1 Рид д/з (n=30)	6	8	3	2	1		1		1		8	73,3&	10,7±0,7*#
Гр 2-1 Рид + Тами д/з (n=30)	1	10	6	1	2						10$	66,7$&	11,1±0,7*#
Гр 3-1 Тами д/з (n=30)		7	7	3	2						11$	63,3$&	11,6±0,6*#
Гр 4-1 Рид п/з (n=30)	8	13	2	2							5	83,3&	9,3±0,6#
Гр 5-1 Рид + Тами п/з (n=30)		1	4	2	3	1					19$	36,7$	13,8±0,6*
Гр 6-1 Тами п/з (n=30)		7	4	3	3		2	1			10$	66,7$&	11,8±0,6*#
Гр 7-1 Контроль (n=30)	10	13	3	1							3	90,0&	8,6±0,6#
Примечание: $ - отличия от Контроля по критерию χ2 с вероятностью 95%; & - отличия от Группы 5-1 по критерию χ2 с вероятностью 95%; * - отличия от Контроля с вероятностью не менее 95%; # - отличия от Группы 5-1 с вероятностью не менее 95%. Группа 1-1 - мыши, получавшие Ридостин в/б за 4 ч д/з заражения 10 ЛД50 ВГП, а потом через 1 и 3 сут п/з ВГП; Группа 2-1 - мыши, получавшие Ридостин в/б за 4 ч д/з заражения 10 ЛД50 ВГП, а потом через 1 и 3 сут п/з ВГ, и Тамифлю п/о за 4 ч д/з заражения ВГ, а потом в течение 6 сут п/з ВГП; Группа 3-1 - мыши, получавшие Тамифлю п/о за 4 ч д/з заражения 10 ЛД50 ВГП, а потом в течение 6 сут п/з ВГП; Группа 4-1 - мыши, получавшие Ридостин в/б через 1 ч п/з заражения 10 ЛД50 ВГП, а потом через 1 и 3 сут п/з ВГП; Группа 5-1 - мыши, получавшие Ридостин в/б через 1 ч п/з заражения 10 ЛД50 ВГП, а потом через 1 и 3 сут п/з ВГ, и Тамифлю п/о через 1 ч п/з заражения ВГ, а потом в течение 6 сут п/з ВГП; Группа 6-1 - мыши, получавшие Тамифлю п/о через 1 ч п/з заражения 10 ЛД50 ВГП, а потом в течение 6 сут п/з ВГП; Группа 7-1 - мыши, не получавшие препараты при заражении 10 ЛД50 ВГП.

СПЖ при заражении мышей 10 ЛД₅₀ ВГП были достоверно выше, чем в контрольной Группе 7-1, только в Группах 1-1, 2-1, 3-1, 5-1 и 6-1 (таблица 4). Самой высокой СПЖ была в Группе 5-1, получавшей Ридостин и Тамифлю п/з ВГП, при этом она достоверно отличалась от показателей СПЖ во всех остальных группах, в том числе и в Группе 4-1, получавшей только Ридостин п/з ВГП, и в Группе 6-1, получавшей только Тамифлю п/з ВГП (таблица 4). Это дает основания полагать, что сочетанное введение Ридостина и Тамифлю п/з ВГП оказывает наиболее благоприятное действие на продолжительность жизни и % выживаемости мышей, инфицированных 10 ЛД₅₀ ВГ A/chicken/Kurgan/05/2005 по сравнению со всеми другими схемами введения исследованных (таблица 4).

Более того, КЗ в Группе 5-1 при совместном введении Ридостина и Тамифлю п/з ВГП был тоже наиболее высоким и составлял 53,3%, тогда как в Группе 4-1, получавшей только Ридостин п/з ВГП, КЗ был 6,7%, а в Группе 6-1, получавшей только Тамифлю п/з ВГП, КЗ достигал не более 23,3% (таблица 4).

Выводы

1. В контроле при заражении мышей 100 ЛД₅₀ ВГП выжило 0% мышей, при использовании для заражения 10 ЛД₅₀ ВГП выжило 10,0% мышей.

2. В группе, получавшей Ридостин и Тамифлю д/з 100 ЛД₅₀ ВГП, выжило 26,7% мышей, при использовании для заражения 10 ЛД₅₀ ВГП выжило 33,3% мышей, что достоверно выше контроля, но не отличается от групп, получавших только Ридостин д/з или только Тамифлю д/з, и свидетельствует об отсутствии повышения профилактического эффекта при совместном применении Ридостина и Тамифлю при гриппе.

3. В группе, получавшей Ридостин и Тамифлю п/з 100 ЛД₅₀ ВГП выжило 33,3% мышей, при использовании для заражения 10 ЛД₅₀ ВГП выжило 63,3% мышей, что превышает уровень выживаемости в контроле, а также в группах, получавших только Ридостин п/з или только Тамифлю п/з, и свидетельствует об усилении лечебной эффективности совместного применения Ридостина и Тамифлю при гриппе.

Пример. 4. Расчеты соотношения доз Ридостина и Тамифлю, рекомендованных для человека, при введении этих препаратов мышам

Пересчет соотношения дозы препарата для мыши и человека на основе данных [Трахтенберг И.М., Сова Р.Е., Шефтель В.О., Оникиенко Ф.А. Проблема нормы в токсикологии (Современные представления и методические подходы, основные параметры и константы).- Москва: Медицина, 1991. - 208 с.]:

Вводимую животному дозу препарата рассчитывают следующим образом:

D=d×k,

где D - доза, вводимая животному;

d - доза, вводимая человеку;

k - отношение коэффициентов соотношения поверхности тела и массы тела для человека и изучаемого вида животных.

Значения коэффициентов:

Человек: масса (m_ч) 70000 г, поверхность тела (S_ч) 18000 см², S_ч/m_ч~0,26.

Мышь: масса (m_м) 20 г, поверхность тела (S_м) 78 см²; S_м/m_м~3,9.

Коэффициент (k) соотношений S/m для мыши и человека:

k=3,9/0,26=15.

То есть можно считать, что интенсивность обмена веществ и скорость метаболизма введенного препарата у мыши массой 18-20 г приблизительно в 15 раз выше, чем у человека массой 70-75 кг. Таким образом, проведенные расчеты показывают, что, во всяком случае, 15-кратное превышение доз препаратов при введении мышам относительно доз тех же препаратов при введении человеку вполне допустимо и адекватно для характеризации и сравнения эффектов, вызываемых определенными препаратами у мышей и человека.

Расчеты соотношения доз Ридостина

Рекомендованная в инструкции инъекционная доза Ридостина для человека: 1 раз в день по 8 мг, две инъекции с интервалом 2 сут. Для человека массой 70-75 кг однократная доза Ридостина составляет ~ 0,1 мг/кг. Соответственно, эта доза Ридостина для мыши массой 18-20 г может быть увеличена вплоть до ~ 1,5 мг/кг.

В наших экспериментах Ридостин применяли в дозе 5 мг/кг массы мыши, что в пересчете для человека было в 3 раза больше дозы, рекомендованной в инструкции по использованию Ридостина для лечения гриппа у человека.

Расчеты соотношения доз Тамифлю

Рекомендованная в инструкции пероральная доза Тамифлю для человека: 2 раза в день по 75 мг на человека в течение 5 сут. Для человека массой 70-75 кг однократная доза Тамифлю составляет ~ 1 мг/кг. Соответственно, эта доза Тамифлю для мыши массой 18-20 г может быть увеличена вплоть до ~ 15 мг/кг.

В наших экспериментах Тамифлю применяли в дозе 5 мг/кг массы мыши, что в пересчете для человека было в 3 раза меньше дозы, рекомендованной в инструкции по использованию Тамифлю для лечения гриппа у человека.

Таким образом, заявляемый способ профилактики и лечения вирусных заболеваний, вызванных современными штаммами субтипа H5N1 вируса гриппа птиц, обладает более высокой эффективностью, пониженной токсичностью и хорошей переносимостью за счет использования препарата индуктора интерферона Ридостин при профилактике заболеваний и при лечении совместным применением Ридостина с ингибитором нейраминидазы Тамифлю и создания более оптимальной схемы их введения в организм.

1. Способ профилактики заболеваний, вызванных вирусом гриппа птиц A/H5N1, с использованием индуктора интерферона, включающий введение в организм препарата индуктора интерферона, отличающийся тем, что в качестве индуктора интерферона используют препарат Ридостин, который вводят в организм в виде инъекций в диапазоне доз от 0,05 до 0,5 мг/кг 1 раз в сутки и далее через 1 и 3 суток после первого введения Ридостина.

2. Способ лечения заболеваний, вызванных вирусом гриппа птиц A/H5N1, с использованием индуктора интерферона и ингибитора нейраминидазы, включающий введение в организм препарата индуктора интерферона и ингибитора нейраминидазы озельтамивира, отличающийся тем, что в качестве индуктора интерферона используют препарат Ридостин, который вводят в организм в виде инъекций в диапазоне доз от 0,05 до 0,5 мг/кг 1 раз в сутки в день инфицирования и ингибитор нейраминидазы озельтамивир перорально в диапазоне доз от 0,2 до 2 мг/кг 2 раза в сутки в течение 5-7 суток после инфицирования вирусом гриппа A/H5N1.