Среда высушивания жидкая для стабилизации биомассы вторичного сбора чумного микроба вакцинного штамма ev


 


Владельцы патента RU 2528069:

Федеральное казённое учреждение здравоохранения Ставропольский научно-исследовательский противочумный институт Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (RU)

Изобретение относится к биотехнологии и микробиологии и представляет собой жидкую среду высушивания для стабилизации биомассы вторичного сбора чумного микроба вакцинного штамма EV. Среда содержит 8,0-12,0 г/л желатина медицинского; 80,0-120,0 г/л сахарозы; 8,0-12,0 г/л тиомочевины; 2-3 мл 20% раствора натрия едкого в чешуйках и воду для инъекций до 1 л. Настоящее изобретение позволяет получить качественную жидкую среду высушивания для стабилизации биомассы вторичного сбора чумного микроба вакцинного штамма EV с повышенными стабилизирующими свойствами и может быть использовано для приготовления суспензии для инъекций, накожного скарификационного нанесения в ампулы объеме 1 мл. 3 пр.

 

Изобретение относится к биотехнологии и микробиологии, может быть использовано для приготовления суспензии для инъекций и накожного скарификационного нанесения.

Известна питательная среда для высушивания биомассы чумного микроба, для приготовления которой используют, г/л: сахарозу - 0,4 кг; желатин - 0,04 кг; натрий глютаминовокислый - 0,06 кг; тиомочевину - 0,02 кг; пептон ферментативный - 0,002 кг; дистиллированную воду до 1 л. Дистиллированную воду рН 7,0-7,1 подогревают до температуры (50±2)°C, растворяют в ней сахарозу; лактозу; натрий глютаминовокислый; тиомочевину 0,02; пептон ферментативный - 0,002; проверяют рН и, в случае необходимости, исправляют 20% раствором натра едкого до рН 7,1-7,2. После полного растворения ингредиентов среду фильтруют через полотно фильтровальное, разливают по бутылям, затем стерилизуют. После стерилизации бутылям дают остыть до температуры (22±3)°C, затем ставят в термостат при температуре (37±1)°C на (48±2) ч. При отсутствии пророста среды высушивания в бутылях ее используют в производстве. (Регламент Производства №368-92. Вакцина чумная живая сухая. 1997 г. 238 с.).

Недостатком данной питательной среды высушивания является ее недостаточные стабилизирующие свойства.

Наиболее близкой к предлагаемому изобретению по технологической сущности является питательная среда высушивания биомассы чумного микроба вакцинного штамма EV, для приготовления которой используют сахарозу - 1 кг; желатин - 0,1 кг; тиомочевину - 0,1 кг; натрий глютаминовокислый - 0,15 кг; пептон ферментативный - 0,05 кг; натр едкий (20±1)% раствор - 2,5 мл; дистиллированную воду до 1л. Дистиллированную воду рН 7,0-7,1 подогревают до температуры (50±2)°C, растворяют в ней желатин, проверяют рН и, в случае необходимости, исправляют 20% раствором натра едкого до рН 7,1-7,2, добавляют сахарозу, тиомочевину, пептон, натрий глютаминовокислый и желатин медицинский. После полного растворения ингредиентов среду фильтруют через полотно фильтровальное, разливают по бутылям, затем стерилизуют. После стерилизации бутылям дают остыть до температуры (22±3)°C, затем ставят в термостат при температуре (37±1)°C на (48±2) ч. При отсутствии пророста среды высушивания ее используют в производстве. (Регламент Производства №702-97. Вакцина чумная живая сухая. 2002 г. 262 с.).

Недостатком данной питательной среды высушивания является большое количество составляющих ингредиентов в ее составе и то обстоятельство, что сбор биомассы производится в ампулы объемом 5 мл по 2 мл и при недостаточном количестве вакцинируемых остатки вакцины приходится уничтожать, что нерентабельно.

Технологическим результатом предлагаемого изобретения является получение среды высушивания жидкой как стабилизирующей среды нового состава для получения качественной вакцины чумного микроба в достаточном количестве для вторичного сбора биомассы, полученной при более низкой температуре при -(21±1)°C и в разлитой в ампулы по 1 мл.

Указанный технологический результат достигается тем, что среда высушивания жидкая стабилизирующая содержит сахарозу, желатин медицинский, тиомочевину и очищенную воду при следующем содержании ингредиентов, г/л:

Желатин медицинский 8,0-12,0
Сахароза 80,0-120,0
Тиомочевина 8,0-12,0
Натрий едкий в чешуйках раствор 20% 2-3 мл
Вода для инъекций до 1 л

Желатин - сырье для медицинский промышленности ГОСТ 23058-89. Показатели обязательные для проверки: внешний вид - крупинки светло-желтого цвета; вкус - пресный; подлинность - выдерживает испытание по ГФ X, статья 309; продолжительность растворения, мин, не более 25, рН 5,6±0,4; запах - специфический, без гнилостного; микроорганизмы - (при отсутствии бактерий семейства Enterobacteriacea, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aemginosa). Для получения вакцины.

Сахароза ГОСТ 5833-75 ЧДА. Показатели обязательные для контроля: внешний вид - мелкокристаллический порошок; подлинность - выдерживает испытание по Х - Государственной Фармакопее (ГФ - X); растворимость - растворим в воде, нерастворим в абсолютном спирте, хлороформе; цветность - выдерживает испытание по ГОСТ 5833-75; кислотность в виде СН3СООН, % по стандарту 0,005; инвертный сахар 0,05. Для получения вакцины.

Тиомочевина ГОСТ 6344-73 Чда, хч. Показатели обязательные для контроля: внешний вид - бесцветные блестящие кристаллы; растворимость - хорошо растворимы в воде, растворимы при нагревании в спирте; массовая доля основного вещества, в %, не менее 99.

Натрий едкий в чешуйках ГОСТ - 4328-77, (чда) используется для установления рН 7,6±0,2.

Вода для инъекций - показатели по стандарту ФС 42-2619-97. Бесцветная прозрачная жидкость без запаха и вкуса: удельная электропроводность, мк С/см - не более 0,5; рН - 5,0-7,0; восстанавливающие вещества по ФС - 2619-97; хлориды, мг/мл не более 0,0001; сульфиты, мг/мл не более 0,003; кальций, мг/мл - 0,0035; тяжелые металлы, мг/мл не более 0,0005; микроорганизмы, ед./мл не более 100 при отсутствии бактерий семейства Enterobacteriacea, Staphilococcus aureus, Pseudomonas aemginosa.

Проведенные опыты по отработке температурных режимов культивирования чумного микроба в градиенте 21°C в сравнении с регламентным 27°C показали, что температура выращивания существенно влияет на количество микробных клеток. При этом температура выступает как фактор, влияющий на биосинтетические процессы в цитоплазматических мембранах клеток за счет увеличения содержания ненасыщенных жирных кислот, накопление которых в мембранах клеток способствует их большей устойчивости к лиофилизации (Иванова Г.Ф., Будыка Д.А., Абзаева Н.В. Сборник научных трудов. - Ставрополь, 2007. - С.186-188; Тинкер А.И., Будыка Д.А., Верховцева Г.Н., Печников Е.Н. Актуальные вопросы профилактики особо опасных инфекционных заболеваний. Киров, 1991. - С.38-40).

В отличие от прототипа предлагаемая среда обеспечивает высокие стабилизирующие свойства, проста в применении для получения вторичного сбора биомассы вакцины чумной живой сухой.

При получении вторичного сбора биомассы чумного микроба вакцинного штамма EV необходимо вести подсчет количества микробных клеток на питательной среде плотной для культивирования чумного микроба вакцинного штамма EV, приготовленной на ферментативном гидролизате говяжьего мяса.

Методика подсчета количества микробных клеток

Питательные агары из панкреатического перевара мяса (агар Хоттингера для чумного микроба по ФС 42-3204-98), применяемые для определения количества живых микробных клеток, должны обеспечивать, без добавления стимуляторов, рост микробов вакцинного штамма ЕВ на всех чашках Петри с агаром, засеянных 10 м.к. по ОСО мутности 42-28-85П 10 МЕ. В качестве стимулятора роста к питательным средам перед розливом их в чашки Петри добавляют 1 мл/л гемолизированной крови или 0,25 г/л свежеприготовленного прокипяченного натрия сернистокислого. Пробирки с 0,9% раствором натрия хлорида и пипетки, используемые при определении содержания живых микробов в биомассе, должны быть охлаждены до температуры (4±2)°C. Из каждой пробирки с жидкой питательной средой содержимое в количестве 0,1 мл разводят 0,9% раствором натрия хлорида в количестве 0,9 мл (основное разведение 10-1). Добавляют последовательно физиологический раствор до получения 1 млрд м.к./мл. Затем пипеткой делают последовательные десятикратные разведения полученной взвеси в 0,9% растворе натрия хлорида, начиная с 10-1 (0,5±0,01) мл взвеси с 4,5±0,05 мл 0,9% раствора натрия хлорида и заканчивая 10-5. Разведенную биомассу из двух последних пробирок (10-5) засевают пипеткой по (0,1±0,01) мл на 2 чашки Петри с питательным агаром (рН 7,2) и выдерживают при температуре (21±1)°C 2-3 суток.

Приготовление ферментативного гидролизата из говяжьего мяса.

В реактор наливают питьевую воду из расчета имеющегося мяса (на 1 кг мяса 1,5 л воды). Мясо без жира и сухожилий режут на кусочки размером 2,5 на 2,5 см. Варят мясо 15 мин, затем вынимают. Охлаждают и пропускают через мясорубку. Бульон остывший до 50°C подщелачивают Na2Со3 из расчета 3,0 г соды на 1 л. Добавляют поджелудочную железу из расчета 80,0-100,0 г на 1 кг мяса в зависимости от активности поджелудочной железы. Активность должна быть не менее 5 тыс. единиц по Фульд-Гроссу. Добавляют хлороформ - 2% к общему объему содержимого реактора. Переваривание идет при 37°C. Первые сутки гидролизат перемешивают механической мешалкой, которую включают через каждые 2 ч на 5 мин. Ежедневно определяют аминный азот в гидролизате. С прекращением нарастания аминного азота, что бывает на 7-10 сутки, мешалку отключают, подогревание прекращают. Дают отстояться в течение 2 суток, затем жидкость отфильтровывают от осадка на пресс-фильтре, разливают по бутылям с добавлением 1% хлороформа, запробковывают и хранят при температуре 4-6°C.

Характеристика ферментативного гидролизата говяжьего мяса - рН 7,0; аминный азот 1100 мг %; аминный азот 878 мг %; процент расщепления 78,0%; натрия хлорида 0,087; пептон 1,2; кальций 4,2 мг %; магний 5,21 мг %; фосфор общий 6,5 мг %; фосфор неорганический 57,1 мг %; сухой остаток 10,0-1,5%; редуцирующие вещества 367 мг %.

Подготовка ферментативного гидролизата из говяжьего мяса (по МУК 4.1/2.588-96, с.45)

Ферментативный гидролизат из говяжьего мяса декантируют из баллона, затем фильтруют через ткань. Определяют количество аминного азота и по его содержанию рассчитывают количество гидролизата, необходимое для приготовления питательной среды. Если требуется осветление углем (темный гидролизат), то его берут на 10% больше, учитывая адсорбцию аминокислот при обработке углем. Если гидролизат после разведения по аминному азоту имеет соломенно-желтый цвет, то его не осветляют. Разводят очищенной водой в 2 раза, нагревают до кипения и добавляют 2% активированного угля марки ОУ-А (в расчете на разведенный гидролизат). Кипятят 15-20 мин при помешивании. Дают отстояться 20-30 мин и фильтруют сначала через вату, а затем через фильтровальное полотно.

Приготовление питательной среды для культивирования чумного микроба вакцинного штамма EV.

Питательные агары из панкреатического перевара мяса (агар Хоттингера для чумного микроба по ФС 42-3204-98), применяемые для определения количества живых микробных клеток, должны обеспечивать (без добавления стимуляторов) рост микробов вакцинного штамма EV на всех чашках Петри с агаром, засеянных 10 м.к. по ОСО мутности 42-28-85П 10МЕ. В качестве стимулятора роста к питательным средам перед розливом их в чашки Петри добавляют 1 мл/л гемолизированной крови или 0,25 г/л свежеприготовленного прокипяченного натрия сернистокислого. Пробирки с 0,9% раствором натрия хлорида и пипетки, используемые при определении содержания живых микробов в биомассе, должны быть охлаждены до температуры (4±2)°C. Из каждой пробирки с жидкой питательной средой содержимое в количестве 0,1 мл разводят 0,9% раствором натрия хлорида в количестве 0,9 мл (основное разведение 10-1). Добавляют последовательно физиологический раствор до получения 1 млрд м.кл./мл. Затем пипеткой делают последовательные десятикратные разведения полученной взвеси в 0,9% растворе натрия хлорида, начиная с 10-1 (0,5±0,01) мл взвеси с 4,5±0,05 мл 0,9% раствора натрия хлорида и кончая 10-7. Разведенную биомассу из двух последних пробирок (10-6 и 10-7) засевают пипеткой по (0,1±0,01) мл на 2 чашки Петри с питательным агаром рН 7,2±0,2 и выдерживают при температуре (21±1)°C 2-3 суток.

Приготовление среды высушивания жидкой для стабилизации биомассы вторичного сбора чумного микроба вакцинного штамма ЕВ.

Воду для инъекций подогревают до температуры (50±2)°C, растворяют в ней желатин, устанавливают рН 20% раствором едкого натра до (7,6±0,2), добавляют сахарозу и тиомочевину, доводят до кипения. После полного растворения ингредиентов среду фильтруют через полотно фильтровальное и фильтровальную бумагу, разливают по градуированным колбам и сифонам. В последнем случае воронку с фильтром вставляют прямо в бутыль, предварительно простерилизованную вместе с монтажом, и разливают среду мерно. Затем в бутыль снова вставляют монтаж, завязывают его шпагатом и горло бутыли обертывают марлей, сложенной в несколько слоев. Среду стерилизуют при 121°C в течение 30 мин. После стерилизации дают бутылям остыть до температуры (22±3)°C. Затем снимают с них марлю и тут же горло бутылей тщательно обмазывают горячей смесью воска с парафином в соотношении (3:2) или заливают парафином. Бутыли со средой ставят в термостат при (37±1)°C на (48±2) ч. При отсутствии пророста среды ее используют в производстве.

В качестве примера испытывали культуру чумного микроба вакцинного штамма EV, выращенную на пластинках 2% агара Хоттингера рН (7,2±0,1) при температуре (27±1)°C в течение 24 ч. Из суточной культуры готовили взвесь 1 млрд м.кл/мл вакцинного штамма чумного микроба EV, равную 10 ед. по оптическому стандарту мутности (ОСО 42-28-85 П), эквивалентную 1,0×109 м.к./мл в стерильном 0,9% растворе натрия хлорида. Серийными 10-кратными разведениями в физиологическом растворе в объеме 4,5 мл доводили до содержания в 1 мл 1,03·106 живых микробных клеток. Из данного разведения взвеси культуры высевали по 0,1 мл в 5 мл жидкой питательной среды. Посевы инкубировали при (21±0,1)°C. Учет результатов проводили через каждые 3 часа в течение 48 ч для определения количества микробных клеток.

Пример 1. При вторичном сборе биомассы чумного микроба вакцинного штамма EV, выросшей на плотной питательной среде, при применении стабилизирующей среды жидкой, содержащей, г/л: желатин медицинский - 8,0; сахароза - 80,0; тиомочевина - 8,0; натрий едкий в чешуйках раствор 20% - 2 мл; вода для инъекций до 1 л. При таком соотношении ингредиентов количество микробных клеток при температуре 21±1°C через 48 ч культивирования составило 11 млрд м.к./мл.

Пример 2. При вторичном сборе биомассы чумного микроба вакцинного штамма EV, выросшей на плотной питательной среде, при применении стабилизирующей среды жидкой, содержащей, г/л: желатин медицинский - 10,0; сахароза - 100,0; тиомочевина - 10,0; натрий едкий в чешуйках раствор 20% - 2,5 мл; вода для инъекций до 1 л. При таком соотношении ингредиентов количество микробных клеток при температуре 21±1°C через 48 ч культивирования составило 30 млрд м.к./мл.

Пример 3. При вторичном сборе биомассы чумного микроба вакцинного штамма EV, выросшей на плотной питательной среде, при применении стабилизирующей среды жидкой, содержащей, г/л: желатин медицинский - 10,0; сахароза - 100,0; тиомочевина - 10,0; натрий едкий в чешуйках раствор 20% - 2,5 мл; вода для инъекций до 1 л. При таком соотношении ингредиентов количество микробных клеток, при температуре 21±1°C через 48 ч культивирования составило 13 млрд м.к./мл.

Таким образом, заявленная среда высушивания жидкая для стабилизации биомассы вторичного сбора чумного микроба вакцинного штамма EV (пример №2) является оптимальной по количеству подобранных ингредиентов, что в совокупности позволяет получить достаточное количество микробных клеток при температуре 21±1°C через 48 ч культивирования. При вторичном сборе биомассы чумного микроба вакцинного штамма рентабельность производства вакцины увеличивается на 5%.

Среда высушивания жидкая для стабилизации биомассы вторичного сбора чумного микроба вакцинного штамма EV, состоящая, г/л:

Желатин медицинский 8,0-12,0
Сахароза 80,0-120,0
Тиомочевина 8,0-12,0
Натрий едкий в чешуйках раствор 20% 2-3 мл
Вода для инъекций до 1 л



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к биотехнологии. Штамм бактерий Serratia species является продуцентом внеклеточных рибонуклеазы и дезоксирибонуклеазы, обладающих противовирусной активностью в отношении вирусов птичьего гриппа A/chickenKurgan/05/2005 (H5N1) и вируса гриппа человека A/Aichi/2/68 (H3N2).
Изобретения относятся к биохимии. Предложен штамм бактерий Bacillus amyloliquefaciens ВКПМ В-11475, обладающий фунгицидным и бактерицидным действием.

Изобретение относится к области биотехнологии и касается видовой и штаммовой идентификации бифидобактерий филотипа Bifidobacterium longum. Представленный способ основан на комбинации и полиморфизме генов токсин-антитоксин суперсемейства RelBE и характеризуется тем, что для идентификации проводят амплификацию с геномной ДНК с использованием набора видо- и штаммоспецифичных олигонуклеотидов, ПЦР продукты анализируют в агарозном геле, а размер полученного фрагмента определяют с помощью ДНК-маркера.
Изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано для разработки антитоксических препаратов и кормовых добавок для профилактики микотоксикозов у сельскохозяйственных животных и птицы.

Изобретение относится к области биотехнологии и касается способа идентификации лактобацилл. Представленный способ основан на комбинации и полиморфизме генов токсин-антитоксин суперсемейств RelBE и MazEF и характеризуется тем, что для идентификации проводят амплификацию геномных ДНК с использованием набора олегонуклеотидов определенной структуры, ПЦР-продукты анализируют в агарозном геле, а размер полученного фрагмента определяют с помощью ДНК-маркера.

Изобретение относится к области биотехнологии и нанотехнологии. Способ предусматривает трансформацию клеток архей рекомбинантной плазмидой, выращивание клеток, выделение жгутиков и модификацию поверхности жгутиков.

Изобретение касается способа определения генотипов золотистого стафилококка. Представленный способ включает получение чистой культуры микроорганизмов на плотной питательной среде с последующим выделением и амплификацией ДНК возбудителя с помощью мультиплексной полимеразной цепной реакции (ПЦР) и с детекцией результатов методом электрофореза в агарозном геле.
Изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано для очистки почв, вод, сточных вод, шламов от нефти и нефтепродуктов. Штамм Rhodotorula sp.
Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для очистки мерзлотной почвы и водной среды от нефти и нефтепродуктов. Выращивают штамм бактерий Bacillus vallismortis ВКПМ В-11017 и готовят из него суспензию, в которую вносят в мерзлотную почву и водную среду.
Изобретение относится к биотехнологии. Способ предназначен для выявления внутрибольничных штаммов микроорганизмов при проведении эпидемиологического мониторинга.
Изобретение относится к медицине, а именно к терапии и кардиологии, и касается коррекции эндотелиальной дисфункции. Для этого вводят активированную - потенцированную форму антител к эндотелиальной синтазе оксида азота в сочетании с активированной - потенцированной формой антител к С-концевому фрагменту AT1 рецептора ангиотензина II.

Изобретение относится к области биотехнологии и медицины. Описана активная иммуностимулирующая вакцина, содержащая по меньшей мере одну РНК, предпочтительно мРНК, кодирующую по меньшей мере два антигена, которые инициируют иммунный ответ у млекопитающего, предназначенная для лечения рака легких, прежде всего немелкоклеточного рака легких (НМРЛ), предпочтительно выбранного из основных трех его подтипов, плоскоклеточной карциномы легких, аденокарциномы и крупноклеточной карциномы легких, или нарушений, связанных с НМРЛ.
Изобретение относится к области ветеринарии. Способ получения антилютеальной крови - АлК, заключается в том, что мерину двукратно с интервалом 14 дней подкожно вводят лютеолизат в дозе по 20 мл, содержащий части желтого тела беременности коров, и через 14 дней после второго введения берут кровь из яремной вены.

Настоящая группа изобретений относится к области медицины, а именно к терапии и фармакологии, и может быть использована для повышения фармакологической активности и терапевтической эффективности лекарственных средств на основе активированных - потенцированных форм сверхразбавленных антител.
Изобретение относится к области медицины и ветеринарии и касается способа получения очищенного антигена Dirofilaria immitis. Представленный способ включает механическую гомогенизацию, центрифугирование гомогената, отбор надосадочной жидкости и использование ее как антигена, при этом для гомогенизации используют головной конец длиной 2 см половозрелой самки Dirofilaria immitis, который помещают в 0,25 М водный раствор сахарозы в соотношении 1:3, замораживают при температуре -18°С, проводят механическую гомогенизацию и экстракцию белков в 0,25 М водном растворе сахарозы при 4°С в течение 12 часов, далее проводят ультразвуковую гомогенизацию супернатанта при 70 кГц 5 раз по 30 секунд с интервалом в 30 секунд в 3 циклах при 0°С, образовавшийся после ультразвуковой гомогенизации супернатант растворяют в охлажденном ацетоне при температуре 0°С в соотношении 1:20 с экспозицией 1 час при температуре 4°С.

Изобретение относится к медицине и касается применения антитела, которое связывается с остатками 1-5 или 3-7 А-бета, для уменьшения сосудистого амилоида у пациента, имеющего церебральную амилоидную ангиопатию, причем антитело вводят внутривенно или подкожно.
Изобретение относится к области ветеринарной микробиологии и биотехнологии. Штамм Moraxella bovoculi обладает антигенными, вирулентными свойствами и иммуногенной активностью.

Группа изобретений относится к области медицины и ветеринарии. Применение RPE (экстракт рибосомного белка) совместно с Th1-активирующим адъювантом для получения лекарственного средства для лечения или профилактики паразитарного заболевания обеспечивает перекрестный иммунитет от различных видов Leishmania.

Группа изобретений относится к медицине, а именно к терапии, и касается лечения вирусных заболеваний. Для этого вводят лекарственное средство, содержащее в качестве действующих компонентов активированную-потенцированную форму антител к гамма-интерферону человека и активированную-потенцированную форму антител к CD4 рецептору.
Изобретение относится к фармацевтической промышленности, а именно к способу получения средства, стимулирующего антигеннезависимую дифференцировку B-лимфоцитов, из сырья животного происхождения.
Изобретение относится к ветеринарии, в частности к профилактике и лечению трихофитии крупного рогатого скота. Инактивированная вакцина для профилактики и лечения трихофитии крупного рогатого скота содержит элементы гриба Trichophyton verrucosum - клетки и фрагменты мицелия, микроконидии, артроспоры, хламидоспоры; формалин и физиологический раствор при следующем соотношении компонентов в 1 мл: элементы гриба Trichophyton verrucosum - фрагменты   мицелия, микроконидии, артроспоры, хламидоспоры 80-120 млн формалин 0,003 мл физиологический раствор до 1 мл Техническим результатом заявленного изобретения является повышение длительности иммунитета до 30 месяцев, повышение стабильности вакцины и срока хранения вакцины до 18 месяцев, возможность полного освобождения хозяйств от возбудителя трихофитии крупного рогатого скота, а также упрощение применения вакцины, снижение себестоимости ее производства и использования, снижение нагрузки на иммунную систему животных. 6 пр., 1 табл.
Наверх