Способ получения очищенного соматического антигена dirofilaria immitis


 

C07K1/14 - Пептиды (пептиды в пищевых составах A23, например получение белковых композиций для пищевых составов A23J, препараты для медицинских целей A61K; пептиды, содержащие бета-лактамовые кольца, C07D; циклические дипептиды, не содержащие в молекуле любого другого пептидного звена, кроме образующего их кольцо, например пиперазин-2,5-дионы, C07D; алкалоиды спорыньи циклического пептидного типа C07D519/02; высокомолекулярные соединения, содержащие статистически распределенные аминокислотные единицы в молекулах, т.е. при получении предусматривается не специфическая, а случайная последовательность аминокислотных единиц, гомополиамиды и блоксополиамиды, полученные из аминокислот, C08G 69/00; высокомолекулярные продукты, полученные из протеинов, C08H 1/00; получение

Владельцы патента RU 2525688:

Федеральное бюджетное учреждение науки "Ростовский научно-исследовательский институт микробиологии и паразитологии" (ФБУН РостовНИИ микробиологии и паразитологии) (RU)

Изобретение относится к области медицины и ветеринарии и касается способа получения очищенного антигена Dirofilaria immitis. Представленный способ включает механическую гомогенизацию, центрифугирование гомогената, отбор надосадочной жидкости и использование ее как антигена, при этом для гомогенизации используют головной конец длиной 2 см половозрелой самки Dirofilaria immitis, который помещают в 0,25 М водный раствор сахарозы в соотношении 1:3, замораживают при температуре -18°С, проводят механическую гомогенизацию и экстракцию белков в 0,25 М водном растворе сахарозы при 4°С в течение 12 часов, далее проводят ультразвуковую гомогенизацию супернатанта при 70 кГц 5 раз по 30 секунд с интервалом в 30 секунд в 3 циклах при 0°С, образовавшийся после ультразвуковой гомогенизации супернатант растворяют в охлажденном ацетоне при температуре 0°С в соотношении 1:20 с экспозицией 1 час при температуре 4°С. Представленное изобретение позволяет получить антиген с высокими показателями чувствительности и специфичности и может быть использовано в диагностике дирофиляриоза у людей и животных. 2 табл., 1 пр.

 

Изобретение относится к области медицины и ветеринарии, в частности иммунодиагностики дирофиляриоза, и может быть использовано для серодиагностики данного заболевания у человека и животных.

Дирофиляриоз является достаточно изученной в ветеринарии проблемой. По отчетным данным ветеринарных служб субъектов юга России, дирофиляриоз занимает лидирующее место в этиологической структуре заболеваемости собак заразными болезнями и стремительно распространяется до северных границ России.

Диагностика дирофиляриоза у человека затруднена из-за отсутствия прямых методов исследования. Сердечный дирофиляриоз собак диагностируют микроскопическим методом, основанным на обнаружении микрофилярий в крови. В то же время существуют скрытые формы данного гельминтоза, при котором личинок в крови обнаружить не удается, в этом случае возникает необходимость использования серологических методов исследования. Отсутствие отечественных иммунологических тестов для проведения серологических исследований делает актуальной разработку способа получения антигена Dirofilaria immitis.

Возбудителями дирофиляриоза являются как D. immitis, так и D. repens, но антиген для целей диагностики должен обладать высокой видоспецифичностью и чувствительностью в связи с разной патогенностью двух видов дирофилярий.

Известен способ получения соматического антигена D. repens (RU 2356575 C1, 27.05.2009). По данному способу для получения антигена используют неполовозрелые самки гельминта, удаленные у больных людей. Этот способ не может быть использован для получения антигена D. immitis, так как на сегодняшний день в РФ не зарегистрировано случаев обнаружения у человека гельминтов вида D. immitis. Использование неполовозрелых форм D. immitis от собак также проблемно в связи с тем, что неполовозрелые D. immitis имеют подкожную локализацию, как и половозрелые самки D. repens, а морфологическая видовая дифференциация самок Dirofilaria разных видов, удаленных из подкожных тканей собак, очень сложна.

Известен способ получения соматического антигена D. immitis, при котором гельминтов помещают в физиологический раствор в соотношении 1:10, измельчают в ступке на холоде до получения однородной массы, проводят экстрагирование белков в течение 24 часов в этом же растворе при 4°С на магнитной мешалке, по окончании экстрагирования гомогенат центрифугируют при 15000 об/мин в течение 30 мин на холоде, осадок удаляют, а супернатант фракционируют гель-хроматографией на колонке 16×70 см (Медведев А.Ю. Распространение дирофиляриоза собак в Краснодарском крае и разработка его диагностики иммуноферментной реакцией // Автореф. дис. канд. вет. наук. М., 2007. - С.8). В данном способе для получения антигена использовали половозрелых самок гельминтов D. immitis от собак. Антиген, полученный по данному способу, обладал видоспецифичностью, но при этом имел достаточно высокий процент ложноотрицательных результатов (16%).

Целью изобретения является разработка способа получения соматического очищенного антигена D. immitis с высокими показателями чувствительности и специфичности.

В предлагаемом способе отделяют и используют головной конец половозрелой самки гельминта D. immitis от собак:

- учитывая, что в нем содержатся железистые клетки пищевода - стихоциты, которые обладают высокой секретирующей активностью (Бритов В.А. Трихинеллы и их использование в медицине. - 2006. - С.56);

- исходя из того, что иммунизирующее воздействие гельминтов может осуществляться за счет секретов и экскретов, выделяемых в процессе их жизнедеятельности (Шульц Р.С., Гвоздев Е.В. Основы общей гельминтологии. Т.III, Патология и иммунология при гельминтозах. - М., 1976. - С 108).

Способ включает следующие этапы:

1. Подготовка половозрелой самки Dirofilaria immitis к гомогенизации

Самку Dirofilaria immitis, удаленную хирургическим путем из сердца и легочных артерий собак, отмывают многократно физиологическим раствором, отделяют головной конец длиной 2 см и помещают его в 0,25 М водный раствор сахарозы (в соотношении 1:3). Пробу замораживают при температуре -18°С.

2. Получение соматического экстракта

Проводят механическую гомогенизацию паразита 5 раз по 30 секунд с интервалом 30 секунд в трех циклах при 0°С. Для дальнейшей экстракции белков гомогенат выдерживают при температуре 4°С в течение 12 часов.

Проводят ультразвуковую гомогенизацию супернатанта при 70 кГц 5 раз по 30 секунд с интервалом в 30 секунд в 3 циклах при 0°С.

3. Очистка экстракта в ацетоне

Суспензию антигена медленно по каплям добавляют во флакон с охлажденным ацетоном (1 объем суспензии на 20 объемов ацетона) при непрерывном быстром перемешивании при 0°С. Смесь во флаконах выдерживают 1 час в холодильнике при температуре 4°С. Проводят центрифугирование смеси в центрифуге при 2000 об/мин в течение 8 мин при температуре 0°С. Надосадочную жидкость удаляют. Пробирку с осадком высушивают под вакуумом в течение 3 часов при 0°С.

К сухому остатку во флаконе добавляют 1 мл фосфатного буфера рН 6,4. Флакон энергично встряхивают в течение 1-2 мин, затем помещают в холодильник при 4°С на 12 часов для полной гидратации препарата.

Раствор центрифугируют при 5000 об/мин в течение 60 минут при температуре 0°С. Надосадочную жидкость используют как антиген.

4. Анализ диагностических свойств соматического очищенного антигена

Чувствительность и специфичность полученного антигена определяли в ИФА по общепринятой методике. Полученный антиген использовали в концентрации 8 мкг/мкл в объеме 100 мкл на лунку. Разведение сывороток 1:200.

Пример

Исследование диагностической эффективности в ИФА очищенного соматического антигена D. immitis с сыворотками крови животных.

В опытах использовали сыворотки крови собак, больных сердечным дирофиляриозом (D. immitis), собак с микст инвазией D. immitis и D. repens, свободных от данной инвазии собак и сыворотки крови собак, больных токсокарозом. Кровь всех животных предварительно исследовали на наличие микрофилярий классическим способом.

Таблица 1
Диагностическая эффективность ИФА с соматическим очищенным антигеном D. immitis
№п.п. Группы обследованных Кол-во обследованных Результаты ИФА
положительный отрицательный Диагностическая эффективность антигена (%±m)
абс. %±m абс. %±m
1. Собаки, больные дирофиляриозом (с микрофиляриемией): 89 83 93,26 6 6,74 чувствительность 93,26
- D. immitis 41 38 92,68 3 7,32
- D. repens и D. immitis 48 45 93,75 3 6,25
2. Собаки, свободные от микрофилярий: 61 8 13,11 53 86,89 специфичность 86,89
- без клинических признаков дирофиляриоза 31 7 22,58 24 77,42
- щенки в возрастедо 5 мес. 21 1 4,76 20 95,24
- больные токсокарозом 10 - 0 10 100

Результаты, представленные в таблице 1, свидетельствуют, что чувствительность и специфичность очищенного соматического антигена с сыворотками крови животных составила 93,26% и 86,89% соответственно.

В таблице 2 приведены результаты сравнительных испытаний в ИФА антигенов D. immitis, полученных по предлагаемому и приведенным выше способам.

Таблица 2
Результаты исследований диагностической эффективности в ИФА антигена D. immitis, полученного разными способами
№ п.п. Антиген D. immitis Чувствительность Специфичность
1 полученный по прототипу (Медведев А.Ю., 2007) из целой половозрелой самки D. immitis 84,00% 84,46%
2 полученный по способу, описанному в патенте (RU 23566575) из целой половозрелой самки D. immitis 83,14% 85,24%
3 полученный по предлагаемому способу из головного конца половозрелой самки D. immitis 93,26% 86,89%

Из таблицы 2 (строка 2) видно, что приготовление антигена D. immitis из целой половозрелой самки (по Медведеву А.Ю., 2007) с использованием этапов по способу, описанному в предназначенном для получения антигена D. repens патенте (RU 23566575), не повышает его специфичность и чувствительность в ИФА по сравнению с антигеном, полученным по способу Медведева А.Ю.

Наиболее высокие результаты чувствительности и специфичности в ИФА получены при исследовании антигена, полученного по предлагаемому способу с использованием головного конца гельминта D. immitis.

Таким образом, заявляемый способ обеспечивает получение соматического очищенного антигена D. immitis с высокими показателями чувствительности и специфичности.

Способ получения очищенного соматического антигена Dirofilaria immitis, включающий механическую гомогенизацию, центрифугирование гомогената, отбор надосадочной жидкости и использование ее как антигена, отличающийся тем, что для гомогенизации используют головной конец длиной 2 см половозрелой самки Dirofilaria immitis, который помещают в 0,25 М водный раствор сахарозы в соотношении 1:3, замораживают при температуре -18°С, проводят механическую гомогенизацию и экстракцию белков в 0,25 М водном растворе сахарозы при 4°С в течение 12 часов, далее проводят ультразвуковую гомогенизацию супернатанта при 70 кГц 5 раз по 30 секунд с интервалом в 30 секунд в 3 циклах при 0°С, образовавшийся после ультразвуковой гомогенизации супернатант растворяют в охлажденном ацетоне при температуре 0°С в соотношении 1:20 с экспозицией 1 час при температуре 4°С.



 

Похожие патенты:

Настоящее изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к модификациям аллергенов с целью снижения их аллергенности, и может быть использовано в медицине.

Изобретение относится к биотехнологии и представляет собой способ получения препарата антитела или его антигенсвязывающего участка с уменьшенным содержанием белков клеток-хозяев (БКХ) из смеси-образца.
Группа изобретений относится к области биотехнологии. Предложен способ очистки фактора, способствующего заживлению ран, представляющего собой фактор роста гепатоцитов (HGF).

Изобретение относится к способу получения гликопротеина, который является единообразным в выражении функций, обусловленных сахаридной цепочкой (например, время полужизни в крови), а также в единицах физиологической активности, то есть гликопротеина, имеющего единообразные аминокислотную последовательность, структуру сахаридной цепочки и структуру высшего порядка, физиологическую активность, способ скрининга на гликопротеин, способ получения смеси гликопротеинов.

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к рекомбинантной продукции белков человека, и может быть использовано для получения гибридного рекомбинантного эритропоэтина человека.

Группа изобретений относится к способам получения препарата антитела против IL-18 или его антигенсвязывающей части со сниженным содержанием белка клетки-хозяина (БКХ) из образца смеси, содержащей антитело против IL-18 или его антигенсвязывающую часть, и по меньшей мере один БКХ.
Изобретение относится к биотехнологии, а именно к способу выделения низкомолекулярных пептидов из сырья животного происхождения, которые могут служить в качестве биологически активных веществ при создании фармацевтических или косметических композиций.

Изобретение относится к хроматографическому способу очистки аналога инсулина, выбранного из аспартата, лизпро и гларгина, атозибана или эптифибатида из смеси, содержащей по меньшей мере одну родственную примесь.

Настоящее изобретение относится к области биотехнологии. Предложен способ концентрирования забуференного водного раствора иммуноглобулина в тангенциальном потоке, где значения трансмембранного давления и величину поперечного потока выбирают в зависимости от текущей концентрации иммуноглобулина в растворе, а также способ получения иммуноглобулина с использованием способа концентрирования по изобретению.

Изобретение относится к производным пептидов и пептидомиметикам в качестве ингибиторов трансглутаминаз, к способам их получения, фармацевтическим композициям, содержащим указанные соединения, а также к применению указанных ингибиторов трансглутаминазы, в частности, для лечения целиакии и заболеваний, зависимых от трансглутаминазы.

Изобретение относится к медицине и касается применения антитела, которое связывается с остатками 1-5 или 3-7 А-бета, для уменьшения сосудистого амилоида у пациента, имеющего церебральную амилоидную ангиопатию, причем антитело вводят внутривенно или подкожно.
Изобретение относится к области ветеринарной микробиологии и биотехнологии. Штамм Moraxella bovoculi обладает антигенными, вирулентными свойствами и иммуногенной активностью.

Группа изобретений относится к области медицины и ветеринарии. Применение RPE (экстракт рибосомного белка) совместно с Th1-активирующим адъювантом для получения лекарственного средства для лечения или профилактики паразитарного заболевания обеспечивает перекрестный иммунитет от различных видов Leishmania.

Группа изобретений относится к медицине, а именно к терапии, и касается лечения вирусных заболеваний. Для этого вводят лекарственное средство, содержащее в качестве действующих компонентов активированную-потенцированную форму антител к гамма-интерферону человека и активированную-потенцированную форму антител к CD4 рецептору.
Изобретение относится к фармацевтической промышленности, а именно к способу получения средства, стимулирующего антигеннезависимую дифференцировку B-лимфоцитов, из сырья животного происхождения.

Группа изобретений раскрывает фармацевтическую композицию и набор, включающие антитела анти-CD20 типа II и ингибитор протеасомы, предназначенные для применения в лечении рака, экспрессирующего CD20.

Изобретение относится к иммунологии, медицине и биотехнологии. Предложен способ стимуляции специфического противоопухолевого иммунного ответа против клеток рака молочной железы с помощью дендритных клеток, трансфецированных полиэпитопной ДНК-конструкцией.

Изобретение относится к области биотехнологии. Способ лечения или профилактики заражения PCV2 или снижения клинических симптомов, вызываемых или ассоциированных с заражением PCV2, у животных, которые имеют антитела к PCV2, предусматривает однократное введение эффективного количества антигена PCV2 животным, нуждающимся в таком лечении или профилактическом лечении.

Группа изобретений относится к медицине, а именно к терапии, и касается профилактики и лечения инфекционных вирусных заболеваний. Для этого вводят комплексное лекарственное средство, содержащее смесь нескольких компонентов в виде активированных-потенцированных форм антител к растворенному антигену и антигену, связанному с наружной мембраной клеток иммунной системы.

Группа изобретений относится к медицине, а именно к неврологии, и касается лечения синдрома дефицита внимания. Для этого вводят фармацевтическую композицию, содержащую активированную-потенцированную форму антител к мозгоспецифическому белку S-100 и в качестве дополнительного - усиливающего компонента активированную - потенцированную форму антител к эндотелиальной NO-синтазе.

Настоящая группа изобретений относится к области медицины, а именно к терапии и фармакологии, и может быть использована для повышения фармакологической активности и терапевтической эффективности лекарственных средств на основе активированных - потенцированных форм сверхразбавленных антител. Для этого вводят фармацевтическую композицию, включающую активированные - потенцированные антитела к антигену, участвующему в патогенезе заболевания, и к эндотелиальной NO-синтазе. Введение такой композиции обеспечивает повышение эффективности лечения за счет синергетического действия компонентов композиции. 2 н. и 8 з.п. ф-лы, 18 пр.
Наверх