Способ очистки почвы и поверхностей твердых объектов от загрязнений нефтью и нефтепродуктами

Изобретение относится к биотехнологии и касается способов очистки почвы и поверхностей твердых объектов от загрязнений нефтью и нефтепродуктами. Способ включает обработку загрязненного объекта микробным препаратом, состоящим из смеси природных углеводородокисляющих культур микроорганизмов, выделенных методом селекции из природного сообщества микроорганизмов. Используют препарат на основе сообщества микроорганизмов, обитающих на морских бурых водорослях, по крайней мере, одного биологического рода, и очищаемый объект дополнительно обрабатывают водой и биогенной добавкой. Изобретение позволяет повысить скорость и эффективность очистки твердых объектов от нефти и нефтепродуктов даже при повышенной концентрации соли и относительно низкой температуре, в том числе в районах с коротким тепловым периодом. 3 з.п. ф-лы.

 

Изобретение относится к области экологии, прикладной, а также биотехнологии и касается способов очистки твердых объектов от нефти и нефтепродуктов с помощью биологических препаратов.

Известен способ очистки твердого объекта (почвы) от нефти и нефтепродуктов путем ее обработки консорциумом штаммов микроорганизмов Bacillus brevis и Arthrobacter species (патент RU №2232806, МПК C12N 1/20, 2002).

Известен способ очистки твердого объекта (почвы) от нефти и нефтепродуктов путем ее обработки ассоциацией штаммов бактерий, продуцирующих биоэмульгаторы (патент RU №2312891, МПК C12N 1/20, 2006).

Наиболее близким к заявляемому является известный способ очистки твердых объектов от нефти и нефтепродуктов путем обработки загрязненного объекта (почвы) микробным препаратом, состоящим из смеси природных углеводородокисляющих (УВ) культур микроорганизмов, выделенных методом селекции из природного сообщества микроорганизмов (патент RU №2057724, МПК C02F 3/34, 1994) - прототип. В данном способе микробный препарат выделяют из природного сообщества микроорганизмов, обитающего в загрязненной нефтью или нефтепродуктами твердом объекте (почве) и селекцию культур микроорганизмов проводят традиционным методом в присутствии смеси питательной водной среды, содержащей, по крайней мере, соединения азота, фосфора, калия и магния с нефтью или нефтепродуктом.

Недостатками известного способа являются его относительно невысокие скорость и эффективность очистки загрязненных твердых объектов от нефти и нефтепродуктов, а также узкая область его применения только для очистки загрязненной нефтью или нефтепродуктами почвы.

Технической задачей изобретения является повышение скорости и эффективности очистки твердых объектов от нефти и нефтепродуктов даже при повышенной концентрации соли и относительно низкой температуре, в том числе в районах с коротким тепловым периодом, а также расширение области применения способа.

Указанный технический результат достигается тем, что в известном способе очистки твердых объектов от нефти и нефтепродуктов путем обработки загрязненного объекта микробным препаратом, состоящим из смеси природных углеводородокисляющих культур микроорганизмов, выделенных методом селекции из природного сообщества микроорганизмов в присутствии смеси питательной водной среды, содержащей, по крайней мере, соединения азота, фосфора, калия и магния с нефтью или нефтепродуктом, используют препарат на основе сообщества микроорганизмов, обитающих на морских бурых водорослях, по крайней мере, одного биологического рода, и очищаемый объект дополнительно обрабатывают водой и биогенной добавкой, содержащей, по крайней мере, соединения азота, фосфора, калия и магния, причем препарат используют с титром не менее 10⁵ колоний образующих единиц на миллилитр при использовании суспензии препарата в водной среде и с титром не менее 10⁵ колоний образующих единиц на грамм при использовании водной суспензии препарата, иммобилизованного на твердом носителе. При этом обработку объекта водой осуществляют перед его обработкой микробным препаратом, или одновременно с его обработкой микробным препаратом, или после его обработки микробным препаратом.

В предлагаемом техническом решении селекцию культур микроорганизмов необходимо проводить в присутствии смеси водной питательной среды с нефтью или нефтепродуктом, причем более целесообразно использовать для этих целей сырую нефть. В отсутствие нефти или нефтепродукта получить микробный препарат не удается. В качестве питательной среды, используемой при селекции МС, можно использовать, традиционные для таких целей питательные среды, содержащие, по крайней мере, соединения азота, фосфора, калия и магния. Питательная среда также может содержать микроэлементы.

Используемый в данном способе микробный препарат в чистом виде представляет собой пастообразную массу, которая может быть получена, например, путем выделения препарата из питательной среды методом центрифугирования, сепарирования или сушки. В чистом виде использование такого пастообразного препарата неэффективно, поэтому очищаемый твердый объект всегда дополнительно обрабатывают водой. В зависимости от природы очищаемого объекта можно использовать как морскую, так и пресную воду.

В предлагаемом техническом решении кроме дополнительной обработки очищаемого объекта водой во всех случаях также необходимо дополнительно обрабатывать очищаемый объект биогенной добавкой, которая должна содержать, по крайней мере, соединения азота, фосфора, калия и магния. В качестве биогенной добавки можно использовать как легкорастворимые, так и труднорастворимые минеральные или органоминеральные соединения.

При реализации способа микробный препарат можно использовать в виде суспензии отселектированного сообщества микроорганизмов в водной питательной среде или в воде либо в виде высушенного отселектированного микробного сообщества (МС), а также в виде отселектированного МС, иммобилизованного на твердом носителе.

Микроскопическими, культурально-морфологическими и физиолого-биохимическими методами было показано, что используемый в предлагаемом способе препарат состоит из бактерий, относящихся к различным биологическим родам, например, таким как Pseudomonas, Bacillus, Rhodococcus, Mycobacterium, Acinetobacter, Phyllobacterium, Marinobacter, Alcanivorax, Oleispira, Cycloclasticus и т.д. В предлагаемом изобретении для выделения культур микроорганизмов могут быть использованы различные морские бурые водоросли, например бурые водоросли биологических родов Fucus sp., Laminarya sp., Phyllariella sp. и т.д. Эти водоросли широко распространены в морских экосистемах, например в Белом море, в Баренцевом море, в Дальневосточных морях и т.д. Можно использовать как бурые водоросли одного биологического рода, например рода Fucus sp., так и водоросли двух и более биологических родов.

Сушку биомассы препарата можно осуществлять как лиофильно, так распылением суспензии биомассы препарата в газовом потоке, например в воздухе, в азоте, в аргоне и т.д.

В качестве твердого носителя для иммобилизации отселектированного МС можно использовать различные неорганические и органические, преимущественно пористые, объекты, например, такие как природные пористые цеолиты, перлит, торф, опилки, почву и др. Иммобилизацию можно проводить путем обработки носителя суспензией отселектированного сообщества микроорганизмов в жидкой среде посредством распыления, смешения и т.д. с последующей сушкой, которую можно осуществлять как при атмосферном, так и при пониженном давлении.

Микробный препарат, используемый в предлагаемом техническом решении, получают следующим образом. Образцы бурых водорослей собирают, как правило, в зоне литорали. Фрагменты таллома (кусочки водорослей) размером примерно от 1 см² или более помещают в водную питательную среду, например, следующего состава (г/л): KNO₃ - 4,0; KH₂PO₄ - 0,6; Na₂HPO₄ - 1,4; MgSO₄ - 0,8; NaCl - 20,0. В качестве источника углерода для жизнедеятельности МС используют либо нефтепродукт, либо преимущественно сырую нефть, вводимые в питательную среду в количестве нескольких массовых процентов. pH среды с нефтью 7,0.

Для получения культуры, окисляющей нефть или нефтепродукт, МС, засеянное как описано выше, инкубируют на лабораторной качалке при скорости вращения 280-300 об/мин, при температуре преимущественно не выше 15°С. Таким методом получают так называемую накопительную культуру микроорганизмов, за развитием которой наблюдают визуально и микроскопически. Через семь суток накопительную культуру помещают в холодильник, поддерживающий температуру в 10-12°С.

Селекцию УВ сообщества микроорганизмов проводят в течение нескольких месяцев, путем последовательных нескольких (5-6) пересевов 1 мл накопительной культуры в новую порцию питательной среды с нефтью или нефтепродуктом указанного выше состава.

Культивируемое разнообразие бактерий и определение титра микроорганизмов в накопительной культуре осуществляют путем десятикратного разведения стерильной питательной среды без нефти и высева 0,01 мл накопительной культуры на чашки Петри, содержащие среду, состоящую из мясопептонного бульона и сусла, взятых в соотношении 1:1, с добавлением 1,7% агар-агара. После этого чашки Петри инкубируют при 10°С в течение 7 дней.

Из отдельных колоний микроорганизмов, выросших в этих условиях, традиционными методами выделяют штаммы чистых культур микроорганизмов. Способность чистых культур микроорганизмов потреблять УВ сырой нефти проверяют в тех же условиях, что и у накопительной культуры.

Морфологические и культуральные свойства колоний микроорганизмов, их микроскопию и проверку их окрашиваемости по Граму изучают традиционными микробиологическими методами.

В предложенном техническом решении микробный препарат представляет собой смесь бактерий, включающий одиночные клетки и их группирования в недлинные цепочки или иные скопления за счет выделяемой слизи. Морфологически - это палочки разных размеров и толщины, кокки, коккобациллы, изогнутые палочки, у-образные пары клеток. Некоторые из них подвижные, другие - нет. Бактерии являются гетеротрофными аэробами, сапротрофными, грамположительными и грамотрицательными, не разжижающими агар, использующими простые субстраты, такие как углеводы, аминокислоты, органические кислоты, спирты и углеводороды.

Используемый микробный препарат не обладает токсичными и токсигенными свойствами, не обладает раздражающими действиями на слизистые оболочки, не аллергичен. Он продуцирует биологические поверхностно активные вещества, которые повышают скорость и степень очистки объектов от нефти и нефтепродуктов.

Микробный препарат можно использовать в виде суспензии отселектированного МС в водной среде с титром микроорганизмов не менее 10⁵ колоний образующих единиц (KOE)/мл. При использовании препарата, иммобилизованного на твердом носителе, титр препарата должен составлять не менее 10⁵ KOE/г носителя. Препарат экологичен и может быть использован для очистки различных твердых объектов, таких как почва, металлические и другие загрязненные поверхности от нефти и нефтепродуктов, в том числе при повышенной концентрации соли в различных географических широтах, в том числе в районах крайнего Севера и других районах с коротким тепловым периодом.

При реализации способа контроль за эффективностью и скоростью очистки объектов от нефти и нефтепродуктов можно проводить с помощью любых традиционных для таких целей методов, например, таких как хроматография, гравиметрия, респирометрия и т.д.

Применяемый в заявленном способе препарат удобен для использования. Хранят микробный препарат в виде его суспензии в водной питательной среде, либо в замороженном виде после отделения микроорганизмов от питательной среды, либо в высушенном виде, а также в иммобилизованном виде на твердом носителе после высушивания. Срок годности препарата, хранящегося в виде суспензии в питательной среде при 10°С, без пересева в новую питательную среду, составляет не менее 6 месяцев. Высушенный препарат, а также иммобилизованный препарат может храниться более года.

Преимущества предлагаемого способа иллюстрируют следующие примеры.

Пример 1.

Образцы морских бурых водорослей биологического рода Fucus sp. собирают в зоне литорали Белого моря в районе Кандалакшской губы при температуре морской воды 12°С. Кусочки таллома водоросли размером около 2 см² помещают в стерильные конические стеклянные колбы емкостью 750 мл, заполненные 100 мл водной питательной среды, содержащей растворенные нижеуказанные соли, взятые в количестве (г/л): KNO₃ - 4,0; KH₂PO₄ - 0,6; Na₂HPO₄ - 1,4; MgSO₄ - 0,8; NaCl - 20,0. В колбы добавляют по 2 мл сырой Бакинской нефти, используемой в качестве источника углеводородов для жизнедеятельности МС. Колбы закрывают стерильными ватно-марлевыми пробками и закрепляют на лабораторной качалке. Включают качалку, работающую со скоростью 300 об/мин, и проводят инкубацию МС при 12°С в течение 7 суток. Затем колбы помещают в холодильник с температурой 10°С. За развитием культур микроорганизмов наблюдают визуально и микроскопически.

Селекцию УВ сообщества микроорганизмов проводят в течение 2,5 месяцев путем последовательных 10 пересевов 1 мл полученной суспензии микроорганизмов в 100 мл новой вышеуказанной питательной среды с нефтью.

Культивируемое разнообразие бактерий МС и определение титра микроорганизмов в полученном сообществе осуществляют путем десятикратного разведения в стерильной среде без нефти и высева 0, 01 мл этой культуры на чашки Петри, содержащие среду, состоящую из мясопептонного бульона и сусла, взятых в соотношении 1:1, с добавлением 1,7% агар-агара. После этого чашки Петри инкубируют при 10°С в течение 7 дней. Получают микробный препарат с титром 10⁸ KOE/мл, содержащий 10 биологических родов грамотрицательных и грамположительных бактерий, следующего морфологического состава: кокки, палочки, изогнутые и коринеформные бактериальные клетки.

Способность полученного микробного препарата очищать твердые объекты от нефти проверяют следующим образом.

Микробную биомассу отделяют от питательной среды центрифугированием при 8 тыс.об/мин и полученную густую пастообразную массу, содержащую 10¹⁰ KOE/мл, хранят в замороженном виде.

Для иммобилизации препарата осуществляют ресуспендирование 1 мл препарата в 1 л вышеуказанной питательной среды без нефти с последующим введением в полученную суспензию 300 г твердого носителя, в качестве которого используют природный цеолит. Полученную смесь перемешивают в течение 10 мин при комнатной температуре, затем цеолит с иммобилизованным препаратом отделяют от суспензии и сушат при комнатной температуре до воздушно сухого состояния. Получают микробный препарат, иммобилизованный на твердом носителе, содержащий 10⁷ KOE/г носителя.

На поверхность трех участков засоленной почвы площадью по 1 м², расположенных в прибрежной зоне вышеназванной биостанции МГУ, равномерно наносят по 800 мл сырой Бакинской нефти, затем на загрязненные участки равномерно наносят по 40 г цеолита с иммобилизованным препаратом и биогенную добавку, содержащую 0,8 г KNO₃, 0,12 г - KH₂PO₄; 0,28 г - Na₂HPO₄ и 0,16 г MgSO₄. После этого загрязненную почву перекапывают и рыхлят, затем каждый участок равномерно обрабатывают 10 л воды путем полива. Опыт проводят при 12°С. За 7 суток степень очистки почвы от нефти, определенная гравиметрическим методом, составляет в среднем 92%.

Пример 2.

Опыт проводят аналогично примеру 1, однако полученный биопрепарат на цеолите не иммобилизуют и в качестве очищаемого объекта используют 200-литровую металлическую бочку, загрязненную изнутри нефтью. В бочку заливают 200 л морской воды, затем туда добавляют 3 мл полученного биопрепарата и биогенную добавку, содержащую 80 г KNO₃, 12 г - KH₂PO₄; 28 г - Na₂HPO₄ и 16 г MgSO₄. Получают водную суспензию препарата с титром 1,5×10⁵ KOE/мл. Опыт проводят в течение 5 суток при 10°С при периодическом интенсивном перемешивании. За это время степень очистки бочки от нефти достигает 90%.

Пример 3 (контрольный, по прототипу).

Опыт проводят аналогично примеру 1, однако культуру микроорганизмов выделяют из почвы, взятой в районе автозаправочной станции и загрязненной нефтепродуктами. За 7 суток степень очистки почвы от нефти составляет 51%.

Пример 4.

Опыт проводят аналогично примеру 1, однако при получении биологически активного препарата используют смесь образцов морских бурых водорослей биологических родов Laminarya sp. и Phyllariella sp., обитающих в акватории Баренцева моря, селекцию природного сообщества микроорганизмов проводят в присутствии дизельного топлива и биопрепарат на цеолите не иммобилизуют и лиофильно сушат, а в качестве очищаемого объекта используют поверхность трех участков засоленной почвы площадью по 1 м², каждый из которых равномерно загрязнен 600 мл дизельного топлива.

В 10 литрах воды суспендируют полученный препарат, затем туда добавляют биогенную добавку, содержащую 0,8 г KNO₃, 0,12 г - KH₂PO₄; 0,28 г - Na₂HPO₄ и 0,16 г MgSO₄. Получают водную суспензию препарата с титром 1×10⁵ KOE/мл. Каждый участок загрязненной почвы перекапывают и рыхлят, затем каждый участок равномерно обрабатывают 10 л вышеназванной водной суспензии препарата. Опыт проводят при 12°С. За 7 суток эффективность очистки почвы от дизельного топлива составляет в среднем 86%.

Пример 5.

Опыт проводят аналогично примеру 1, однако используют микробный препарат с титром 10⁵ KOE/г носителя и металлическую бочку очищают от мазута. За 9 суток эффективность очистки составляет 90%.

Пример 6 (контрольный, с меньшим, чем заявлено, титром препарата).

Опыт проводят аналогично примеру 4, однако используют водную суспензию микробного препарата с титром 10⁴ KOE/мл. За 5 суток эффективность очистки почвы от дизельного топлива составляет в среднем 51%.

Пример 7 (контрольный, с меньшим, чем заявлено, титром препарата).

Опыт проводят аналогично примеру 1, однако используют препарат с титром 10⁴ KOE/мл. За 9 суток эффективность очистки почвы от нефти составляет 67%.

Таким образом, из примеров видно, что предложенный способ действительно позволяет повысить эффективность очистки твердых объектов от нефти и нефтепродуктов с 51 до 86-92% даже при повышенной концентрации соли и относительно низкой температуре, в том числе в условиях крайнего Севера России, и позволяет вести очистку объектов с более высокой скоростью. Кроме того, предложенный способ существенно расширяет область его применения, распространяя его на любые твердые объекты, загрязненные нефтью или нефтепродуктами.

1. Способ очистки почвы и поверхностей твердых объектов от загрязнений нефтью и нефтепродуктами путем обработки загрязненного объекта микробным препаратом, состоящим из смеси культур природных углеводородокисляющих микроорганизмов, выделенных методом селекции из природного сообщества микроорганизмов в присутствии смеси питательной водной среды, содержащей, по крайней мере, соединения азота, фосфора, калия и магния, с нефтью или нефтепродуктом, отличающийся тем, что используют препарат на основе сообщества микроорганизмов, обитающих на морских бурых водорослях, по крайней мере, одного биологического рода, и очищаемый объект дополнительно обрабатывают водой и биогенной добавкой, содержащей, по крайней мере, соединения азота, фосфора, магния и калия, при этом препарат используют в виде суспензии микроорганизмов, содержащей не менее 10⁵ КОЕ на мл, или в виде препарата, иммобилизованного на твердом носителе с концентрацией клеток не менее 10⁵ КОЕ на г твердого носителя.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что обработку объекта водой осуществляют перед его обработкой микробным препаратом.

3. Способ по п.1, отличающийся тем, что обработку объекта водой осуществляют одновременно с его обработкой микробным препаратом.

4. Способ по п.1, отличающийся тем, что обработку объекта водой осуществляют после его обработки микробным препаратом.