Способ определения относительного содержания сульфатированных форм гликозидов в препаратах из голотурий



Способ определения относительного содержания сульфатированных форм гликозидов в препаратах из голотурий
Способ определения относительного содержания сульфатированных форм гликозидов в препаратах из голотурий

 


Владельцы патента RU 2410673:

Учреждение Российской академии наук Тихоокеанский институт биоорганической химии Дальневосточного отделения РАН (ТИБОХ ДВО РАН) (RU)

Использование: для определения относительного содержания сульфатированных форм гликозидов в препаратах из голотурий. Сущность: заключается в том, что определение проводят без разделения смеси гликозидов из данных ЯМР-эксперимента HSQC и при значении параметра τ2 (временная задержка между 180° и 90° импульсами), определяемого из соотношения 2τ2=1/(31JCH), где 1JCH - константа спин-спинового взаимодействия между замещенным углеродом и его протоном, затем измеряют объемные интенсивности соответствующих протонам при замещенных углеродах кросс-пиков, и из получившихся значений вычисляют процентное содержание компонентов смеси путем составления и решения системы линейных уравнений. Технический результат: обеспечение возможности анализа смеси гликозидов без их предварительного разделения на моно-, ди- и трисульфатированные гликозиды. 2 ил., 1 табл.

 

Изобретение относится к нетривиальным методам анализа смесей физиологически активных тритерпеновых гликозидов, которые могут быть использованы в химико-фармацевтической и пищевой промышленности для контроля качества биопрепаратов и биологически активных добавок к пище на их основе.

Анализ методов, применяемых для определения степени сульфатирования гликозидных препаратов, показал следующее. Обычно используют химические методы анализа, которые позволяют оценить содержание сульфатных групп в процентах [Archer Е.Е. // Analyst, 1956. V.81, N 960, р.181-182; Gassner К. // Anal. Chem. 1956, V.152, N 6, p.420-424]. Однако эти методы имеют существенный недостаток. При значениях этого показателя, немного превышающих теоретически рассчитанные показатели, не возможно по данным анализа установить, является ли это превышение следствием присутствия примесей дисульфатированных гликозидов (что допустимо), следствием присутствия трисульфатированных гликозидов (что недопустимо, при их содержании выше 9%) или же в препарате имеются примеси и тех, и других соединений (что также недопустимо при их совместном содержании выше 20%). С помощью химического анализа невозможно даже приблизительно оценить количественное содержание таких примесей.

Еще одним методом анализа, который обычно используют, является тонкослойная хроматография. В самом деле, ди- и трисульфатированные примеси можно обнаружить с помощью тонкослойной хроматографии. Однако этот метод является качественным и не позволяет судить о количественном содержании таких примесей в исследуемых препаратах.

В настоящее время единственным методом оценки количественного содержания сульфатных групп является жидкостная хроматография [Кошелева Л.П., Глебко Л.И. Химия природн. Соединений. 1977, №4, С.500-502; Авилов С.А., Стоник В.А., Калиновский А.И. Химия природн. соединений. 1990, №6, С.787-792]. Метод заключается в разделении компонентов смеси на соответствующей хроматографической колонке с последующим концентрированием элюата и взвешиванием полученных фракций. К недостаткам этого метода следует отнести трудоемкость, длительность процедуры, не всегда полное разделение соответствующих фракций и низкую точность результатов из-за частичной необратимой сорбции некоторых компонентов смеси на твердой фазе.

Известно, что съедобные голотурии рода Cucumaria, в частности Cucumaria japonica и родственных видов, содержат исключительно сложные смеси физиологически активных тритерпеновых гликозидов, отличающиеся друг от друга, прежде всего, степенью сульфатирования углеводных цепей (фиг.1). Все эти гликозиды можно разделить на три группы: 1) моносульфатированные гликозиды, проявляющие иммуностимулирующие свойства; 2) дисульфатированные гликозиды, не активные в отношении иммунной системы; и 3) трисульфатированные гликозиды, обладающие иммуносупрессорными свойствами. Таким образом, моно- и трисульфатированные гликозиды из этих беспозвоночных проявляют антагонистические действия в отношении иммунной системы человека и животных.

Фракция моносульфатированных гликозидов является биологически активной субстанцией иммуностимулирующего препарата Кумазид, предложенного для коррекции иммунодефицитных состояний человека [RU 2271820 C1, 20.03.2006]. Даже очень низкие концентрации этих сравнительно малополярных гликозидов из Cucumaria japonica после их перорального введения увеличивают активность макрофагов, число антитела-образующих клеток и эффективность вакцинирования [Aminin DL et al. J. Med. Food. 2001, V.4, N 3, P.125-131; Agafonova IG et al., J. Agr. Food Chem., 2003, V51, P. 6982-6986]. Однако присутствие в кумазиде и других препаратах этой серии примесей трисульфатированных гликозидов значительно ухудшает их качество, а при высоких концентрациях этих веществ (более 10-15%) может полностью нивилировать их положительное действие и даже ухудшить состояние больных с иммунодефицитами, получающих такие препараты. Поэтому определение содержания трисульфатированных гликозидов в препаратах, полученных из голотурий рода Cucumaria, является принципиально важным и устанавливает качественные характеристики таких препаратов. При отсутствии трисульфатированных соединений в них их качество является высоким, при наличии таких примесей - оно тем ниже, чем больше трисульфатированных гликозидов в таких препаратах. В кумазиде такие примеси должны отсутствовать или не превышать 9%.

Задача настоящего изобретения - разработка способа определения относительного содержания моно-, ди- и трисульфатированных гликозидов в препаратах, полученных из голотурий.

Поставленная задача решена применением двумерной ЯМР-спектроскопии для определения соотношения моно-, ди- и трисульфатированных гликозидов в препаратах из голотурий. В доступной патентной и другой научно-технической литературе не обнаружено использование данного метода для решения указанной задачи изобретения.

Основным преимуществом заявляемого способа перед известным является возможность анализа смеси гликозидов без их предварительного разделения на моно-, ди- и трисульфатированные гликозиды. Заявляемый способ основан на использовании эксперимента HSQC (Heteronuclar Single Quantum Coherence) из арсенала методов спектроскопии двумерного ядерного магнитного резонанса (ЯМР). Как показано в работе J.Cavangh, W.R.Fairbroter, A.G.Palmer lll, N.J.Shelton. Protein NMR Spectroscopy. Principles and Practice. Academic Press. 1996, p.420, относительная интенсивность резонанса спина I (протон) в InS (S - углерод 13C) - спиновой системе в базовом HSQC-эксперименте (с использованием двойного INEPT (Insensitive Nuclei Enhaced by Polarization Transfer) зависит от величины τ2 (временная задержка между 180° и 90° импульсами) и имеет значения 0.87 и 0.86 для n=1 и n=2 соответственно при компромиссном значении 2τ2=1/(3 1JIS) (J - константа спин-спинового взаимодействия протона I и углерода S, для 1JCH=135 Гц, 2τ2=2.5 мс).

Таким образом, для количественного анализа требуется измерить относительные объемы соответствующих кросс-пиков в двумерном HSQC-спектре, снятом с учетом вышеприведенного обсуждения параметров съемки. Для успешного анализа необходимо разделение кросс-пиков в измерениях F1 (химические сдвиги углеродов) и F2 (химические сдвиги протонов) (см ниже).

Тритерпеновые гликозиды (кукумариозиды) имеют весьма характерные спектры [Авилов С.А., Стоник В.А., Калиновский А.И. Химия природн. соединений. 1990. №6. С.787-792. Drozdova О.А., Avilov S.A., Kalinin V.L, Kalinovsky A.I., Stonik V.A. Riguera R., Jimenez C. Liebigs Ann. 1997, P.2351-2356. Дроздова O.A., Авилов C.A. Калиновский A.M., Стоник В.А., Мильгром Ю.М., Рашкес Я.В. Химия природн. соединений. 1993, №3, С.369-374].

Анализ всех известных структур тритерпеновых гликозидов из голотурий голотурий рода Cucumaria, показал, что все моносульфатированные гликозиды содержат сульфат при C14 (1 - номер моносахарида в углеводной цепи, во всех случаях это β-ксилоза, 4 - положение сульфатной группы в моносахаридном кольце). В спектрах дисульфатированных гликозидов имеются дополнительные сигналы, обусловленные наличием еще одной сульфатной группы при C-6 в глюкозном остатке, а в трисульфатированных соединениях - два набора таких сигналов, поскольку в этих соединениях сульфатные группы находятся при C-6 двух глюкозных остатков. Во всех изученных нами спектрах (более 20 соединений) протоны при углеродных атомах, несущих сульфатные группы, резонировали при 5.19-5.10 м.д. (H14) и 5.30-4.70 м.д. (H3,4,56), а соответствующие углеродные атомы, соединенные с сульфатами, - при 75.6-76.1 м.д. (ксилозные остатки) и 66.9-68.0 м.д. (глюкозные остатки). Таким образом, эти сигналы были разделимы в обоих измерениях в спектрах, снятых в растворе дейтеропиридина (C5D5N) и воды (D2O) 4:1.

Примеры углеводных цепей моно-, ди- и трисульфатированных соединений, принадлежащих к этой группе соединений, даны на фиг.1.

Таким образом, установленные ранее закономерности сульфатирования для этой группы соединений показывают, что в дисульфатированных производных имеется одна метиленовая группа, соединенная с сульфатом, а в трисульфатированных производных - две таких группы. Соответственно наличие двух сигналов таких групп в ЯМР-спектрах указывает на присутствие трисульфатированных гликозидов и позволяет, таким образом, быстро выполнить качественный анализ, показывающий, имеются или нет примеси таких соединений в исследуемых образцах. Для количественного анализа необходимо использовать сравнительные интенсивности сигналов, химический сдвиг, которых изменился за счет соседства сульфатных групп, а в двумерных спектрах - абсолютные объемы кросс-пиков.

В таблице приведены абсолютные объемы кросс-пиков (в условных единицах) из рутинных HSQC-спектров чистых образцов гликозидов голотурий различного строения, полученных при значении τ2=1.8 мс.

На фиг.2(а-г) приведены частичные HSQC-спектры представителей этих групп соединений.

Таблица
Объемные интенсивности кросс-пиков протонов при углеродных атомах, несущих сульфатные группы, в HSQC-спектрах некоторых гликозидов голотурий
Голоту-
рия
Achlionice violaecuspidate Stauracucumis liouvillei Cucumaria Frondosa
Гли-козид Разветвленный пентаозид [1] Линейный тетраозид [2] Разветвленный пентаозид [3]
Назв. A3 A2 A1 A3 A2 B2 B1 A1 * ** *** A7-1
H36 7.78 4.74 5.76 8.69 3.33 7.65 2.38 8.49 3.00 3.59 2.02 8.17
H56 8.12 5.54 6.33
H,36,56 18.4 12.6 12.5
H14 8.93 3.08 7.93 1.80 8.27 1.84 3.47 1.75 8.50
H,36 9.53 4.06 9.12 2.10 9.71 1.67
H46 9.15 2.62 3.22 4.83 10.8
H,46 9.95 2.39
H,36,46 4.93 8.60 21.3
[1] A.S.Antonov, S.A.Avilov, A.I.Kalinovsky, S.D.Anastyuk, P.S.Dmitrenok, V.I.Kalinin, S.Taboada, A.Bosh, C.Avila, V.A.Stonik. Journal of Natural Products. 2009, V.72, P.33-38.
[2] A.S.Antonov, S.A.Avilov, A.I.Kalinovsky, S.D.Anastyuk, P.S.Dmitrenok, E.V.Evtushenko, V.I.Kalinin, A.A.Smirnov, S.Taboada, M.Ballesteros, CAvila, V.A.Stonik. Journal of Natural Prodacts. 2008, V.71, P.1677-1685.
[3] A.S.Silchenko, S.A.Avilov, A.I.Kalinovsky, P.S.Dmitrenok, V.I.Kalinin, J.Morre, M.L.Deinzer, C.Woodword, P.D.Collin. Canadian Journal of Chemistry. 2007, V.85, P.626-636.
*, **, *** Гликозиды, не вошедшие в публикацию [3].

Как следует из таблицы, средняя точность определения составляет 7% для первой группы соединений, и 8.2% и 11.2% для второй и третьей групп соответственно. Такой разброс данных может быть связан как с процессами спиновой релаксации при прохождении импульсной последовательности, которые не учитывались в нашем анализе, так и с различиями в других параметрах съемки спектров. Кроме того, точность определения будет зависеть от соотношения сигнал/шум в двумерном спектре и от надлежащего выбора других параметров съемки спектра.

Изобретение иллюстрируется следующим примером конкретного выполнения.

Пример. На анализ поступил образец препарата кумазид, представляющий собой смесь высокополярных гликозидов, полученную из голотурии Cucumaria japonica. Известно, что гликозиды этой голотурии являются сульфатированными, разветвленными и принадлежат в основном к моносульфатированным гликозидам пентаозидам [Avilov S.A., Kalinin V.I., Smirnov A.V. Biochem. Syst. Ecol. 2004, V.32, Р.735-745]. Они все сульфатированы по положению C14. Требовалось установить в них процентное содержание гликозидов, дополнительно сульфатированных и по положениям C36 и C46, поскольку они снижали биологическую активность препарата. Диагностическая часть HSQC-спектра 5 мг смеси, снятого в течение 12 часов в C5D5N, приведена на фиг.2г.

Кросс-пик при 76.0 м.д/5.07 м.д. содержит сигнал H14 от всех трех форм гликозидов (объемная интенсивность 6.89 условных единиц - 100%). Кросс-пик при 68 м.д./5.20 м.д. содержит сигнал от двух протонов при C6 от трисульфатированных форм и сигнал от одного протона при C6 от дисульфатированных форм (объемная интенсивность 1.97). Кросс-пик при 68 м.д./4.50 м.д. содержит по одному сигналу протонов при C6 от трисульфатированных и дисульфатированных форм (объемная интенсивность 1.42). Из уравнений:

T+D+M=6.89, 2T+D=1.97, T+D=1.42,

получаем, что содержание трисульфатированных гликозидов составляет 8±1%, дисульфатированных 12.6±2%. Ошибку берем из табличных данных (таблица 1) по родственным гликозидам (Cucumaria frondosa).

Хроматографический анализ дал суммарное значение содержания трисульфатированных и дисульфатированных гликозидов 15%, что удовлетворительно согласуется с полученными нами значениями.

Способ определения относительного содержания сульфатированных форм гликозидов в препаратах из голотурий, характеризующийся тем, что определение проводят без разделения смеси гликозидов из данных ЯМР-эксперимента HSQC и при значении параметра τ2 (временная задержка между 180° и 90° импульсами), определяемого из соотношения
2=1/(31JCH),
где 1JCH - константа спин-спинового взаимодействия между замещенным углеродом и его протоном, затем измеряют объемные интенсивности соответствующих протонам при замещенных углеродах кросс-пиков и из получившихся значений вычисляют процентное содержание компонентов смеси путем составления и решения системы линейных уравнений.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к области совершенствования комплекса технических средств обнаружения ВВ, состоящего из рентгено-телевизионного интроскопа и обнаружителя ВВ с применением эффекта ядерного квадрупольного резонанса (ЯКР), в частности к системам обеспечения безопасности пассажирских авиаперевозок.

Изобретение относится к области геологии, геохимии, нефтепереработке и нефтехимии, а именно к определению содержания жидкофазных и твердотельных компонент в смеси углеводородов.

Изобретение относится к области применения ядерного магнитного (ЯМР) и ядерного квадрупольного (ЯКР) резонансов для обнаружения веществ, содержащих атомы, ядра которых обладают квадрупольным моментом.

Изобретение относится к способам определения прочностных характеристик твердых углеродсодержащих веществ, в частности металлургического кокса, полученного в коксовых печах в промышленных условиях при температуре 1000-1100°С.

Изобретение относится к области магнитных измерений, а именно к способам измерения намагниченности коллоидных парамагнитных растворов (магнитных жидкостей) с использованием метода ядерного магнитного резонанса (ЯМР), и может быть использовано для контроля качества магнитных жидкостей при их производстве и в процессе их эксплуатации.

Изобретение относится к области практического применения импульсных ЯМР-спектрометров для экспрессного определения содержания масла и воды в жмыхах и шротах, которые являются продуктами переработки семян масличных культур.

Изобретение относится к области эксплуатации нефтяных месторождений, конкретно - к области информационно-аналитического контроля и оптимизации разработки залежей нефти на основе промыслово-геофизических исследований пластовых флюидов методикой/техникой ядерного магнитного резонанса (ЯМР).

Изобретение относится к области радиоспектроскопии и может быть использовано для определения реологических параметров жидких кристаллов, растворов полимеров и других анизотропных жидкостей.

Изобретение относится к резонансной радиоспектроскопии, в частности к применению метода ядерного магнитного резонанса (ЯМР) для оперативного контроля концентраций непрозрачных, трудно определяемых другими методами компонентов и отдельных органических соединений в их смесях, в частности асфальтенов, смол и парафинов в нефтях и топливах - нефтяных остатках

Изобретение относится к области определения пористости материалов, веществ и минералов на основе применения методик Ядерного Магнитного Резонанса (ЯМР) (включая нанопористость)

Изобретение относится к области нефтехимии, в частности к способам определения молекулярно-массового распределения парафинов в смеси углеводородов, например нефти

Изобретение относится к способу получения пространственно-частотных спектров для конкретных мест в 3D образце с использованием модификаций современных техник МРТ для локализованной спектроскопии ЯМР

Изобретение относится к области расходометрии, в частности к способам измерения скорости потока и/или расхода многофазных текучих сред, представляющих собой мелкодисперсную или недиспергированную смесь газа и многосоставной жидкости (например, смесь газа, нефти и воды)

Изобретение относится к радиоспектроскопии ядерного магнитного (ЯМР), ядерного квадрупольного (ЯКР), электронного парамагнитного (ЭПР) резонансов и может быть использовано при анализе структуры и динамики молекул, процессов обмена, переноса намагниченности, интенсивности и характерных траекторий движения

Изобретение относится к измерительной технике и может быть использовано для определения вертикального распределения гидрологических характеристик в море при океанологических исследованиях и при решении прикладных задач в обеспечение безопасной эксплуатации морских объектов хозяйственной деятельности, включая морские добычные комплексы углеводородов

Изобретение относится к масложировой промышленности и может быть использовано для определения содержания олеиновой кислоты в оливковом масле
Наверх