Способ получения иммуносорбента для диагностики вируса простого герпеса 1 типа


 


Владельцы патента RU 2528896:

Марданлы Сейфаддин Гашим оглы (RU)

Изобретение относится к медицине, в частности к клинической лабораторной диагностике, иммунохимии, и касается диагностики вируса простого герпеса первого типа методом твердофазного иммуноферментного анализа. Изобретение представляет собой способ получения иммуносорбента для диагностики вируса простого герпеса 1 типа, включающий предварительную обработку полимерного твердофазного носителя, на который сорбируется антиген вируса герпеса 1 типа, водным 20% раствором полиэтиленгликоля (ПЭГ-20), с последующей адсорбцией на носителе в 0,2M карбонат-бикарбонатном буферном растворе с pH 9,6 лизатного высокоочищенного антигена вируса герпеса 1 типа, приготовленного из штамма вируса простого герпеса 1 типа - АТСС VR-539, отмывку, лиофильную сушку, инкубацию сорбированных антигенов с блокирующим раствором. Использование натурального лизатного высокоочищенного антигена вируса герпеса 1 типа АТСС-VR-539 позволяет значительно повысить чувствительность анализа, система блокировки на основе триса позволяет нейтрализовать нежелательные неспецифические реакции. Также использование изобретения приводит к улучшению условий сохранения активности реагентов на поверхности твердофазного носителя, уменьшению расхода реагентов. Использование полиэтиленгликоля при обработке планшета повышает специфичность и чувствительность набора. 1 табл., 1 пр.

 

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Изобретение относится к медицине, в частности к клинической лабораторной диагностике, иммунохимии, и касается диагностики вируса простого герпеса первого типа методом твердофазного иммуноферментного анализа - ИФА, который является наиболее используемым при диагностике различных вирусных, бактериальных и других инфекций. Метод удобен для выполнения большого числа однотипных исследований.

Предшествующий уровень техники

Известен способ получения иммуносорбента для диагностики вирусного гепатита C (патент РФ №2095815, класс МКИ G01N 33/543). Сущность способа заключается в том, что лунки полистиролового планшета обрабатывают вирусспецифическим белком (ФАВ), инкубируют при заданной температуре, избыток ФАВ удаляют, промывают планшет фосфатным буфером и высушивают на воздухе при комнатной температуре. Для снижения неспецифической сорбции на носителе после удаления раствора и высушивания лунки планшета обрабатывают 10% раствором осветленной сыворотки крупного рогатого скота. Затем планшет герметично запаивают в полиэтиленовые пакеты. Иммуносорбент (твердофазный носитель с иммобилизованным антигеном) сохраняет высокую специфическую активность в течение года.

Недостатком этого способа является то, что в качестве вирусспецифического антигена используют рекомбинантный штамм E.coli, использование которого не гарантирует высокой чувствительности теста.

Известен также способ получения иммуносорбента для диагностики текущей инфекции ЦМВ с помощью иммуноферментного анализа (ИФА) (патент РФ №2028156, класс МКИ A61K 39/245). Сущность способа заключается в том, что из ядерной фракции клеток, инфицированных ЦМВ, через 48-72 ч после их инфицирования выделяют вирусспецифические "ранние" белки, которые адсорбируют в лунках 96-луночных полистироловых пластин. Заражают перевиваемую линию клеток фибробластов эмбриона человека цитомегаловирусом, штамм AD-169, который был получен из Американской коллекции вирусов и в настоящее время поддерживается в лаборатории диагностики вирусных инфекций НИИ вирусных препаратов Российской АМН СССР. Через 48-72 ч после заражения проводят выделение ядерной фракции клеток. Для этого инфицированные вирусом клетки отделяют от стекла раствором трипсина и однократно промывают фосфатно-буферным раствором pH 7.4 (ФСБ). Осадок клеток, разведенный в дважды дистиллированной воде, содержащей 2% фетальной телячьей сыворотки, инкубируют в течение 15 минут в ледяной бане. Затем добавляют равный объем 1% раствора неионного детергента (NP-40) и полученную смесь гомогенизируют в гомогенизаторе Даунса. Ядра отделяют от цитоплазматических осколков центрифугированием через 22,5% раствор Ficoll 400, приготовленного на ФСБ, pH 7,4, при 1800 g в течение 15 мин при 4°C. Осадок однократно промывают ФСБ, pH 7,4, ресуспендируют в том же буфере и обрабатывают ультразвуком (три цикла по 30 с с интервалом между циклами в 1 мин). Полученный "ядерный" антиген, содержащий ранние белки ЦМВ, осветляют центрифугированием при 8000 g в течение 20 мин. Для получения иммуносорбента в лунки нечетных рядов (A, C, E, G) полистироловых 96-луночных микротитровальных пластин вносят по 100 мкл (0,1 мл) вирусного антигена в концентрации не менее 1 мкг на лунку. В лунки четных рядов (B, D, F, H) вносят по 100 мкл контрольного антигена, выделенного из незараженной культуры клеток тем же способом, что и вирусный антиген. Пластины, закрытые крышками, инкубируют при 4-10°С в течение 18-20 ч. После 3-кратного промывания дистиллированной водой, содержащей 2% твина-20, пластины с нагруженными антигенами хранят при 4-10°С до использования. Срок хранения иммуносорбента 6 мес.

Недостатком этого способа является короткий срок хранения предлагаемого иммуносорбента.

Наиболее близким по технической сущности и достигаемому результату является способ получения иммуносорбента для диагностики вируса простого герпеса 1 типа, включающий шесть этапов - сорбция антигена, отмывка, лиофильная сушка в атмосфере азота, инкубация с блокирующим раствором, повторная лиофильная сушка в атмосфере азота и запайка планшетов в вакуумных пакетах, в качестве антигенов использованы высокоочищенные натуральные антигены ВПГ-1 штаммов MS и G, полученные на фирме Viro-Immun из разрушенных ультразвуком культур клеток почки обезьяны (Герпетическая инфекция (простой герпес). Этиология, эпидемиология, патогенез, клиника, лабораторная диагностика, лечение, С.Г. Марданлы, Г.И. Кирпичникова, В.А. Неверов. - Электрогорск: ЗАО «ЭКОлаб», 2011).

Недостатком этого способа является то, что в нем отсутствует стадия предварительной подготовки (активации) полимерного твердофазного носителя перед адсорбцией антигена, что приводит к увеличению расхода антигена при последующей обработке. Кроме того, практическое применение штаммов MS и G показало их нестабильность при хранении более 6 месяцев. Следует также отметить, что условия приготовления иммуносорбента оставляют возможность для неспецифического связывания компонентов реакционной смеси.

Цель и сущность изобретения

Целью настоящего изобретения явилось совершенствование способа получения иммуносорбента.

Сущность изобретения заключается в предварительной подготовке (активации) полимерного твердофазного носителя водным 20% раствором полиэтиленгликоля (ПЭГ-20), сушке с последующей адсорбцией на выделенных лунках планшета антигенов вируса герпеса 1 типа.

Далее проводят сорбцию 96-луночного разборного полистиролового планшета фирмы Nunc Maxi Sorp (Дания) в 0,2М карбонат-бикарбонатном буферном растворе с pH 9,6 лизатным высокоочищенным антигеном вируса герпеса 1 типа, приготовленным по следующей схеме: используют штамм вируса простого герпеса 1 типа McIntyre [коллекция АТСС -VR-539]. Вирус выращивается на культуре эпителиальных клеток почек зеленых мартышек Vero-B, предоставленных доктором Ходавандом, компания Viro-Immun, Германия. Данную культуру с посевной концентрацией 120 кл/мл выдерживают в «матрацах» при температуре 37±1°C в течение 4-х дней до образования плотного монослоя клеток. Затем вносят вирус герпеса 1-го типа в дозе 0,2 ТЦД (титр цитопатического действия) 90/клетку и проводят его адсорбцию. Зараженную культуру инкубируют 2 суток до полного разрушения монослоя в результате цитопатического действия вируса. С поверхности инфицированного клеточного монослоя удаляется ростовая среда и вносится фосфатно-солевой буферный раствор. После этого содержимое культурального флакона подвергают однократно замораживанию при -40°C и оттаиванию при комнатной температуре. Для окончательного высвобождения вируса из клеток данную вируссодержащую суспензию подвергают ультразвуковой обработке в течение 1 мин 30 с при частоте 20 Гц. Высокоскоростным центрифугированием (8000 об/мин, 30 мин, при 4±1°C) отделяют остатки разрушенных клеток (детрит), осадок удаляют, а полученный супернатант, содержащий антиген, замораживают при -70°C. Полученный таким способом антиген размораживается, разводится в КББ (карбонат-бикарбонатном буфере) до концентрации белка 2 мкг/мл, вносится в лунки по 100 мкл, инкубируется при температуре (22±4)°C в течение (20-24) часов, отмывается дистиллированной водой, обрабатывается блокирующим раствором и лиофильно высушивается на машине лиофильной сушки DELTA 1-24 LSK, при вакууме в 0,06 mbar в течение 3-х часов.

В качестве блокирующего неспецифические реакции раствора используется раствор следующего состава: вносят из расчета на 1 литр дистиллята трис(гидроксиметил)аминометана - 12,1 г, БСА (бычий сывороточный альбумин) - 5 г и сахарозы - 20 г, pH буферного раствора доводят до 7,2-7,3 соляной кислотой. Планшеты снова инкубируют в течение 2 ч при температуре 37°C. Содержимое планшетов вытряхивают в контейнер для сброса, затем планшеты лиофильно сушат на машине DELTA 1-24 LSK в течение 3-х часов.

Готовые иммуносорбенты вкладывают в пакеты из алюминиевой фольги на полиэтиленовой основе (ламинат) или из полиэтиленовой пленки и размещают вертикально в камере машины лиофильной сушки DELTA 1-24 LSK. Выбирают режим в соответствии с инструкцией по эксплуатации. Режим сушки - main drying. Продолжительность сушки - от 3 до 20 часов. Вакуум - 0,06 mbar. После этого производят вакуумную запайку иммуносорбентов. Планшеты вкладывают по одной штуке в пакеты из алюминиевой фольги на полиэтиленовой основе (ламинат) или из полиэтиленовой пленки и запаивают с помощью устройства для вакуумной запайки планшетов. В течение процесса сушки периодически контролируют работу оборудования. По окончании сушки камеру заполняют очищенным азотом. Основные параметры процесса сушки иммуносорбента регистрируют в журнале учета работы лиофилизатора.

Авторам не известны технические решения, имеющие совокупность признаков, подобную заявляемому изобретению. Следовательно, предлагаемое изобретение отвечает критерию - новизна.

Использование натурального лизатного высокоочищенного антигена вируса герпеса 1 типа АТСС - VR-539 позволяет значительно повысить чувствительность анализа, специальная система блокировки на основе триса позволяет нейтрализовать нежелательные неспецифические реакции, которые могли бы возникнуть при использовании натуральных антигенов.

Кроме того, дополнительным техническим результатом, достигаемым при использовании изобретения, является улучшение условий сохранения активности реагентов на поверхности твердофазного носителя (1 год в сравнении с 6 мес.), уменьшение расхода реагентов (за счет использования высокоиммуногенных белков в вирусном лизатном антигене). Использование полиэтиленгликоля при обработке планшета повышает специфичность и чувствительность набора.

Иммуносорбент, получаемый по предлагаемому способу, найдет широкое применение в здравоохранении, в частности в клинических лабораториях, для проведения химического, иммунохимического и иммунологического анализа и может быть использован для детектирования маркера вируса герпеса 1 типа. Следовательно, предлагаемое изобретение отвечает критерию промышленной применимости.

Способ применения иммуносорбента осуществляется следующим образом.

Пример. Проведение анализа с использованием иммуносорбента, полученного по предлагаемому способу.

Вносят контрольные и исследуемые образцы (соблюдая указанную последовательность): в одну лунку (например, A1) - 100 мкл раствора для разведения образца (РРО); в две лунки (например, B1, C1) - по 100 мкл контрольного положительного образца (К+), в две лунки (например, D1, E1) - по 100 мкл контрольного «порогового» образца (К+пор), в две лунки (например, F1, G1) - по 100 мкл отрицательного контрольного образца (K-), в следующие лунки - по 100 мкл рабочих разведений (1:100) исследуемых образцов (по 1 лунке на образец). При использовании вспомогательного планшета для разведения образцов в соответствующие лунки иммуносорбента вносят по 90 мкл РРО, а затем - по 10 мкл образцов, разведенных 1:10 в лунках вспомогательного планшета, тщательно перемешивают пипетированием. Планшет закрывают крышкой или клейкой пленкой. Инкубируют 30 мин при температуре от 21 до 25°C в защищенном от света месте. С помощью промывателя удаляют образцы из лунок, 4 раза промывают планшет промывочным раствором, внося в лунки 350-370 мкл раствора. При наличии промывателя, позволяющего производить промывку в режиме "Overflow", используют именно этот режим. По окончании промывки удаляют остатки влаги из лунок, постукивая планшетом по фильтровальной бумаге, положенной на полиэтиленовую пленку. Во все лунки вносят по 100 мкл конъюгата. Планшет закрывают крышкой или клейкой пленкой. Инкубируют 30 мин при температуре от 21 до 25°C в защищенном от света месте. С помощью промывателя удаляют жидкость из лунок, 4 раза промывают планшет. Во все лунки вносят по 100 мкл раствора индикаторного, немедленно помещают планшет в защищенное от света место и выдерживают 10-15 мин при температуре от 21 до 25°C. Во все лунки (в той же последовательности, с которой вносился индикаторный раствор) вносят по 100 мкл стоп-реагента, осторожно (постукиванием по планшету) перемешивают содержимое лунок и не более чем через 10 мин приступают к учету результатов.

Исследуемые образцы учитываются:

как положительные при ОП>1,1×ОП(К+пор),

как отрицательные при ОП<0,9×ОП(К+пор).

Образцы с ОП в пределах от 0,9×ОП(К+пор) до 1,1×ОП(К+пор), т.е. в так называемой "серой" зоне, рекомендуется исследовать повторно, поскольку результаты, полученные в ней, не могут быть однозначно интерпретированы.

При повторном получении указанного результата рекомендуется мониторинг наличия антител у пациента для исключения неспецифических реакций, которые также могут давать сомнительные результаты.

Проведенные нами испытания с использованием иммуносорбента по настоящему изобретению (с использованием лизатных натуральных антигенов АТСС-VR-539) и иммуносорбента (по прототипу) на клиническом материале и на сыворотках доноров показали более высокую чувствительность и специфичность. Данные результаты отражены в сводной сравнительной таблице 1 по чувствительности и специфичности ИФА.

Дополнительно хотелось бы отметить, что проведенные нами испытания установили, что заявленная технология приготовления иммуносорбента позволила добиться сохранения активности реагентов на поверхности твердофазного носителя в течение 1 года.

Таблица 1
Заявляемый иммуносорбент «ИФА-ВПГ 1-IgG»
№ образца Титр в ИФА (по калибр. графику) Результат № образца Титр в ИФА Результат
396 160 Положительный 396 100 отрицательный
473 460 положительный 473 400 положительный
514 390 положительный 514 300 положительный
515 390 положительный 515 300 положительный
480 320 положительный 480 200 положительный
485 160 положительный 485 100 отрицательный
425 180 положительный 425 100 отрицательный
468 370 положительный 468 300 положительный
430 420 положительный 430 300 положительный
461 190 положительный 461 100 отрицательный
505 160 положительный 505 100 отрицательный
512 460 положительный 512 400 положительный
421 230 положительный 421 200 положительный
435 180 положительный 435 200 положительный
452 170 положительный 452 100 отрицательный
501 370 положительный 501 300 положительный
424 190 положительный 424 200 положительный
528 160 положительный 528 100 сомнительный
480 370 положительный 480 300 положительный
491 170 положительный 491 100 отрицательный
472 180 положительный 472 100 отрицательный
478 180 положительный 478 200 положительный
473 500 положительный 473 500 положительный
514 420 положительный 514 400 положительный
515 430 положительный 515 300 положительный
480 310 положительный 480 200 положительный
485 170 положительный 485 100 отрицательный
425 220 положительный 425 200 положительный
468 340 положительный 468 300 положительный
доноры
100 образцов 2 образца определены как положительные с титром 1:200 100 образцов 5 образцов определены как положительные с титром 1:200 (3 образца) и 2 образца с титром 1:300

Способ получения иммуносорбента для диагностики вируса простого герпеса 1 типа, включающий предварительную обработку полимерного твердофазного носителя, на который сорбируется антиген вируса герпеса 1 типа водным 20% раствором полиэтиленгликоля (ПЭГ-20), с последующей адсорбцией на носителе в 0,2 М карбонат-бикарбонатном буферном растворе с pH 9,6 лизатного высокоочищенного антигена вируса герпеса 1 типа, приготовленного из штамма вируса простого герпеса 1 типа - АТСС VR-539, отмывку, лиофильную сушку, инкубацию сорбированных антигенов с блокирующим раствором, который готовится следующим образом: вносят из расчета на 1 литр дистиллята трис(гидроксиметил)аминометана - 12,1 г, БСА-5 г и сахарозы - 20 г, pH буферного раствора доводят до 7,2-7,3 соляной кислотой, после чего носитель повторно лиофильно высушивают.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к биологии и медицине, а именно - к качественной и/или количественной индикации аналитов. Устройство для сбора аналита из раствора путем концентрирования его на магнитных частицах включает в себя проточную камеру, состоящую из верхнего и нижнего каналов, содержащих электроды для создания электрического поля, перпендикулярного потоку жидкости в проточном канале из полупроницаемой диализной мембраны, размещенном между верхним и нижним каналами, концентратор магнитного поля и магнит для создания магнитного момента в концентраторе.

Группа изобретений относится к медицине, а именно к лабораторной диагностике, и может быть использована для выполнения анализа кластеров. Анализ содержит следующие этапы: a) предоставляют суспензию из суперпарамагнитных частиц в жидкости, предназначенной для анализа, при этом суперпарамагнитные частицы покрыты биологически активным агентом; b) обеспечивают для частиц возможность формировать кластеры частиц с аналитами, присутствующими в жидкости; c) применяют вращающееся магнитное поле (В), имеющее угловую частоту, обеспечивающую вращение магнитным полем только кластеров, имеющих размер, меньший или равный заданному размеру, и d) детектируют вращающиеся кластеры.
Настоящее изобретение относится к иммунологическому тесту для обнаружения и специфического определения аутоантител против антигенов семенников, которые присутствуют при воспалительных заболеваниях половой системы самцов млекопитающих, в биологическом образце самца млекопитающего, в частности для обнаружения тестикулярных аутоантител к ER-60 и/или трансферриновых аутоантител.

Группа изобретений относится к области медицины и может быть использована для мультиплексного анализа. Анализирующее устройство содержит реакционное пространство, два набора индивидуально закодированных микроносителей (2), причем каждый микроноситель является функционализирующим, а каждый микроноситель одного из по меньшей мере двух наборов имеет одинаковую функционализацию, в котором реакционное пространство является микроканалом.

Изобретение предусматривает способ управления возбуждением маркерных частиц в биосенсорном устройстве, в частности биосенсорном устройстве, использующем нарушенное полное внутреннее отражение.
Изобретение относится к медицине и используется для лечения эндогенной интоксикации, вызываемой высокой концентрацией билирубина в плазме крови при различных патологиях.

Группа изобретений относится к медицине, а именно к лабораторной диагностике, и может быть использована для управления перемещением магнитных или намагничиваемых объектов в картридже биосенсора.

Группа изобретений относится к области лабораторной диагностики и может быть использована для определения наличия аналита и его количества в биологических жидкостях.

Изобретение относится к способам определения эффективности лиганда ионного канала. Ex vivo способ определения эффективности лиганда ионного канала in vivo в зависимости от присутствия плазмы, включает стадии: a) приведение клетки, экспрессирующей ионный канал, в контакт с i) плазмой животного и ii) лигандом ионного канала и b) определение эффекта лиганда ионного канала на клетку, или a) приведение клетки, экспрессирующей ионный канал, в контакт с i) плазмой животного и ii) соединением, которое определяют как лиганд ионного канала, и b) определение эффекта соединения на клетку, или a) приведение клетки, экспрессирующей ионный канал, в контакт с плазмой животного, которому был введен лиганд ионного канала, и b) определение эффекта лиганда ионного канала на клетку.

Изобретение относится к области биохимии и предназначено для определения IgG-протеиназной активности. В лунках полистиролового планшета сорбируют полимерные матрицы небелковой природы - ДНК, хитин, затем в лунки добавляют специфические к этой матрице IgG и раствор, содержащий протеолитические ферменты.
Изобретение относится к медицинской психологии и психиатрии, может быть использовано для прогноза развития психической дезадаптации. Задачей предлагаемого изобретения является возможность прогнозирования развития психической дезадаптации на раннем донозологическом этапе.

Изобретение относится к области биохимии, в частности к выделенному полипептиду, который является биологической мишенью для ингибирования клетки-метанопродуцента, а также к выделенному полинуклеотиду, который кодирует этот полипептид.
Изобретение относится к области медицины, а именно к онкологии, и может быть использовано для прогнозирования развития гематогенных метастазов после комбинированного лечения при раке почки.

Изобретение относится к области медицины, в частности к клинической лабораторной диагностике. Предложен биологический микрочип для выявления и многопараметрического анализа противохолерных антител в сыворотке крови человека, содержащий массив дискретно нанесенных и иммобилизованных на поверхности подложки O-антигенов V.
Настоящее изобретение относится к иммунологическому тесту для обнаружения и специфического определения аутоантител против антигенов семенников, которые присутствуют при воспалительных заболеваниях половой системы самцов млекопитающих, в биологическом образце самца млекопитающего, в частности для обнаружения тестикулярных аутоантител к ER-60 и/или трансферриновых аутоантител.

Группа изобретений относится к области биотехнологии, а именно к исследованию биомолекулярных взаимодействий и детектированию биомолекул с использованием поверхностного плазмонного резонанса.

Изобретение относится к ветеринарной медицине, в частности, к патологической гистологии. Способ прижизненной диагностики латентного течения инфекционной анемии цыплят включает морфологическую оценку мазков крови и пунктата костного мозга больных цыплят.
Изобретение относится к области медицины, а именно к способу качественной дифференциальной диагностики доброкачественных и злокачественных новообразований околоушной слюнной железы по содержанию биомаркеров в ротовой жидкости.
Изобретение относится к области медицины, а именно к способу диагностики спонтанной формы вторичной иммунной недостаточности у детей с первичным перитонитом. Способ заключается в том, что в пробе венозной крови определяют относительное содержание активированных классических моноцитов с фенотипом CD14bright CD16-HLA-DR+ от общего количества моноцитов с фенотипом CD14bright методом многоцветной проточной цитометрии и при его значении более 68,8% диагностируют спонтанную форму вторичной иммунной недостаточности.

Изобретение относится к области офтальмологии и представляет собой способ прогнозирования развития пороговой стадии ретинопатии недоношенных у детей без офтальмоскопических признаков заболевания, отличающийся тем, что на сроке по 33 неделю гестационного возраста в сыворотке крови определяют содержание фактора роста эндотелия сосудов (VEGF) и при уровне VEGF, равном или превышающем 1300 пг/мл, прогнозируют развитие пороговой стадии ретинопатии недоношенных.
Изобретение относится к области медицины, а именно к неонатологии и детской неврологии, и может использоваться для прогнозирования риска развития поражения центральной нервной системы (ЦНС) у новорожденных детей с различным сроком гестации в неонатальном периоде. Сущность способа: определяют уровень васкулоэндотелиального фактора роста и нейроспецифической енолазы в сыворотке крови. Затем рассчитывают вероятность риска развития тяжелого поражения центральной нервной системы р по формуле: p=1/(1+e-F), где е - основание натурального логарифма = 2,718; F - разделяющая функция, которую рассчитывают по формуле: F=0,0235·VEGF-4,5·NSE-2,46, где VEGF - содержание васкулоэндотелиального фактора роста в сыворотке крови; NSE - содержание нейроспецифической енолазы в сыворотке крови. При p равном либо более 0,5 прогнозируют низкий риск, а при p менее 0,5 прогнозируют высокий риск развития тяжелого поражения ЦНС. Способ обеспечивает высокую чувствительность, диагностическую точность и информативность способа, дает возможность расширить область применения, в частности, для новорожденных с различным сроком гестации. 2 пр.
Наверх