{3,5-диоксо-4-азатетрацикло[5.3.2.02,6.08,10]додец-11-ен-4-ил}тиомочевина, обладающая противовирусной активностью в отношении ортопоксвирусов

Изобретение относится к новому соединению - {3,5-диоксо-4-азатетрацикло[5.3.2.0^2,6.0^8,10]додец-11-ен-4-ил}тиомочевине формулы I:

которое проявляет противовирусную активность в отношении ортопоксвирусов. Соединение получают реакцией тиосемикарбазида с 4,4а,5,5а,6,6а-гексагидро-4,6-этено-1Н-циклопроп[f]изобензофуран-1,3(3аН)-дионом в уксусной кислоте при кипячении. Выход 93%. 2 табл.

 

Изобретение относится к новым биологически активным химическим соединениям, обладающим противовирусной активностью, может применяться в медицине и ветеринарии для лечения и профилактики заболеваний, вызываемых патогенными для человека и животных вирусами, в частности ортопоксвирусами.

Наиболее опасными для человеческой популяции из-за чрезвычайно высокой патогенности, многообразия и эпидемиологических показателей являются вирусы рода ортопоксвирусов (семейство Poxviridae, род Orthopoxvirus). В последние годы неожиданную остроту и актуальность приобрела проблема натуральной оспы, поскольку вакцинация населения с 1980 г. не проводится, появилась значительная прослойка населения без иммунитета или с ослабленным иммунитетом и отсутствуют гарантии полного исчезновения возбуждающих это заболевание вирусов, а также потенциальной возможности несанкционированной утечки вирусного материала из мест его официального хранения. Более того, в условиях постоянного роста категорий населения с иммунодефицитными состояниями сама идея вакцинации живым вирусом осповакцины становится проблематичной, и весьма важное значение приобретает задача успешного купирования поствакцинальных осложнений, а также вспышек заболеваний, вызванных другими ортопоксвирусами, патогенными для человека, с помощью высокоэффективных химиотерапевтических препаратов. Хорошо известна высокая патогенность вирусов оспы обезьян, оспы коров, относящихся к тому же роду Orthopoxvirus и способных вызывать заболевание у людей со смертельным исходом. Так, в последнее время в Африке, особенно в районах с высоким процентом ВИЧ-инфицированных отмечаются вспышки оспы обезьян (летальность достигает 10-20%). Широкое распространение вируса оспы обезьян по территории США в 2003 году посредством луговых собачек также показывает совершенно необычный эпидемический потенциал ортопоксвирусов. Кроме того, существует реальная возможность селекции новых вариантов ортопоксвирусов в природных условиях, а также создания новых генетических вариантов ортопоксвирусов с необычными свойствами. Возможность такого подхода была продемонстрирована в лабораторных условиях для маловирулентного штамма вируса оспы мышей, который после генетических манипуляций стал патогенным для этих животных.

В настоящее время фактически отсутствуют эффективные средства специфической профилактики и лечения заболеваний, вызываемых вирусами рода ортопоксвирусов, поэтому поиск и создание высокоэффективных противовирусных препаратов, обладающих высокой активностью, низкой токсичностью и продолжительным действием в отношении ортопоксвирусов, является важной задачей для обеспечения безопасности здоровья и жизни людей.

Предшествующий уровень техники

Известен препарат метисазон (выпускается также под названиями Кемовиран (Kemoviran); Марборан (Маr-Boran); Вирузон (Viruzon)), который обладает невысокой профилактической активностью в отношении вируса натуральной оспы.

Известен препарат цидофовир (Vistide^®), который проходит в настоящее время исследования как профилактический или лечебный препарат, но пока его исследования не закончены. На фармацевтическом рынке в настоящее время практически нет препаратов, активных в отношении вирусов группы оспы, в этой связи разработка таких веществ может стать важным шагом в обеспечении фармакологической безопасности жизни людей.

Известно, что производные адамантана являются потенциальными источниками веществ с противовирусными свойствами. В частности, ингибиторы вируса осповакцины выявлены в ряду адамантоил-1-гидразинов (Гужова С.В., Даниленко Г.И., Коробченко Л.В., Денисова Л.В., Андреева О.Т., Бореко Е.И., Даниленко В.Ф., Баклан В.Ф. Ингибиторы вируса вакцины в ряду адамантоил-1-гидразинов // Физиол. Активн. В-ва. Киев: Наукова думка. 1986. Вып.18. С.24). Изомерные 1-(аминобензоил)аминоадамантаны наряду с действием на различные типы вирусов проявляют умеренную активность в отношении вируса осповакцины (Вотяков В.И., Андреева О.Т., Кицара М.С. и др. // В сб.: Физиологически активные вещества. Киев. 1978. Вып.10. С.88). Опубликованы данные о выраженном ингибирующем действии на размножение вирусов осповакцины замещенных аминоацетиладамантиламинов, аминоалкоксиацетиладамантиламинов и тромантадина (May G., Peteri D. // Arzneimitt. Forsch. 1973. Bd.23. N.5. S.718). Широкий ряд гидрокси-, азотсодержащих и серусодержащих функциональных производных адамантанового ряда проявил слабую и умеренную степень активности против вируса осповакцины (Климочкин Ю.Н., Леонова М.В., Коржев И.Р., Моисеев И.К., Владыко Г.В., Коробченко Л.В., Бореко Е.И., Николаева С.Н. // Хим.-фарм. журнал. 1992. N.7-8. С.58; Климочкин Ю.Н., Моисеев И.К., Владыко Г.В., Коробченко Л.В., Бореко Е.И. // Хим.-фарм. журнал. 1991. Т.25. N.7. С.46; Климочкин Ю.Н., Моисеев И.К., Абрамов О.В., Владыко Г.В., Коробченко Л.В., Бореко Е.И. // Хим.-фарм. ж. 1991. Т.25. N.7. С.49).

Недостатком вышеперечисленных аналогов является невысокая активность соединений в отношении вируса осповакцины.

Среди производных адамантана известно биологически активное соединение 1-адамантаноилгидразон α-азидометил(1-адамантил)кетона (прототип), обладающее противовирусной активностью в отношении вируса осповакцины (авторское свидетельство СССР №1568481, МПК C07D 253/06, опубл. 2006).

Однако указанное соединение не изучалось на предмет противовирусной активности в отношении вируса оспы коров, вируса оспы обезьян, оспы мышей и ряда других ортопоксвирусов. К недостаткам этого соединения следует отнести также и недостаточно высокую эффективность в отношении вируса осповакцины.

Известны 3-фенил-6-R₁-7-R₂-1,2,4-бензотриазины (соединение СК-29 и его производные), обладающие противовирусной активностью, в частности, в отношении ортопоксвирусов, патогенных для человека (патент РФ №2252218, МПК C07D 253/10, A61K 31/53, опубл. 20.05.2005) [1]. Однако и эти химические соединения обладают недостаточной противовирусной активностью и невысоким индексом селективности в отношении ортопоксвирусов.

Наиболее близким аналогом (прототипом) является химическое соединение 4-трифторметил-N-(3,3a,4,4a,5,5a,6,6a-октагидро-1,3-диоксо-4,6-этеноциклопроп[f]изоиндол-2(1H)-ил)бензамид (ST-246), обладающее противовирусной активностью в отношении ортопоксвирусов с высоким индексом селективности (заявка США №20060235051, МПК A61K 31/4439, C07D 403/02, опубликовано 19.10.2006 г.) [2]. Указанное химическое соединение имеет достаточно сложную двухстадийную технологию получения, что повышает стоимость получения данного продукта.

Другим важным обстоятельством является то, что опыт использования различных противовирусных средств показывает (а) необходимость использования комбинации нескольких препаратов для повышения эффективности лечения вирусной инфекции и (б) легкость появления новых вариантов вирусов, устойчивых к действию монопрепарата. Это привело к тому, что для лечения ряда вирусных заболеваний, например ВИЧ-инфекции, используются одновременно 3-5 различных препаратов. Причем рекомендуется последовательное использование нескольких таких смесей для достижения максимального терапевтического эффекта и для предупреждения появления новых лекарственно устойчивых вариантов патогенных вирусов. Исследование прототипа заявления [2] показало, что лекарственно устойчивые к ST-246 ортопоксвирусы возникают чрезвычайно легко. Это является одним из существенных недостатков прототипа заявления. Преодолеть этот недостаток возможно только через создание новых высокоэффективных антивирусных препаратов для комплексной терапии ортопоксвирусных инфекций несколькими противовирусными препаратами.

Техническим результатом предлагаемого изобретения является получение нового химического соединения, имеющего более простую (одностадийную) технологию получения, обладающего высоким индексом селективности и противовирусным действием в отношении различных видов ортопоксвирусов, патогенных для человека, лабораторных и домашних животных. Технический результат достигается новым биологически активным органическим соединением - {3,5-диоксо-4-азатетрацикло[5.3.2.0^2,6.0^8,10]додец-11-ен-4-ил}тиомочевиной формулы I:

проявляющей противовирусную активность в отношении различных видов ортопоксивирусов, которая может найти применение в медицинской и ветеринарной практике в качестве препарата для лечения широкого спектра ортопоксвирусных инфекций человека, лабораторных и домашних животных. Соединение I получают взаимодействием тиосемикарбазида с 4,4а,5,5а,6,6а-гексагидро-4,6-этено-1H-циклопроп[f]изобензофуран-1,3(3aH)-дионом, взятыми в соотношении 1:1, в уксусной кислоте при кипячении в течение 6 ч по следующей схеме:

Сопоставительный анализ с аналогами показывает, что заявляемое соединение принципиально отличается тем, что является полициклическим, содержит в молекуле диацилированный тиосемикарбазидный фрагмент, концевой, гидразиновый атом азота которого является частью гетероциклической - изоиндольной структуры.

Пример 1. Получение {3,5-диоксо-4-азатетрацикло[5.3.2.0^2,6.0^8,10]додец-11-ен-4-ил}тиомочевины

Смесь 7.6 г (40 ммоль) 4,4а,5,5а,6,6а-гексагидро-4,6-этено-1H-циклопроп[f]изобензофуран-1,3(3aH)-диона и 4 г (44 ммоль) тиосемикарбазида кипятили в 60 мл уксусной кислоты в течение 6 часов. Сначала образовался гомогенный раствор, из которого примерно через 30 мин начал выпадать осадок. Суспензию после охлаждения до комнатной температуры растерли с 100 мл воды. Осадок отфильтровали, промыли на фильтре водой (5 раз по 25 мл), сушили на воздухе до постоянного веса. Получили 9.8 г (93%) вещества в виде белых кристаллов; т. пл. 202.9°C (этанол). ПМР (300 МГц, DMSO-d₆), δ, м.д.: 9.80 (уш. с, 1H), 8.14 (уш. c, 1H), 7.72 (уш. c, 1H), 5.67 (уш. т, J=3,2 Гц, 2H), 3.21 (уш. c, 2H), 3.05 (уш. c, 2H), 1.15 (уш. c, 2H), 0.22 (дт, J=5.4, 7.3 Гц, 1H), 0.01 (дт, J=5.4, 3.7 Гц, 1H). ЯМР ¹³C (300 МГц, DMSO-d₆), δ, м.д.: 4.70, 9.99, 27.96, 33.74, 44.24, 128.42, 175.99, 182.39. ИК-спектр (KBr), см^-1: 732, 1190, 1292, 1512, 1637, 1718, 1777, 2961, 3178, 3286, 3344, 3447. Вычислено, %: C, 54.00; H, 5.06; N, 15.74. C₁₂H₁₃N₃O₂S·0.2H₂O. Найдено, %: C, 53.98, 54.02; H, 5.02, 4.88; N, 15.16, 15.12.

Предложенный способ получения соединения I отличается от прототипа [заявка на пат. США №2006/0235051; T.R.Bailey, S.R.Rippin et al., J. Med. Chem., V.50, N 7, 1442 (2007)] тем, что реакция проводится при кипячении в уксусной кислоте, не требует абсолютных растворителей и использования третичных аминов в качестве катализаторов.

Способ получения заявляемого вещества прост в исполнении, исходные вещества доступны, выход составляет 93% от теоретически рассчитанного. Предлагаемое соединение устойчиво на воздухе, легко растворимо в диметилформамиде и диметилсульфоксиде, мало растворимо в алифатических спиртах, ацетоне, воде, практически нерастворимо в эфире, гексане.

Пример 2. Исследование противовирусной активности заявляемого соединения

Для оценки противовирусной активности соединений использовали следующую методику. Культуру клеток Vero выращивали в лунках плоскодонных 96-луночных планшетов. В культуральную среду добавляли серийные разведения исследуемых соединений и соответствующий вирус. После инкубирования в течение 3-5 суток монослой клеток прокрашивали витальным красителем нейтральным красным, после удаления красителя и отмывки избытка красителя вносили лизирующий раствор и количество красителя, включенного в монослой клеток, учитывали на спектрофотометре при длине волны 490 нм. В качестве контролей использовали лунки планшета, в которые вирус не вносили (контроль токсичности соединений), лунки, в которые вносили вирус без соединений (контроль вируса), и лунки, в которые не вносили ни вирус, ни соединения (контроль культуры клеток). Данная методика основана на способности тестируемых соединений предотвращать репродукцию вируса и его распространение от клетки к клетке, в связи с чем клетки не погибают и сохраняют способность фагоцитировать нейтральный красный. Результаты анализировали с помощью программы SoftMax (версия 4.0, Molecular Devices, Menlo Park, USA).

В качестве исследуемых вирусов использовали патогенный для человека вирус оспы коров (штамм Гришак) и вирус осповакцины, штамм ЛИВП, используемый для вакцинации населения. Помимо ортопоксвирусов, патогенных для человека, для оценки противовирусной активности использовали вирус эктромелии (оспы мышей), штамм К-1.

Анализ полученных данных наглядно показывает, что заявляемое соединение (НИОХ-3) и соединение-прототип (ST-246) обладают высоким противовирусным действием, в частности, в отношении ортопоксвирусов, патогенных для человека.

Как видно из данных таблицы 1, исследованные соединения (заявляемое НИОХ-3 и прототип ST-246) эффективно подавляют размножение ортопоксвирусов в культуре клеток: ингибируют размножение трех различных видов ортопоксвирусов в концентрациях 0,616-3,13 и 0,003-0,003 мкг/мл соответственно, значения которых для препарата НИОХ-3 по величине схожи с препаратом-аналогом [1] на основе производных бензотриазинов, активная концентрация которого составляет 0,49-2,23 мкг/мл.

Таблица 1
Сравнение активности препаратов НИОХ-3 (заявляемое соединение), ST-246 (прототип) и СК-29 (аналог)
Препарат	Токсичность для культуры клеток Vero (ТС50, мкг/мл)	Ингибирующая активность (IC50, мкг/мл) в отношении вирусов	Индекс селективности для вируса осповакцины
Осповакцины	Оспы коров	Оспы мышей
НИОХ-3, заявляемый	>100	0,616	3,13	1,24	>164
ST-246,прототип [2]	>100	0,003	0,002	0,003	>30000
СК-29, аналог [1]	>300	0,5	2,23	0,49	От 134 до 600
НИОХ-35, отрицательный контроль	>100	>100	>100	>100	1

Таким образом, технический результат изобретения подтверждается тем, что заявляемое соединение - {3,5-диоксо-4-азатетрацикло[5.3.2.0^2,6.0^8,10]додец-11-ен-4-ил}тиомочевина (I) - проявляет высокую противовирусную активность по отношению к различным видам ортопоксвирусов и отличается от прототипа [заявка на патент США №2006/0235051] тем, что является полициклическим, содержит в молекуле диацилированный тиосемикарбазидный фрагмент, концевой, гидразиновый атом азота которого является частью гетероциклической - изоиндольной структуры, а также имеет более простую (одностадийную) технологию получения препарата.

Пример 3. Оценка противовирусной активности препарата НИОХ-3 по отношению к вирусам: аденовирус человека 5-го серотипа, эховирус 12-го типа, вирус Западного Нила и вирус простого герпеса 2-го типа

Оценку противовирусной активности исследуемых соединений проводили на культурах клеток АД293 (аденовирус человека 5-го серотипа и эховирус 12-го типа) и Vero (вирус Западного Нила и вирус простого герпеса 2-го типа) в 96-луночных планшетах. IC₅₀ соединений в отношении вышеуказанных вирусов определяли посредством регистрации ингибирования вирусиндуцированного цитопатического эффекта в присутствии различных концентраций исследуемых препаратов (конечные концентрации в лунках микропланшета с клеточным монослоем 80, 40, 20, 10 и 5 мкг/мл). После добавления к клеткам исследуемых соединений в вышеуказанных концентрациях проводили инфицирование клеток различными вирусами. Для этого использовали инфицирующие дозы каждого вируса, вызывающие 90% цитопатический эффект через трое суток после инфицирования. После инкубации клеток в планшетах в течение 72 ч при 37°C в атмосфере, содержащей 5% CO₂, клетки фиксировали 5% раствором глутарового альдегида. Цитопатический эффект визуализировали окрашиванием клеток 0.1% раствором кристаллического фиолетового и регистрировали спектрофотометрически при 570 нм. IC₅₀ рассчитывали согласно G. Yang et al., 2005.

Результаты, представленные в таблице 2, показали, что соединение НИОХ-3 фактически не ингибирует репликацию эховируса 12-го типа, аденовируса человека 5-го серотипа, вируса Западного Нила и вируса простого герпеса 2-го типа. Препарат использовался в субтоксических концентрациях для этого типа клеток, что также дополнительно подтверждает нетоксичность препарата для клеток АД293. Фактическое отсутствие активности препарата НИОХ-3 в отношении двух типов ДНК-содержащих вирусов и двух типов РНК-содержащих вирусов говорит о том, что механизм действия препарата не связан с типом нуклеиновой кислоты.

Таблица 2
Противовирусная активность соединения НИОХ-3 in vitro
Препарат	Ингибирующая активность (IC50, мкг/мл) в отношении вирусов
Аденовирус человека 5-го серотипа	Эховирус 12-го типа (шт. Lev4)	Вирус Западного Нила (шт. Eg101)	Вирус простого герпеса 2-го типа (шт. MS)
НИОХ-3	>80.0	>80.0	>80.0	>80.0
Производное глицеризиновой кислоты C19H63N2O3	>20.0	>20.0	>80.0	>80.0

Для препарата НИОХ-3 IC₅₀ в отношении вируса осповакцины составляет 0.616 мкг/мл (таблица 1), что показывает высокую специфичность действия препарата в отношении ортопоксвирусов и свидетельствует о высокой степени селективности препарата НИОХ-3 в отношении этой группы вирусов. Индекс селективности составил не менее 139 для всех исследованных вирусов и вируса осповакцины.

Таким образом, технический результат изобретения дополнительно подтверждается тем, что препарат НИОХ-3 при низкой токсичности для клеток млекопитающих еще обладает выраженной селективностью по отношению к ортопоксвирусам и не ингибирует репликацию других РНК- и ДНК-содержащих вирусов.

{3,5-Диoкco-4-aзaтeтpaциклo[5.3.2.0^2,6.0^8,10]дoдeц-11-eн-4-ил}тиoмoчeвинa формулы I:

обладающая противовирусной активностью в отношении ортопоксвирусов.