Способ лечения и профилактики отравлений фосфорорганическими инсектицидами (фои)
Владельцы патента RU 2415668:
Федеральное государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования "САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКАЯ ГОСУДАРСТВЕННАЯ АКАДЕМИЯ ВЕТЕРИНАРНОЙ МЕДИЦИНЫ" (ФГОУ ВПО СПГАВМ) (RU)
Изобретение относится к экспериментальной медицине, токсикологии и касается лечения и профилактики отравлений фосфорорганическими инсектицидами (ФОИ). Для этого в эксперименте животным вводят карбоксим и атропин в дозах, 2-3 раза меньших, чем при их раздельном введении. Способ обеспечивает повышение защитной профилактической эффективности у животных в эксперименте в 6-11 раз, в т.ч. за счет аллостерического потенцирования, что является основанием для дальнейшей разработки эффективного и безопасного антидота ФОИ для людей. 11 табл.
Изобретение относится к медицине, в частности к токсикологии.
Известны способы лечения и профилактики отравлений инсектицидами, заключающиеся во введении внутрь организма обратимых ингибиторов холинэстеразы (ИХЭ), например пиридостигмина, который вызывал побочные эффекты в виде трофических поражений нервной системы и оказался малопригодным для профилактики отравлений (2, 3, 4).
Наиболее близким способом лечения и профилактики отравлений инсектицидами является введение внутрь организма обратимого ингибитора холинэстеразы - оксазила в малых дозах совместно с атропином (1).
Недостатки рассмотренного способа заключаются в следующем: оксазил не проникает через гематоэнцефалический барьер в отличие от карбоксима, и поэтому он недостаточно эффективен при профилактике отравлений ФОИ у человека; оксазил не обладает реактивирующим действием, а потому не пригоден для лечения отравлений ФОИ; оксазил токсичен и при хранении относится к группе «А».
Задача изобретения - повышение эффективности лечения и профилактики отравлений фосфорорганическими инсектицидами.
Технический результат поставленной задачи достигается тем, что в способе лечения и профилактики отравлений фосфорорганическими инсектицидами, заключающемся во введении в организм обратимого ингибитора холинэстеразы в комплексе с атропином, предлагается в качестве обратимого ингибитора холинэстеразы использовать карбоксим в дозах 1/30-1/100 Д50, обладающий свойствами аллостерического обратимого ингибитора холинэстеразы, при этом атропин используется в субэффективных дозах (5 мг/кг).
Способ лечения и профилактики осуществлялся на следующих группах животных: мышах и кошках. Предварительно проведено определение свойств карбоксима с известными антихолинэстеразными веществами.
Примеры исследования антихолинэстеразной активности карбоксима с обратимыми ингибиторами холинэстеразы в эксперименте
Пример 1. Определение сравнительной антихолинэстеразной активности карбоксима с обратимыми ингибиторами холинэстеразы и характеристика его взаимодействия с ферментом.
Опыты выполнены in vitro с использованием в качестве фермента очищенной холинэстеразы эритроцитов человека с активностью 3,6 ЕД/мг. Применен метод непрерывного потенциометрического титрования ацетата, образующегося при гидролизе ацетилхолина, раствором КОН на автотитраторе ТТТ-1 с титрографом фирмы «Radiometr» (Дания) в условиях постоянства рН 7,4, концентрации субстрата ацетилхолина иодида=2×10-3М и температуры 37,0°С. Определяли скорость гидролиза в разные отрезки времени. В зависимости от требований анализа либо определяли степень торможения в сопоставлении с контролем, либо вычисляли величину KII - бимолекулярную константу скорости ингибиции или величину I50. В последнем случае показатель приведен как определяемый в опыте, так и расчетный с поправкой для обратимых ингибиторов, с учетом конкуренции с ацетилхолином, добавляемым в инкубационную смесь (19). Обратимость определяли методом длительного диализа в сопоставлении с галантамином (табл.1 и 2)
| Таблица 1 | ||||
| Сравнительные величины показателей I50 и характеристика взаимодействия карбоксима, галантамина, пиридостигмина и оксазила с холинэстеразой в опытах in vitro с и без ацетилхолина (+АХ и -АХ). | ||||
| I50 в М/л | ||||
| Вещества | Показатели и характеристика антихолинэстеразной активности | |||
|
с АХ |
 без АХ |
|
Характеристика взаимодействия с холинэстеразой | |
| Карбоксим | 1,5×10-5±0,2 | 6,5×10-6±0,1 | 2,3 | преимущественно неконкурентный |
| Оксазил | 8,0×10-10 | 8,0×10-10 | 1,0 | неконкурентный |
| Пиридостигмин | 2,2×10-7 | 3,5×10-8 | 6,2 | смешанный конкурентно-неконкурентный |
| Галантамин | 6,2×10-6 | 1,7×10-7 | 35,4 | Конкурентный |
| Примечание: карбоксим является преимущественно неконкурентным ингибитором холинэстеразы, ближе всего к ингибитору оксазилу. |
| Таблица 2 | ||
| Остаточное торможение активности холинэстеразы в % к контролю при диализе инкубата с ингибиторами | ||
| Время диализа часы | Ингибиторы холинэстеразы | |
| Карбоксим 1,3×10-5М | Галантамин 3,3×10-6М | |
| 0 | 66 | 58 |
| 2 | 55 | 42 |
| 6 | 33 | 23 |
| 24 | 29 | 13 |
| Примечание: реактивация фермента после ингибиции карбоксимом сходна с реактивацией после ингибиции обратимым ингибитором галантамином. |
Карбоксим является обратимым ингибитором со скоростью 1,5% час-1, несколько уступая галантамину 1,9% час-1.
Пример 2. Подавление карбоксимом скорости ингибирования холинэстеразы фосфаколом в опыте in vitro. KII - бимолекулярная константа скорости фосфорилирования. Результаты приведены в табл.3.
| Таблица 3 | ||
Константы KII фосфакола в зависимости от концентрации карбоксима -  и их относительное изменение к контролю - 
|
||
| Концентрации карбоксима в М | Фосфакол | |
 106×М мин-1
|
|
|
| 0 (контроль) | 2,8 | |
| 2×10-5 | 1,2 | 1,3 |
| 4×10-5 | 0,8 | 3,5 |
| 9×10-5 | 0,5 | 5,6 |
Примечание:  - бимолекулярная константа скорости ингибирования холинэстеразы фосфаколом (фосфорилирования) в отсутствие карбоксима. - То же, при разных концентрациях карбоксима, вводимого в инкубат за 15 мин до фосфакола. Отношение  - уменьшения константы скорости фосфорилирования. |
В концентрации выше 2×10-5М карбоксим тормозит скорость фосфорилирования ацетилхолинэстеразы.
Пример 3. Влияние карбоксима на торможение активности холинэстеразы крови мышей армином и хлорофосом в условиях его предварительного и последующего введения (табл.4 и 5).
| Таблица 4 | |||
| Снижение активности холинэстеразы крови мышей в % к контролю после раздельного и последовательного введения карбоксима и армина. Карбоксим вводили внутримышечно в дозе 15 мг/кг, армии - подкожно в дозе DL50. Активность фермента определяли методом потенциометрического титрования через 15 мин после введения карбоксима (контроль) и через 60 мин после введения армина (контроль и опыт). (М±m; n=6-7). | |||
| Вещество | Время введения карбоксима | ||
| до армина за 15 мин | после армина | ||
| через 15 мин | через 45 мин | ||
| Карбоксим (контроль) | 11,3±3,1 | - | - |
| Армии (контроль) | 72,3±1,9 | 70,9±5,3 | 70,6±7,1 |
| Карбоксим и армии | 29,5±3,3 | 46,1±9,9 | 48,8±3,2 |
| Примечание: Во всех случаях опыт абсолютно достоверно отличен от контроля. Экстренная (за 15 мин) профилактика достоверно эффективней лечения |
| Таблица 5 | ||||
| Снижение активности холинэстеразы крови мышей в % к контролю при раздельном и последовательном введении карбоксима (в/м) и хлорофоса (п/к). (М±m, n=5) в разное время после последнего введения | ||||
| Вещества | Время введения карбоксима | Время определения активности в мин | ||
| через 15 | через 30 | через 60 | ||
| Карбоксим | - | 7,2±6,3 | 10,1±2,8 | 11,5±4,2 |
| Хлорофос | - | 79,3±2,8 | 82,6±9,4 | 89,4±8,1 |
| Карбоксим + Хлорофос | за 60 мин | 51,3±16,6 | 59,4±12,1 | 60,1±9,7 |
| Карбоксим + Хлорофос | за 30 мин | 20,6±7,3 | 31,5±7,8 | 30,7±10,8 |
| Карбоксим + Хлорофос | одновременно | 10,1±2,8 | 10,1±2,8 | 10,1±2,8 |
| Хлорофос + Карбоксим | через 15 мин | 10,1±2,8 | 10,1±2,8 | 10,1±2,8 |
| Примечание: Эффект карбоксима абсолютно достоверен при введении за 30 мин, одновременно и через 15 мин. Одновременное и лечебное применение активней ранней (за 30 мин) профилактики. Профилактика и лечение отравлений хлорофосом эффективней, чем отравление армином |
Пример 3. Доказательство высокой эффективности защитного действия карбоксима в малых дозах (табл.6).
| Таблица 6 | ||||
| Сравнительная профилактическая активность обратимых ингибиторов холинэстеразы при в/б введении одновременно с атропином в неэффективной дозе (5 мг/кг) за 15 мин до армина в дозе ЛД50 или параоксона в дозе 2 ЛД50. Показатель эффективности - ПЭ - равен отношению ЛД50 к дозе, снижающей летальность мышей до 50% - ПД50. | ||||
| Вещества | Химическая характеристика веществ | Показатели активности | ||
| ЛД50, мг/кг | ПД50, мг/кг | ПЭ | ||
| ЛД50:ПД50 | ||||
| Галантамин | третичный, изостеричный | 16,70 | 2,700 | 6,2 |
| Физостигмин | третичный, изостеричный | 0,80 | 0,130 | 6,2 |
| Аминостимин | третичный смешанной стеричности | 0,23 | 0,027 | 8,3 |
| Митолон | бисчетвертичный аллостерический | 1,50 | 0,022 | 68,0 |
| Оксазил | бисчетвертичный аллостерический | 4,50 | 0,011 | 409,0 |
| Карбоксим* | бисчетвертичный аллостерический | 159,0 | 1,500 | 106,0 |
| Примечание: *) карбоксим испытан как антагонист параоксона |
Показатели торможения фосфорилирования коррелируют, но не совпадают с показателями потенцирования защитного эффекта. В случае карбоксима следует учитывать, что он в отличие от прочих испытан на параоксоне и к тому же обладает свойствами реактиватора.
Пример 4. Влияние карбоксима на парализующее воздействие фосфакола в опытах на нервно-диафрагмальном препарате крысы.
Опыты выполнены на френико-диафрагмальных препаратах белых крыс. Изолированный препарат помещали в камеру с проточным раствором Тироде при аэрации карбогеном, температуре +28°С и рН 7,5±0,1. Нерв стимулировали прямоугольными импульсами от стимулятора ЭСЛ-2 длительностью 0,1 с, 3-кратной надпороговой силы и частотой 20 и 50 Гц. Сокращения регистрировали с помощью механотрона типа 6М×5С. Время каждой инкубации 60 мин, после чего начинали отмывание. Эффект регистрировали в разное время после окончания инкубации с фосфаколом в контроле и со вторым веществом в опыте. Результаты приведены в таб.7.
| Таблица 7 | ||||
| Уровень амплитуды сокращений изолированной диафрагмы крыс в % к исходному при тетаническом раздражении френикуса с частотой 20 и 50 Гц при инкубации с фосфаколом в концентрации 0,5 мг/мл (контроль) и в условиях предварительного и последующего воздействия карбоксима в концентрации 10 мг/мл. Регистрация в разное время после последнего воздействия, n=4. | ||||
| Вещества | Частоты раздражения нерва и время регистрации | |||
| 20 Гц | 50 Гц | |||
| 45 мин | 120 мин | 45 мин | 120 мин | |
| Фосфакол (контроль) | 15 | 20 | 10 | 15 |
| Карбоксим + Фосфакол | 65 | 80 | 40 | 50 |
| Фосфакол + Карбоксим | 100 | 100 | 100 | 100 |
| Примечание: во всех случаях лечебное применения эффективней профилактического |
Пример 5. Влияние карбоксима на торможение активности холинэстеразы крови мышей армином и хлорофосом в условиях его предварительного и последующего введения (табл.7 и 8).
| Таблица 8 | |||
| Снижение активности холинэстеразы крови мышей в % к контролю после раздельного и последовательного введения карбоксима и армина. Карбоксим вводили внутримышечно в дозе 15 мг/кг, армии - подкожно в дозе DL50. Активность фермента определяли методом потенциометрического титрования через 15 мин после введения карбоксима (контроль) и через 60 мин после введения армина (контроль и опыт). (М±m; n=6-7). | |||
| Вещество | Время введения карбоксима | ||
| до армина за 15 мин | после армина | ||
| через 15 мин | через 45 мин | ||
| Карбоксим (контроль) | (11,3+3,1) | - | - |
| Армии (контроль) | (72,3±1,9) | (70,9±5,3) | (70,6±7,1) |
| Карбоксим и армии | 29,5±3,3 | 46,1±9,9 | 48,8±3,2 |
| Примечание: Во всех случаях опыт абсолютно достоверно отличен от контроля. Экстренная (за 15 мин) профилактика достоверно эффективней лечения |
| Таблица 9 | ||||
| Снижение активности холинэстеразы крови мышей в % к контролю при раздельном и последовательном введении карбоксима (в/м) и хлорофоса (п/к). (М±m, n=5) в разное время после после него введения | ||||
| Вещества | Время введения карбоксима | Время определения активности в минутах | ||
| через 15 | через 30 | Через 60 | ||
| Карбоксим | - | 7,2±6,3 | 10,1±2,8 | 11,5±4,2 |
| (контроль) | ||||
| Хлорофос (контроль) | - | 79,3±2,8 | 82,6±9,4 | 89,4±8,1 |
| Карбоксим + Хлорофос | за 60 мин | 51,3±16,6 | 59,4±12,1 | 60,1±9,7 |
| Карбоксим + Хлорофос | за 30 мин | 20,6±7,3 | 31,5±7,8 | 30,7±10,8 |
| Карбоксим + Хлорофос | одновременно | 10,1±2,8 | 10,1±2,8 | 10,1±2,8 |
| Хлорофос + Карбоксим | через 15 мин | 10,1±2,8 | 10,1±2,8 | 10,1±2,8 |
| Примечание: Эффект карбоксима абсолютно достоверен при введении за 30 мин, одновременно и через 15 мин. Одновременное применение активней ранней (за 30 мин) профилактики. Профилактика и лечение отравлений хлорофосом эффективней, чем отравление армином |
Главной итогом изобретения явилось создание и испытание профилактической активности комплекса, состоящего из карбоксима в дозе 1/3 эффективной с атропином, в дозе 1/2 эффективной (эти вещества в таких дозах при отравлении параоксоном были неэффективны). Эффект достигается за счет аллостерического потенцирования. Наличие потенцированного защитного эффекта доказывается примером 6.
Пример 6. Сравнительная эффективность карбоксима и атропина в действующих дозах и их комплекса в дозах, недостаточных для защиты мышей от гибели при отравлении параоксоном (табл.10).
| Таблица 10 | |||
| Оценка защитного эффекта атропина, карбоксима в условиях их раздельного и совместного профилактического (за 15 мин) и лечебного # (через 1 мин) внутрибрюшинного применения при отравлении белых мышей параоксоном подкожно. Число животных в группе 8-10; ЛД50±m мг/кг | |||
| Средства защиты в мг/кг | ЛД50±m Фосфакола | Показатели наклона кривой летальности | Индекс защиты |
| Контроль (параоксон) | (0,71±0,07) | (0,2) | - |
| Атропин 10 | 1,79±0,29 | 0,4 | 2,5 |
| Карбоксим 15 | 3,34±0,49 | 0,5 | 4,7 |
| Атропин 5 + Карбоксим 5 | 20,0±5,5 | 0,9 | 28,2 |
| Атропин 5# + Карбоксим 5# | 17,7±6,7 | 1,1 | 24,9 |
| Атропин 10 + Дипироксим 20* | 8,9±3,7 | - | 12,5 |
| Примечание: ПН - показатель наклона=σ:ЛД50=(m√N): ЛД50. Большой наклон кривой свидетельствует о малой опасности применения комплекса; ИЗ - индекс защиты=ЛД50опыта:ЛД50контроля. # - препараты вводили лечебно. *) вместо карбоксима использован дипироксим в 4 раза большей дозе, чем карбоксим, с атропином в дозе 10 мг/кг. |
Итак, использование комплекса карбоксима с атропином в субэффективных дозах (в 2-3 раза меньших, чем при раздельном применении) увеличило их профилактическую эффективность в 6-11 раз, что и требовалось доказать. Приведенные материалы позволяют считать, что на основе изобретения может быть создан эффективный, безопасный и нетоксичный профилактический антидот ФОИ для работников сельского хозяйства и других специальностей.
Пример 7. Группе из 8 котов (возраст 8-11 лет) с диагнозом отравление ФОИ (хлорофосом) в ветеринарной клинике «Барс» проведено лечение с применением карбоксима и атропина в субэффективных дозах. Результаты приведены в табл.11.
| Таблица 11 | ||||
| Количество эхиноцитов у кошек до и после лечения сочетанием карбоксима и атропина | ||||
| № иссл. | до лечения | после лечения | ||
| Нормальн. эритр., % | Деформир. эритр., % | Нормальн. эритр., % | Деформир. эритр., % | |
| 1 | 88,26 | 11,74 | 93,3 | 6,7 |
| 2 | 87,5 | 12,5 | 95,6 | 4,4 |
| 3 | 90,6 | 9,4 | 90,06 | 9,94 |
| 4 | 88,35 | 11,65 | 91,15 | 8,85 |
| 5 | 89,8 | 10,2 | 93,5 | 6,5 |
| 6 | 87,93 | 12,07 | 92,6 | 7,4 |
| М±m | 88,74±1,38 | 11,26±1,38 | 92,7±2,23 | 7,3±2,23 |
Как видно из табл.11, количество эхиноцитов у кошек, отравленных ФОИ, снижается с 11,26±1,38% до 7,3±2,23% после лечения. Это существенным образом сказывается на состоянии регионарного кровотока, ликвидирует застойные явления, улучшает мозговое кровоснабжение. Из табл.11 видно, что после лечения сочетанием карбоксима и атропина у всех пациентов уровень холинэстеразы крови пришел к своим физиологическим нормам. При этом улучшалось клиническое состояние животных и отсутствовали клинические признаки отравления.
Положительный эффект предлагаемого изобретения заключается в использовании комплекса карбоксима с атропином в субэффективных дозах, что увеличило их профилактическую эффективность в 6-11 раз. Приведенные материалы позволяют считать, что на основе изобретения может быть создан эффективный, безопасный и нетоксичный лечебно-профилактический антидот ФОИ для животных.
Источники информации
1. Петров А.Н., Софронов Г.А., Нечипоренко С.П., Сомин И.Н. антидоты фосфорорганических отравляющих веществ.// Рос. Хим. ж. (Ж. хим. об-ва им. Д.И.Мендилеева). - 2004. - Т.48, №2. - С.110-116.
2. Прозоровский В.Б. Лечебный и профилактический антидоты ФОВ. // Актуальные вопросы профилактики и терапии интоксикаций. Сб. научн. тр. Научно-практ. мед. центра «Нейрон» и НИИИЦ (МБЗ) ГосНИИИ военной мед. СПб.: изд «Астрон». - 2005. - С.9-16.
3. Chemical faund biological defense program. // Annnal report to congrese merch 2005: Department of defense [USA]. - 2005. - 62 p.
4. Прозоровский В.Б., Тонкопий В.Д., Суслова И.М. Взаимодействие обратимых ингибиторов с каталитическими и аллостерическими участками холинэстераз. // Бюлл. эксперим. биол. и мед. - 1976. - Т.82, №8. - С.947-949.
Способ профилактики и лечения отравлений фосфорорганическими инсектицидами в эксперименте путем введения животным карбоксима и атропина в дозах, в 2-3 раза меньших, чем при их раздельном введении.
