Питательная среда для размножения яблони и груши in vitro
Владельцы патента RU 2486237:
Государственное научное учреждение Всероссийский научно-исследовательский институт садоводства им. И.В. Мичурина Российской академии сельскохозяйственных наук (ГНУ ВНИИС им.И.В.Мичурина Россельхозакадемии) (RU)
Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в процессе клонального микроразмножения яблони и груши на этапе собственно микроразмножения. Питательная среда содержит кальций азотнокислый, тиамин, пиридоксин, никотиновую кислоту, аскорбиновую кислоту, мезоинозит, сахарозу, агар-агар, 6-бензиламинопурин, удобрение Мастер марки 3.11.38+4 и дистиллированную воду в заданном соотношении компонентов. Изобретение позволяет улучшить качество и количество побегов, оптимальной для укоренения длины и упростить технологию приготовления питательной среды. 3 табл., 2 пр.
Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в процессе клонального микроразмножения яблони и груши на этапе собственно микроразмножения.
Известно, что для пролиферации побегов яблони и груши in vitro используют питательные среды на основе прописи Мурасиге-Скуга (Туровская Н.И. Микроразмножение яблони и груши // Садоводство и виноградарство. - 1994. - №1. - С.10-12) и Кворина-Лепуавра (Минаев В.А., Верзилин А.В., Высоцкий В.А. Клональное микроразмножение слаборослых клоновых подвоев яблони селекции Мич. ГАУ // Садоводство и виноградрство. - 2003. - №5. - С.12-13). Однако процесс приготовления питательных сред трудоемок и требует значительных затрат времени, т.к. вышеуказанные среды содержат большое количество необходимых для роста и развития растений макро- и микроэлементов, которые группируются, в зависимости от химических свойств, в отдельные маточные растворы и используются, по мере надобности. При хранении маточных растворов возможно их инфицирование, что требует приготовления новых и увеличивает ресурсо- и энергозатраты на выращивание растений-регенерантов.
Задачей, на решение которой направлено изобретение, является упрощение технологического процесса приготовления питательных сред и оптимизация их состава для пролиферации побегов яблони и груши.
Сущность изобретения состоит в том, что в качестве базовой среды для пролиферации побегов яблони и груши используют водорастворимое удобрение Мастер марки 3.11.38+4, содержащее комплекс макро- и микроэлементов, %: азот (NO3 -) - 3; фосфор (Р2O5) - 11; калий (K2O) - 38; магний (MgO) - 4; бор (B) - 0,02; железо (Fe) - 0,07; марганец (Mn) - 0,03; цинк (Zn) - 0,01; медь (Cu) - 0,005; молибден (Mo) - 0,001. Микроэлементы (Mn, Zn, Cu, Fe) содержатся в хелатной форме. Данное комплексное вещество применяют вместо основных макро- и микрокомпонентов, входящих в состав питательных сред по прописям Мурасиге-Скуга (1962) и Кворина-Лепуавра (1997): аммония азотнокислого (NH4NO3), калия азотнокислого (KNO3), магния сернокислого (MgSO4·7H2O), калия фосфорнокислого однозамещенного (КН2РO4), натрия ЭДТА (Na2 ЭДТА), железа сернокислого (FeSO4·7H2O), борной кислоты (Н3ВO3), кобальта хлористого (СоСl2·6Н2O), меди сернокислой (CuSO4·5H2O), марганца сернокислого (MnSO4·H2O), калия йодистого (KI), цинка сернокислого (ZnSO4·7H2O), натрия молибденовокислого (Na2MoO4·2H2O) (табл.1). Помимо комплексного водорастворимого удобрения Мастер марки 3.11.38+4 в состав предлагаемой питательной среды входят, мг/л: кальций азотнокислый (Са(NO3)2·4Н2O) - 833,8; тиамин, пиридоксин, никотиновая кислота - по 0,5; аскорбиновая кислота - 1,5; мезоинозит - 100; сахароза - 30000, агар-агар - 8000; 6-бензиламинопурин - 1-2; вода дистиллированная - до 1 л.
Заявляемая питательная среда отличается от известных прототипов тем, что в ее состав входит комплексное водорастворимое удобрение Мастер марки 3.11.38+4. Это позволяет сделать вывод о соответствии заявляемого технического решения критерию «новизна».
Представленное техническое решение обладает изобретательским уровнем, т.к. предлагаемый состав питательной среды не был использован для размножения яблони и груши in vitro, т.е. предложен впервые.
Все компоненты предложенной питательной среды производятся промышленностью, поэтому изобретение может быть реализовано в условиях учреждений, работающих в области культуры тканей и органов растений.
Пример 1. Готовят агаризованную питательную среду, состоящую из следующих компонентов, мг/л: комплексное водорастворимое удобрение Мастер марки 3.11.38+4 - 4,0; кальций азотнокислый (Ca(NO3)2·4H2O) - 833,8; тиамин, пиридоксин, никотиновая кислота - по 0,5; аскорбиновая кислота - 1,5; мезоинозит - 100; сахароза - 30000, агар-агар - 8000; 6-бензиламинопурин - 1,0-2,0. Объем доводят дистиллированной водой до 1 л, устанавливают pH 5,6-5,8 (табл.1, среда 1). Питательную среду разливают по культивационным сосудам и автоклавируют при давлении 1 атм. в течение 15-20 минут. После охлаждения питательной среды производят высадку побегов. Контрольные побеги высаживают на агаризованную питательную среду по прописи Кворина-Лепуавра (QL). Культивирование проводят в культуральной комнате при температуре 24±2°C, освещенности 3-5 тыс. люксов, длине светового периода 16 часов. Опыты выполняют в 3-кратной повторности. Учеты проводят через 5-6 недель.
Как видно из таблицы 2, на разработанной питательной среде увеличение коэффициента размножения в 2,5 раза отмечается у сорта яблони Лобо по сравнению с контролем, а у подвоев 76-8-13 и ПБ 9 по данному показателю существенных различий не наблюдается. Культивирование эксплантов на предлагаемой питательной среде улучшает качество и увеличивает количество побегов, оптимальной для укоренения длины на 10,7-23,7%.
Пример 2. Среду готовят и культивирование эксплантов проводят аналогично примеру 1. Компоненты питательной среды те же, за исключением комплексного водорастворимого удобрения Мастер марки 3.11.38+4, концентрацию которого увеличивают до 6,0 мг/л (табл.1, среда 2).
Как видно из таблицы 3, предлагаемая среда способствует увеличению количества побегов, пригодных для укоренения у подвоя яблони 57-545 на 13,4%, подвоев груши ПГ 12 и ПГ 2 на 22,5 и 43,6%, соответственно. Существенных различий по коэффициенту размножения не наблюдается. У сорта груши Осенняя Яковлева при культивировании эксплантов на разработанной питательной среде снижение регенерационной способности не отмечается.
Таким образом, на основании полученных данных можно сделать вывод, что использование в качестве базовой среды на этапе пролиферации водорастворимого удобрения Мастер марки 3.11.38+4 улучшает качество и увеличивает количество побегов, оптимальной для укоренения длины и не снижает регенерационную способность побегов яблони и груши. Предлагаемый компонент значительно упрощает технологию приготовления питательных сред за счет исключения приготовления маточных растворов, что существенно снижает ресурсо- и энергозатраты.
| Таблица 1 | ||||
| Питательная среда для размножения яблони и груши in vitro | ||||
| Компоненты | Мурасиге-Скуга, мг/л | Кворина-Лепуавра (QL), мг/л | Среда 1, мг/л | Среда 2, мг/л |
| Мастер 3.11.38+4 | - | - | 4,0 | 6,0 |
| NH4NO3 | 1650 | 400 | - | - |
| KNO3 | 1900 | 1800 | - | - |
| КН2РO4 | 170 | 270 | - | - |
| MgSO4·7H2O | 370 | 360,4 | - | - |
| СаСl2·2Н2O | 440 | - | - | - |
| Ca(NO3)2·4H2O | - | 833,8 | 833,8 | 833,8 |
| FeSO4·7H2O | 27,8 | 27,8 | 27,8 | 27,8 |
| Na2 ЭДТА | 37,3 | 37,3 | 37,3 | 37,3 |
| MnSO4·4H2O | 22,3 | - | - | - |
| MnSO4·H2O | - | 0,76 | - | - |
| H3BO3 | 6,2 | 6,2 | - | - |
| ZnSO4·7H2O | 8,6 | 8,6 | - | - |
| KI | 0,83 | 0,08 | - | - |
| Na2MoO4·2H2O | 0,25 | 0,25 | - | - |
| CuSO4·5H2O | 0,025 | 0,025 | - | - |
| CoCl2·6H2O | 0,025 | 0,025 | - | - |
| Тиамин | 0,5 | 0,5 | 0,5 | 0,5 |
| Пиридоксин | 0,5 | 0,5 | 0,5 | 0,5 |
| Никотиновая кислота | 0,5 | 0,5 | 0,5 | 0,5 |
| Аскорбиновая кислота | 1,5 | 1,5 | 1,5 | 1,5 |
| Мезоинозит | 100 | 100 | 100 | 100 |
| Сахароза | 30000 | 30000 | 30000 | 30000 |
| Агар | 8000 | 8000 | 8000 | 8000 |
| 6-бензиламинопурин | 1,0-2,0 | 1,0-2,0 | 1,0-2,0 | 1,0-2,0 |
| Таблица 2 | |||
| Питательная среда для размножения яблони и груши in vitro | |||
| Подвой, сорт | Питательная среда | Коэффициент размножения, шт./эксплант | Количество побегов длиной более 1,5 см, %. |
| 76-8-13 | QL | 7,4 | 39,0b* |
| Среда 1 | 7,5 | 58,6а | |
| HCP05 | Fфакт<Fтеор | ||
| ПБ9 | QL | 6,1 | 33,3b |
| Среда 1 | 5,7 | 57,1а | |
| НСР05 | Fфакт<Fтеор | ||
| Лобо | QL | 1,5 | 47,7а |
| Среда 1 | 3,8 | 58,4а | |
| HCP05 | 1,6 | ||
| * - существенность различий по количеству побегов длиной более 1,5 см оценивается с помощью t-критерия Дункана |
| Таблица 3 | |||
| Питательная среда для размножения яблони и груши in vitro | |||
| Подвой, сорт | Питательная среда | Коэффициент размножения, шт./эксплант | Количество побегов длиной более 1,5 см, % |
| 54-545 | QL | 6,7 | 31,1а* |
| Среда 2 | 6,8 | 44,5а | |
| НСР05 | Fфакт<Fтeop | ||
| ПГ2 | QL | 6,3 | 39,1b |
| Среда 2 | 6,3 | 82,7а | |
| НСР05 | Fфакт<Fтeop | ||
| ПГ12 | QL | 10,2 | 55,1b |
| Среда 2 | 8,4 | 77,6а | |
| НСР05 | Fфакт<Fтeop | ||
| Осенняя Яковлева | QL | 2,2 | 55,0а |
| Среда 2 | 2,9 | 50,8а | |
| НСР05 | Fфакт<Fтeop | ||
| * - существенность различий по количеству побегов длиной более 1,5 см оценивается с помощью t-критерия Дункана |
Используемая литература
1. Туровская, Н.И. Микроразмножение яблони и груши / Н.И.Туровская // Садоводство и виноградарство. - 1994. - №1. - С.10-12.
2. Минаев, В.А. и др. Клональное микроразмножение слаборослых клоновых подвоев яблони селекции Мич. ГАУ / В.А.Минаев, А.В.Верзилин, В.А.Высоцкий // Садоводство и виноградрство. - 2003. - №5. - С.12-13.
Питательная среда для пролиферации побегов яблони и груши in vitro, содержащая кальций азотнокислый, тиамин, пиридоксин, никотиновую кислоту, аскорбиновую кислоту, мезоинозит, сахарозу, агар-агар, 6-бензиламинопурин, воду дистиллированную, отличающаяся тем, что она содержит комплексное водорастворимое удобрение Мастер марки 3.11.38+4, являющееся источником азота, фосфора, калия и микроэлементов, при следующем соотношении компонентов, мг/л:
| Мастер марки 3.11.38+4 | 4,0-6,0 |
| кальций азотнокислый (Са(NO3)2)·4Н2O) | 833,8 |
| тиамин, пиридоксин, никотиновая кислота | по 0,5 |
| аскорбиновая кислота | 1,5 |
| мезоинозит | 100 |
| сахароза | 30000 |
| агар-агар | 8000 |
| 6-бензиламинопурин | 1,0-2,0 |
| дистиллированная вода | до 1 л |
