6-(2'-амино-2'-карбоксиэтилтио)-2-метилтио-4-пивалоилоксиметил-1,2,4-триазоло[5,1-c]1,2,4-триазин-7(4н)-он

Описывается новое соединение - 6-(2'-Амино-2'-карбоксиэтилтио)-2-метилтио-4-пивалоилоксиметил-1,2,4-триазоло[5,1-с]1,2,4-триазин-7(4Н)-он формулы (2)

обладающее противовирусным действием и низкой токсичностью. Данное соединение может найти применение в медицине. 1 пр., 3 ил.

 

1. Область техники, к которой относится изобретение

Изобретение относится к области биологически активных соединений и касается 6-(2'-амино-2'-карбоксиэтилтио)-2-метилтио-4-пивалоилоксиметил-1,2,4-триазоло[5,1-с]1,2,4-триазин-7(4Н)-она, обладающего противовирусным действием, предназначенного для лечения и профилактики вирусных инфекционных заболеваний животных и человека. Изобретение может быть использовано в лечебных учреждениях, научно-исследовательских лабораториях, а также в животноводстве и птицеводстве.

2. Уровень техники

Имеются данные о противогерпетическом действии 6-фенил-4-гидроксибутил-1,2,4-триазоло[5,1-с]-1,2,4-триазин-7(4Н)-она (В.Л. Русинов, О.Н.Чупахин, Е.Н.Уломский и др., патент РФ №2345080 от 27.01.2009), а также 4-((Z)-4'-Гидроксибутен-2'-ил)-2-R-6-фенил-1,2,4-триазоло[5,1-с][1,2,4]триазин-7-онов (О.Н.Чупахин, В.Л.Русинов, Е.Н.Уломский и др., патент РФ №2376307 от 20.12.2009 г.). Противовирусным действием в отношении вирусов гриппа типов А и В обладают 2-R-6-нитро-4-аллилоксиметил-1,2,4-триазоло[5,1-с]-1,2,4-триазин-7(4Н)-оны, R=Н, CH3, SCH3 (В.Л.Русинов, Е.Н.Уломский, С.Л.Деев. И др., патент РФ №2340614 от 10.12.2008; В.Л.Русинов, О.Н.Чупахин, С.Л.Деев, Т.С.Шестакова, Е.Н.Уломский, Л.И.Русинова, О.И.Киселев, Э.Г.Деева. Синтез и противовирусная активность аналогов нуклеозидов на основе 1,2,4-триазоло[3,2-с][1,2,4]триазин-7(4Н)-онов. Известия АН, Серия химическая, 2010, №1, с.135-142). Наиболее близкое по структуре к заявляемому соединению из этой серии 2-метильтио-6-нитро-4-аллилоксиметил-1,2,4-триазоло[5,1-с]-1,2,4-триазин-7(4Н)-он (1) можно рассматривать в качестве прототипа. При использовании соединения (1) в концентрации 40 мкг/мл в опытах in vitro инфекционный титр вируса гриппа A/H3N2 А/Гонконг/1/68 и вируса гриппа A/H5N1 A/Duck/Singapore R/F119-3/97 снижается на 0,5-3,0 lg. Однако данное соединение при повышении концентрации проявляло цитотоксичность. Концентрация, при которой гибнут 50% клеток (CC50), составляет 80 мкг/мл.

3. Сущность изобретения

Сущность изобретения составляет 6-(2'-амино-2'-карбоксиэтилтио)-2-метилтио-4-пивалоилоксиметил-1,2,4-триазоло[5,1-с]1,2,4-триазин-7(4Н)-он формулы (2)

обладающий противовирусным действием.

4. Сведения, подтверждающие возможность осуществления изобретения.

4.1. Синтез 6-(2'-амино-2'-карбоксиэтилтио)-2-метилтио-4-пивалоилоксиметил-1,2,4-триазоло[5,1-с]1,2,4-триазин-7(4Н)-она

Пример 1. К 2-метилтио-6-нитро-4-пивалоилоксиметил-1,2,4-триазоло[5,1-с]1,2,4-триазин-7(4Н)-ону, полученному из 0,05 моль натриевой соли 2-метилтио-6-нитро-1,2,4-триазоло[5,1-с]1,2,4-триазин-7-она, дигидрата действием 0,05 моль хлорметилпивалата с использованием диметилформамида в качестве растворителя, прибавляют раствор 1 эквивалента цистеина в этаноле. По окончании реакции растворитель удаляют в вакууме, а полученный осадок очищают с помощью хроматографической колонки (элюент - ацетонитрил: вода = 8:1).

Выход соединения (2) составляет 51%.

Химическая схема синтеза заявляемого соединения 6-(2'-амино-2'-карбоксиэтилтио)-2-метилтио-4-пивалоилоксиметил-1,2,4-триазоло[5,1-с]1,2,4-триазин-7(4Н)-он (2) имеет следующие физико-химические характеристики: Тпл=204°C; 1H ЯМР спектр в D2O δ, м.д.: 5,18 (д., 1H, CH2), 5,13 (д, 1H, СН2), 4,19 (м., 1H, CH), 3,91 (м., 1H, SCH2), 3,39 (м, 1Н, SCH2), 2,69 (с., 3H, CH3), 1,18 (д., 9H, C(CH3)3). Найдено: С - 40,56, H - 4,77, N - 20,32. Брутто-формула - C14H20N6O5S2. Вычислено: C - 40,38, H - 4,84, N - 20,18%.

Заявляемое соединение представляет собой светло-желтое кристаллическое вещество, растворимое в воде, метаноле, диметилсульфоксиде, нерастворимое в бензоле, эфире и большинстве других растворителей.

4.2. Противовирусные свойства 6(2'-амино-2'-карбоксиэтилтио)-2-метилтио-4-пивалоилоксиметил-4,7-дигидро-1,2,4-триазоло[5,1-с]1,2,4-триазин-7-она (2)

Пример 2. Определение токсичности и противовирусной активности соединений в отношении вируса гриппа

Клетки. Использовали односуточную монослойную эпителиальную культуру клеток MDCK (почка собаки).

Вирусы. Для оценки противовирусной активности использовали эталонный вирус A/Puerto Rico/8/34, а также пандемический вирус гриппа H1N1v А/Санкт-Петербург/2/09 (подобный так называемому вирусу «свиного гриппа» A/California/7/09).

Максимальные переносимые концентрации соединений определяли с помощью МТТ-теста в культуре клеток MDCK.

Проверка токсичности осуществлялась по следующей схеме: навеска весом 5 мг отвешивалась в стерильную пробирку объемом 5 мл и разводилась ростовой средой для клеток MDCK (α-МЕМ, Биолот, Санкт-Петербург) до концентрации 1 мг/мл, получая таким образом базовый раствор. Далее этой же средой делали 8 последовательных двоичных разведении (500; 250; 125; 62,5; 31,25; 15,13; 7,56 и 3,78 мкг/мл соответственно), которые и использовали для проверки токсичности. Опыт ставили в 4 параллелях для каждой концентрации. Односуточную культуру клеток MDCK, выращенных на 96-луночных планшетах (Costar), проверяли визуально в инвертированном микроскопе на целостность монослоя. Планшеты дважды отмывали средой, не содержащей сыворотки, после чего вносили испытуемое соединение в соответствующей концентрации в объеме 100 мкл в каждую лунку. Планшеты инкубировали 72 часа при 37°C в присутствии 5% CO2, после чего регистрировали результаты опыта визуально, оценивая целостность монослоя по сравнению с контролем клеток, и методом МТТ (количественно оценивающем жизнеспособность клеток) с использованием планшетного ридера Hydex Chameleon. Статистическую обработку результатов проводили с использованием программы Statistica 6.0.

Оценку противовирусной активности проводили для 2 концентраций: максимальной концентрации (из двоичных разведении), при которой выживало 100% клеток монослоя, и концентрации, равной половине предыдущей. Для оценки противовирусной активности использовали эталонный вирус A/Puerto Rico/8/34. Односуточную культуру клеток MDCK, выращенных на 96-луночных планшетах (Costar), проверяли визуально в инвертированном микроскопе на целостность монослоя. Далее готовили десятикратные вирусные разведения на поддерживающей ростовой среде с добавлением трипсина (с -1 по -6). Планшеты с монослоем клеток дважды отмывали средой, не содержащей сыворотки, после чего вносили вирусные разведения в соответствующие лунки планшета в объеме 50 мкл. Контрольные лунки заполняли ростовой средой в равном объеме. Планшеты инкубировали 60 мин при 37°C в присутствии 5% CO2, после чего отмывали средой для того, чтобы удалить не связывающиеся с клетками вирусные частицы. Далее вносили препарат в лунки с вирусными разведениями по 100 мкл в соответствующей концентрации. Каждая концентрация исследуемого соединения была поставлена в четырех параллелях для каждого вирусного разведения. Контрольные лунки заполняли ростовой средой в том же объеме. Также оставляли лунки для повторной проверки токсичности используемых концентраций. Планшеты инкубировали 72 часа при 37°C, после чего регистрировали результаты опыта визуально, оценивая целостность монослоя по сравнению с контролем клеток и степень цитопатического действия вируса на культуру клеток, ставили реакцию гемагглютинации и использовали метод МТТ для количественной оценки жизнеспособности клеток с использованием планшетного ридера Hydex Chameleon.

Статистическую обработку результатов проводили с использованием программы Statistica 6.0 [Боровиков В.П., Боровиков И.П. Statistica. Статистический анализ и обработка данных в среде Windows. - М., 1997. - С.33-34], применяя регрессионный анализ [Рокицкий П.Ф. Биологическая статистика. - Минск, 1967. - С.155]. Результаты представлены с помощью графиков, полученных на основе уравнения линейной регрессии, имеющего общий вид y=k+b*x, в котором переменная у выражена через константу k и угловой коэффициент b, умноженный на переменную х. При этом на графике указывается коэффициент детерминации, обозначенный как r2 и выражающий разброс значений около линии регрессии по отношению к общему разбросу значений. Чем ближе значение r2 к 1, тем лучше данная модель объясняет изменчивость соответствующих переменных. Доверительный интервал для всех регрессионных уравнений был равен 95%.

Оценка токсичности заявляемого соединения

Оценка токсичности, как и оценка противовирусного действия препаратов, производилась тремя методами:

1) Наблюдение и оценка целостности монослоя клеток под инвертированным микроскопом. Подразумевает сравнение морфологии клеток контрольных лунок с опытными и регистрацию изменений под воздействием агента (препарата, вируса и т.д.). Изменение морфологии может включать нарушение целостности монослоя, изменения формы клеток, проявление цитопатического действия при вирусной инфекции.

2) Регистрация присутствия вируса в реакции гемагглютинации со взвесью куриных эритроцитов (0,75%). Реакция гемагглютинации (РГА) позволяет оценить качественное присутствие вируса в пробе.

3) Метод МТТ. Метод, используемый при оценке лекарственной чувствительности, основанный на способности дегидрогеназ живых клеток восстанавливать неокрашенные формы 3-4,5-диметилтиазол-2-ил-2,5-дифенилтераразола (МТТ-реагента) до голубого кристаллического фармазана, растворимого в диметилсульфоксиде или 96% спирте. Насыщенность окраски свидетельствует об интенсивности метаболических процессов в клетках, т.е. о нормальном уровне жизнеспособности. Интенсивность окраски фиксируется с помощью спектрофотометра, и получаемые значения оптической плотности могут быть использованы для статистической обработки данных.

Установлено, что концентрация препарата при которой гибнет 50% клеток монослоя в условиях тестирования на клетках MDCK, составила 177 мкг/мл. Концентрация препарата, при которой выживают все клетки монослоя, составила 62,5 мкг/мл, которая и была использована для проверки антивирусной активности препарата.

В условиях данного тестирования жизнеспособность клеток в контроле составила 0,571±0,044. Таким образом, значение оптической плотности, при которой выживает 50% клеточного монослоя, составляет 0,286. Если отложить данное значение на оси ординат графика, представленного на рис.1, провести через него прямую, параллельную оси абсцисс, а затем из точки пересечения этой прямой с графиком жизнеспособности провести перпендикуляр на ось абсцисс, то мы получим значение, соответствующее концентрации заявляемого соединения, при котором гибнет 50% клеток монослоя (см. рис.2).

Оценка противовирусной активности

Заявляемое соединение по всем трем методам оценки (концентрация = 62,5 мкг/мл) обладало выраженной противовирусной активностью, снижая вирусные титры на 3 lg относительно контроля инфекционной активности вируса.

При построении графика, соответствующего действию заявляемого соединения, коэффициент детерминации r2 был равен 0,86, что говорит о том, что данная модель хорошо объясняет изменчивость тестируемых переменных, а именно эффект тестируемого соединения на клетки, инфицированные вирусом гриппа. При построении перпендикуляров через точки, соответствующие оптической плотности, при которой выживают 50% клеток монослоя, на оси ординат и через точку пересечения данного перпендикуляра с прямой, соответствующей жизнеспособности клеток в условиях применения препарата, имеем следующий график, представленный на рис.3.

Из рисунка 3 следует, что точка пересечения перпендикуляра с осью абсцисс соответствует значению lg вирусного разведения, равного -3,5. С учетом того, что вирус в отсутствии препарата инфицирует клеточный монослой до значения, равного

10-6,5 (инфекционная активность вируса, выясненная в отдельном тестировании при проверке биологических свойств вируса A/PR/8/34), можно говорить о том, что применение данного препарата в условиях in vitro снижает инфекционную активность вируса на 3lg.

Из данных, приведенных выше, видно, что соединение-прототип (1) более токсично, чем заявляемое соединение (для соединения (1) СС50=80 мкг/мл, а для заявляемого соединения CC50=177 мкг/мл). Соединение (1) практически не активно в отношении пандемического вируса гриппа A/H1N1v, штамм - А/Санкт-Петербург/2/09 (A/California/7/09-подобный). В то же время заявляемое соединение (2) в значительно меньших концентрациях, в сравнении с токсическими, обладает выраженной противовирусной активностью, снижая титры вирусов A/Puerto Rico/8/34 и вируса пандемического гриппа H1N1v А/Санкт-Петербург/2/09 (A/California/7/09-подобный) на 3,0 lg в концентрациях 62,5 и 125 мкг/мл соответственно, то есть является более активным противовирусным соединением по сравнению с соединением-прототипом.

6-(2'-Амино-2'-карбоксиэтилтио)-2-метилтио-4-пивалоилоксиметил-1,2,4-триазоло[5,1-с]1,2,4-триазин-7(4H)-он формулы (2)



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к области органической химии и касается синтеза гетероциклических соединений - производных 5,6-дигидро-7Н-пирроло[1,2-d][1,4]бензодиазепин-6-она формулы 1 а-д кипячением 2-амино-N-(2-фуран-2-ил-фенил)-ацетамидов в смеси ледяной уксусной кислоты и концентрированной соляной кислоты с последующей обработкой гидрокарбонатом натрия при кипячении.

Изобретение относится к области антивирусной терапии и, в частности, к ненуклеозидным соединениям, которые ингибируют ВИЧ обратную транскриптазу и применяются для лечения болезней, опосредуемых вирусом иммунодефицита человека (ВИЧ).

Изобретение относится к аморфной форме N-{2-фтор-5-[3-(тиофен-2-карбонил)-пиразоло[1,5-а]-пиримидин-7-ил]-фенил}-N-метил-ацетамида, способам ее получения, фармацевтическим композициям для ингибирования GABA-рецепторов, включающим указанную форму, а также к ее применению в качестве лекарственного средства для лечения и/или предупреждения тревоги, эпилепсии, нарушений сна и бессонницы, для индукции седативно-гипнотического эффекта, для анестезии и расслабления мускулатуры и для модулирования времени, необходимого для индукции сна и его продолжительности.

Изобретение относится к замещенным пиразолопиримидиновым производным формулы (I), где Y1, Y2, Y 3, Y4 представляют собой N или С-, где, по меньшей мере, две группы из Y1-Y4 представляют собой атом углерода, R1 представляет собой хлор или бром, R2-R7 представляют собой, например, водород, метил или этил; и R10 и R11 независимо представляют собой, например, водород или С1-С 6алкил, их оптическим изомерам и фармацевтически приемлемым солям.

Изобретение относится к новым кислотно-аддитивным солям производного пирролопиримидинона, представленного формулой (1), которые выбирают из гентизатной, малеатной, нитратной, фумаратной и полутартратной солей, которые обладают улучшенными свойствами при их использовании, в частности повышенной стабильностью.

Изобретение относится к соединениям формулы (I) и их фармацевтически приемлемым солям. .

Изобретение относится к полиморфу 2-[4-(3-хинолин-6-илметил-3Н-[1,2,3]триазоло[4,5-b]пиразин-5-ил)пиразол-1-ил]этанола, в частности к новой кристаллической фосфатной соли 2-[4-(3-хинолин-6-илметил-3Н-[1,2,3]триазоло[4,5-b]пиразин-5-ил)пиразол-1-ил]этанола.

Изобретение относится к соединению формулы I в которой: Х8 представляет собой N, а X 5 и X6 представляют собой СН; R7 представляет собой фенил или C5-6-гетероарильную группу, необязательно замещенную одной или несколькими группами, выбранными из галогена, гидроксигруппы, нитрогруппы, цианогруппы, карбоксигруппы и тиола, или фенила, или метоксигруппы, -С(=O)СН3, -С(=O)ОСН3, -С(=O)ОСН2СН3, -С(=O)ОС(СН 3)3, -C(=O)NH2, -С(=O)NHCH3 , -C(=O)N(CH3)2, -С(=O)NHCH2 CH3, -С(=O)N(СН2СН3)2 , -NH2, -NHCH3, -N(СН3) 2, -NHCH(СН3)2, -N(СН2 СН3)2 или C1-4-алкила, необязательно замещенного гидроксигруппой; RN3 и RN4, вместе с атомом азота, к которому они присоединены, образуют гетероциклическое кольцо, выбранное из морфолинового, тиоморфолинового, пиперидинильного, пиперазинильного, гомопиперазинильного и пирролидинильного кольца, необязательно замещенного на атоме углерода одной или двумя C1-4-алкильными группами; R2 представляет собой NRN5RN6, где RN5 и R N6, вместе с атомом азота, к которому они присоединены, образуют гетероциклическое кольцо, выбранное из морфолинового, тиоморфолинового, пиперидинильного, пиперазинильного, гомопиперазинильного и пирролидинильного кольца, необязательно замещенного на атоме углерода одной или двумя C1-4-алкильными группами; или его фармацевтически приемлемая соль, и где "С5-6 -гетероарил" означает гетероарильную группу, выбранную из фурана, тиофена, пиррола, имидазола, пиразола, триазола, оксазола, изоксазола, тиазола, изотиазола, оксадиазола, тетразола, оксатриазола, изоксазина, пиридина, пиридазина, пиримидина, пиразина и триазина; и где "С3-5-гетероциклил", как здесь используется, относится к одновалентной структуре, получаемой путем удаления атома водорода из кольцевого атома гетероциклического соединения, где эта структура содержит 5 или 6 кольцевых атомов, из которых от 1 до 4 являются кольцевыми гетероатомами, выбранными из кислорода, азота и серы; и при условии, что когда R2 представляет собой незамещенную морфолиновую группу, RN3 и R N4 вместе с атомом азота, к которому они присоединены, образуют незамещенную морфолиновую группу, R7 не представляет собой незамещенный фенил, и когда R2 представляет собой незамещенный пиперидинил, RN3 и RN4 вместе с атомом азота, к которому они присоединены, образуют незамещенный пиперидинил, R7 не представляет собой незамещенный фенил.

Изобретение относится к медицине, а именно средству с активностью против семейства герпес-вирусов, представляющему собой соль (2,6-дихлорфенил)амида карбопентоксисульфаниловой кислоты общей формулы: где X - Na, К, NH4.
Изобретение относится к фармакологии, а именно к средству для профилактики или лечения herpes labialis или herpes genitalis. .
Изобретение относится к медицине, а именно к вирусологии, фармации, и предназначено для лечения герпетических инфекций. .

Изобретение относится к соединению формулы (I), где R1 выбран из Н, F, Сl, Вr, СF3, C 1-С6 алкокси и ОН; R2 выбран из Н и C1-С6 алкил; n является 1-5; m является 0 или 1; и Y выбран из CH2, NR3, (NR 3R4)+X-, О и S; R 3 и R4 независимо выбраны из Н и C1 -C4 алкил; и X- выбран из фармацевтически приемлемых анионов.
Изобретение относится к медицине и предназначено для лечения затяжных вариантов течения желтухи у новорожденных. .
Изобретение относится к медицине, а именно к инфекционным болезням, и может быть использовано при лечении герпетической инфекции. .

Изобретение относится к новым гидратированным N-фуллерен-аминокислотам общей формулыC60(Н)3{NH(СН 2)nCOOH}3·xH2O, где С60 представляет фуллерен, n=5-7, x=8-10, которые обладают активностью против вируса герпеса, вирусов гриппа различной природы, ВИЧ, а также противоопухолевой и противопсориатической активностью

Изобретение относится к области биологически активных соединений и касается 6--2-метилтио-4-пивалоилоксиметил-1,2,4-триазоло[5,1-с]1,2,4-триазин-7-она, обладающего противовирусным действием, предназначенного для лечения и профилактики вирусных инфекционных заболеваний животных и человека

Наверх