Средство для снижения репродукции вируса гепатита с
Владельцы патента RU 2526179:
Общество с ограниченной ответственностью "ГамаВетФарм" (RU)
Изобретение относится к противовирусным средствам и представляет собой средство для снижения репродукции вируса гепатита С, содержащее хотя бы один полипренилфосфат или полипренилпирофосфат с количеством изопреновых звеньев от 9 до 20, преимущественно - от 13 до 18, либо смесь различных полипренилфосфатов или различных полипренилпирофосфатов, либо смесь различных полипренилфосфатов и полипренилпирофосфатов с указанным количеством изопреновых звеньев в массовом соотношении от 5:1 до 20:1. Изобретение обеспечивает снижение токсичности, распространение действия на большинство штаммов вируса гепатита С и сохранение противовирусного действия при длительном применении. 3 з.п. ф-лы, 1 табл., 2 ил.
Изобретение относится к противовирусным средствам, в частности к средствам для снижения репродукции вируса гепатита С.
Известно средство для снижения репродукции вируса гепатита С рибавирин (1-[(2R,3R,4S,5R)-3,4-дигидрокси-5-(гидроксиметил)оксолан-2-ил]-1Н-1,2,4-триазол-3-карбоксамид) (Стандарт медицинской помощи больным хроническим вирусным гепатитом (гепатит В, дельта и С). Утвержден приказом Минздравсоцразвития РФ от 21 июля 2006 г. №571. Ф.И. Ершов Антивирусные препараты. Медицина, М., 1998, 188 с. Ершов Ф.И. Антивирусные препараты. Справочник 2-е издание // М, ГЕОТАР-Медиа, 2006).
Одним из побочных эффектов является гемолитическая анемия, в запущенной форме вызывающая смерть пациента (в связи с чем требуется тотальный контроль показателей крови в процессе лечения). Рибавирин также является тератогеном.
Известно средство для подавления репродукции вируса гепатита С альфа-интерферон (ИФН-α) (Стандарт медицинской помощи больным хроническим вирусным гепатитом (гепатит В, дельта и С). Утвержден приказом Минздравсоцразвития РФ от 21 июля 2006 г. №571. Ф.И. Ершов Антивирусные препараты. Медицина, М., 1998, 188 с. Ершов Ф.И. Антивирусные препараты. Справочник. 2-е издание // М, ГЕОТАР-Медиа, 2006).
Известное средство эффективно в достаточно больших дозах, при которых проявляется его высокая токсичность. Кроме того, существуют штаммы вируса гепатита С, устойчивые к ИФН-α. К прочим же штаммам вируса гепатита С при длительном применении формируется устойчивость.
Технический результат от использования предлагаемого средства заключается в снижении токсичности, распространении действия на большинство штаммов вируса гепатита С и сохранении противовирусного действия при длительном применении.
Указанный технический результат достигается тем, что средство для снижения репродукции вируса гепатита С содержит хотя бы один полипренилфосфат или полипренилпирофосфат с количеством изопреновых звеньев от 9 до 20, преимущественно - от 13 до 18, либо смесь различных полипренилфосфатов или различных полипренилпирофосфатов, либо смесь различных полипренилфосфатов и полипренилпирофосфатов с указанным количеством изопреновых звеньев в массовом соотношении от 5:1 до 20:1.
Указанный технический результат достигается тем, что средство для снижения репродукции вируса гепатита С содержит полипренилфосфаты и/или полипренилпирофосфаты с количеством изопреновых звеньев от 9 до 13.
Указанный технический результат достигается тем, что средство для снижения репродукции вируса гепатита С содержит полипренилфосфаты и/или полипренилпирофосфаты с количеством изопреновых звеньев от 12 до 20.
Указанный технический результат достигается также тем, что массовое соотношение в смеси полипренилфосфатов и полипренилпирофосфатов составляет 9:1.
Под различными полипренилфосфатами и различными полипренилпирофосфатами понимаются полипренилфосфаты и полипренилпирофосфаты с различным количеством изопреновых звеньев.
В основу изобретения были положены данные, полученные на полипренолах и полипренилфосфатах, выделенных из древесной зелени пихты, березы, шелковицы и гинкго билоба, которые как по литературным, так и по нашим данным в совокупности содержат смесь олигомергомологов с длиной цепи от 7 до 30 (Обзор. Swiezewska E et al. Acta Biochim Pol. 1994; 41(3): 221-60).
Полученные с помощью HPLC хроматограммы некоторых из них приведены на фиг.1 (HPLC хроматограмма ППФ из хвои пихты) и фиг.2 (HPLC хроматограмма ППФ из листьев шелковицы).
Пики на первой из них соответствуют длине цепи от 12 до 20 изопреновых звеньев, пики на второй - олигомергомологам с длиной цепи от 9 до 13 изопреновых звеньев.
При фосфорилировании полипренолов около 10% образующихся продуктов имеют форму пирофосфата.
Известно (http://chemister.ru/Database/Tables/ld.php?pageNum=30), что летальная доза, при которой гибнут 50% подопытных животных - ЛД50, для рибавирина составляет: при исследовании на мышах - 1300 мг/кг, при исследовании на крысах - 5300 мг/кг.
Снижение токсичности ППФ рассматривается как признак, связанный с молекулой ППФ. Проведенные исследования острой и хронической токсичности препаратов на основе ППФ с количеством изопреновых звеньев 9-13 (в случае полипренилфосфатов из листьев шелковицы, сокр. морапренилфосфатов) и 12-20 (в случае полипренилфосфатов из хвои пихты, сокр. пинопренилфосфатов) показали их чрезвычайно низкую токсичность. Изучение острой токсичности полипренилфосфатов (ППФ) проводили на мышах и крысах. Установлено, что LD50 для мышей, равная 12,5 г/кг веса животного, на порядки превышает среднюю терапевтическую дозу 0,25-0,35 мг/кг веса животного. ЛД50 при исследовании на крысах определить не удалось вследствие невозможности достижения концентрации препарата, вызывающей гибель животных. Исследовано цитотоксическое действие препарата в отношении ряда клеточных линий. Патологогистологические исследования органов и тканей животных, получавших ППФ в дозах, значительно превышающих эквитерапевтическую, не выявили серьезных изменений со стороны органов и тканей экспериментальных животных (Правила доклинической оценки безопасности фармакологических средств. // М., 1992). При изучении хронической токсичности ППФ на крысах патоморфологические, гистологические, биохимические, гематологические показатели экспериментальных животных были близки к таковым в контрольной группе. В восстановительном периоде не отмечено каких-либо эффектов, связанных с отменой препарата (Об экспериментальном исследовании, характеризующем безвредность Фортепрена // Отчет ГУ НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи РАМН, М., 2005, 127 с.).
Средство для снижения репродукции вируса гепатита С используют следующим образом.
В однодневный монослой культуры перевиваемых клеток почек эмбриона свиньи (СПЭВ) сразу после их заражения или за 24 часа до заражения цитопатогенным вариантом вируса гепатита С (ВГС) вносят полипренилфосфат натрия (ППФ).
ППФ использовали в различных концентрациях от 60 до 7,5 мкг в 50 мкл.
В качестве контроля использовали плацебо, который разводили так же, как ППФ.
Для заражения монослоя культуры СПЭВ использовали цитопатогенный вариант ВГС, выделенный из сыворотки крови хронически инфицированной ВГС больной. По данным генотипирования, изолированный вариант ВГС относится к наиболее распространенному в России генотипу 1b ВГС. ВГС использовали в инфекционной дозе 10,0 ТЦД50 (ТЦД50 - индуцированная вирусом тканевая цитопатогенная доза, вызывающая деструкцию 50% клеток в монослое).
В качестве тест-культуры клеток были выбраны высокочувствительные к цитопатогенному действию ВГС культуры перевиваемых клеток почек эмбриона свиньи (СПЭВ), полученные из фирмы «Нарвак», Москва. Их использовали в виде однодневного монослоя клеток, выращенного в 24-луночных пластиковых панелях. Культуры клеток СПЭВ выращивали на среде 199 с 10% сыворотки эмбриона телят, с добавлением глютамина и антибиотиков: пенициллина и стрептомицина (100 ЕД/мл).
Для титрования остаточной инфекционной активности вируса использовали ту же линию клеток (СПЭВ).
ППФ вносили в культуры клеток СПЭВ сразу после заражения, за 24 часа до заражения или спустя 24 часа после заражения клеток ВГС.
Была произведена прямая оценка противовирусного действия ППФ в культурах клеток СПЭВ, инфицированных вирусом гепатита С.
Инфекционную активность ВГС, содержащегося в пробах среды, отобранных на 3-й день из инфицированных ВГС культур клеток, учитывали по результатам титрования на 6-й день после инфицирования, используя формулу Рида и Менча для подсчета титра вируса гепатита С.
В таблице 1 представлены данные титрования проб культуральной среды, собранных из ВГС инфицированных культур клеток СПЭВ, обработанных ППФ в различных дозах сразу после заражения клеток, за 24 часа до заражения и спустя 24 часа после заражения.
| Таблица 1 | |||||
| Противовирусная активность ППФ в отношении инфекции, вызванной вирусом гепатита С в культурах клеток СПЭВ | |||||
| Время обработки культур клеток препаратом | Титры ВГС (lg ТЦД50) в пробах среды, отобранных из культур клеток СПЭВ на 3-й день после инфекции и обработки препаратом в различных дозах (мкг) (регистрация на 6-й день после заражения) клеток) | ||||
| 60.0 | 30,0 | 15,0 | 7,5 | Контроль вируса | |
| В момент инфекции | 2,6 | 3,7 | 4,8 | 5,5 | 5,6 |
| За 24 часа до инфекции | 2,5 | 4,6 | 3,7 | 2,8 | 6,0 |
| Через 24 часа после инфекции | 4,2 | 4,3 | 5,0 | 3,7 | 4,3 |
Показано, что ППФ обладает противовирусными свойствами в случае его добавления в культуры клеток сразу же после заражения ВГС. В частности, установлено, что под действием препарата титры ВГС снижались на 3,0 lg (доза препарата - 60 мкг) и на 1,9 lg (доза препарата 30 мкг).
Положительный эффект был получен также в случае профилактического применения ППФ. Так при внесении препарата в дозе 60 мкг за 24 часа до заражения клеток СПЭВ титры ВГС снижались на 3,5 lg. При профилактическом применении малых доз препарата - 7,5 и 15,0 мкг также наблюдали явный противовирусный эффект, т.е. снижение инфекционной активности ВГС на 3,2 и 2,3 lg, соответственно.
Таким образом, установлено, что:
- ППФ в испытанных дозах обладает способностью снижать концентрацию инфекционного вируса гепатита С (ВГС) в культурах клеток СПЭВ;
- антивирусная активность ППФ в отношении ВГС инфекции отмечалась в условиях, когда препарат добавляли сразу же после заражения клеток или за 24 часа до заражения культур клеток СПЭВ. В этих условиях максимальное снижение титров ВГС под действием препарата в дозе 60 мкг в 50 мкл составляло 3,0-3,5 lg соответственно.
Показано усиление антивирусной активности малых доз препарата (до 7,5 мкг) при профилактическом применении: за 24 часа до заражения клеток.
1. Средство для снижения репродукции вируса гепатита С, содержащее хотя бы один полипренилфосфат или полипренилпирофосфат с количеством изопреновых звеньев от 9 до 20, преимущественно - от 13 до 18, либо смесь различных полипренилфосфатов или различных полипренилпирофосфатов, либо смесь различных полипренилфосфатов и полипренилпирофосфатов с указанным количеством изопреновых звеньев в массовом соотношении от 5:1 до 20:1.
2. Средство для снижения репродукции вируса гепатита С по п.1, отличающееся тем, что оно содержит полипренилфосфаты и/или полипренилпирофосфаты с количеством изопреновых звеньев от 9 до 13.
3. Средство для снижения репродукции вируса гепатита С по п.1, отличающееся тем, что оно содержит полипренилфосфаты и/или полипренилпирофосфаты с количеством изопреновых звеньев от 12 до 20.
4. Средство для снижения репродукции вируса гепатита С по любому из пп.1-3, отличающееся тем, что массовое соотношение в смеси полипренилфосфатов и полипренилпирофосфатов составляет 9:1.
