Способ лечения радиационного, химического и/или биологического поражения организма и способ получения глобулинов для лечения радиационного, химического и/или биологического поражения организма


 


Владельцы патента RU 2524612:

Федеральное государственное бюджетное учреждение "Федеральный центр токсикологической, радиационной и биологической безопасности" (ФГБУ "ФЦТРБ-ВНИВИ") (RU)

Группа изобретений относится к ветеринарии и медицине, в частности к получению и использованию биопрепаратов для иммунотерапии экопатологий. Группа изобретений включает получение белкового антигена из смеси анатоксинов из трех энтеропатогенных вирулентных штаммов возбудителя эшерихиоза телят E. coli №378, 379, 380 путем выращивания их на среде Хоттингера с последующим добавлением 0,4-0,5%-ного формалина, дальнейшим термостатированием в течение 10-12 дней и охлаждением смеси анатоксинов стерильным раствором гидроокиси алюминия, затем получения радиоантигена из E. coli «ПЛ-6» путем выращивания культур на мясопептонном агаре с последующим смывом биомассы физиологическим раствором и облучением полученной суспензии с концентрацией 1,2·1010 м.к./см3 на гамма-установке в дозе 140-150 Гр с дальнейшим термостатированием и экстрагированием радиотоксина 70%-ным подкисленным 0,05%-ной соляной кислотой до pH 5,5 этанолом, последующим упариванием экстрагента до исходного объема, далее получение белково-кадмиевого радиоантигена сначала путем предварительного дехлорирования кадмия хлорида, получения гидроокиси кадмия, добавления в полученный 2,7%-ный раствор радиоантигена 0,77%-ного раствора гидроокиси кадмия в соотношении 1:1 с последующим термостатированием при температуре 37°C в течение 30 мин, упариванием и растворением осадка до 12,8%-ной концентрации, дальнейшим получением белково-кадмиевого радиоантигена путем добавления 1,2%-ного раствора смеси трех анатоксинов E. coli и 12,8%-ного раствора кадмиевого радиоантигена в соотношении 1:9, конъюгирования компонентов при комнатной температуре в течение 8-10 часов, стандартизацию по сухому веществу до 10%-ной концентрации и розлив во флаконы, хранение при температуре 4-6°C. Группа изобретений также относится способу лечения радиационного, химического и/или биологического поражения организма введением 10%-ного раствора комплексного белково-кадмиевого радиоантигена. Применение группы изобретений эффективно в лечении радиационного, химического и/или биологического поражения. 2 н. и 2 з.п. ф-лы, 6 пр.

 

Изобретение относится к ветеринарии и медицине, в частности к производству и использованию препаратов, предназначенных для экстраиммунной терапии при радиационно-химическо-биологическом поражении организма или каждого из поражений.

Известен способ лечения радиационных поражений организма, предусматривающий введение противолучевой сыворотки млекопитающих подкожно в дозе 100-125 мг/кг массы тела молодым и 200-250 мг/кг взрослым в течение 10 суток после облучения, и способ получения препарата для лечения радиационных поражений организма путем 2-кратного облучения животного-донора на гамма-установке, взятия крови, выделения сыворотки и подкожного ее введения (патент RU №2169572, A61K 35/28, опубл. 27.06.2001 г.).

Недостатком данного изобретения является ограниченность применения препарата - защищает только от радиационных поражений организма.

Известна ассоциированная вакцина для специфической профилактики смешанных инфекционных диарей новорожденных поросят, этнологическими агентами которых являются рота-, коронавирусы и энтеропатогенные штаммы кишечной палочки, содержащие антигены К 88, К 99 и 987 Р (патент RU №2137499, A61K 39/295, опубл. 20.09.1999 г.).

Недостатком этой вакцины является тоже ограниченность применения - только для профилактики инфекционных и вирусных болезней животных.

Известен способ лечения радиационно-кадмиевого поражения организма радиацией и кадмием путем подкожного трехкратного введения противорадиационного лечебно-профилактического иммуноглобулина в дозе 50 мг/кг и введение в рацион бентонита из расчета 2% от его массы (см. Автореф. Л.Р. Фаттерахманова «Комбинированное поражение животных гама-радиацией и кадмием и применение средств терапии». - Казань, 2008. - 23 с.).

Недостатком способа является отсутствие противорадиационного эффекта - способ не защищает животных от поражения организма биологическими агентами, в частности от возбудителя эшерихиоза.

Задачей изобретения является создание унифицированного препарата, обладающего широким спектром лечебного действия как при радиационном, химическом и/или биологическом поражении организма, так и при каждом поражении в отдельности или при их сочетании.

Поставленная задача решается тем, что способ лечения радиационного химического и/или биологического поражении организма предусматривает введение 10%-ного раствора комплексного белково-кадмиевого радиоантигена, состоящего из смеси анатоксинов трех вирулентных штаммов, E. coli №378, 379, 380 и белково-кадмиевого радиоантигена, который 4-кратно подкожно вводят животным, получают гипериммунную антисыворотку, затем выделяют из нее глобулины, которые вводят однократно подкожно в дозе 20-25 мг/кг по белку пораженным животным. А 4-кратное подкожное введение 10%-ного раствора комплексного белкового-кадмиевого радиоантигена проводят с интервалом 2 недели - 1-я, 2-я, 3-я инъекции, затем с интервалом 4 недели - 4-я инъекция в дозе 1 мг белкового-кадмиевого радиоантигена + 500 мкл полного адъюванта Фрейнда для 1-й и 2-й инъекций и в дозе 1 мг белково-кадмиевого радиоантигена + 500 мкл физиологического раствора для 3-й и 4-й инъекций, а через 7 дней берут пробы крови и полученные антисыворотки тестируют в непрямом варианте ИФА на наличие антиэшерихиозных, антикадмиевых и антирадиотоксических поликлональных антител, а затем из них выделяют глобулины путем высаливания сульфатом аммония.

Поставленная задача решается и тем, что создан способ получения глобулинов для лечения радиационного, химического и/или биологического поражения организма, предусматривающий сначала получение белкового антигена из смеси анатоксинов из трех энтеропатогенных вирулентных штаммов возбудителя эшерихиоза телят E. coli №378, 379, 380 путем выращивания их на среде Хоттингера с последующим добавлением 0,4-0,5%-ного формалина, дальнейшим термостатированием при температуре 37°C в течение 10-12 дней и осаждением смеси анатоксинов стерильным раствором гидроокиси алюминия, затем получения радиоантигена из E. coli «ПЛ-6» путем выращивания культуры на мясопептонном агаре в течение 48 часов с последующим смывом биомассы физиологическим раствором и облучением полученной суспензии с концентрацией 1,2-1010 м.к./см3 на гамма-установке в дозе 140-150 Гр, с дальнейшим термостатированием в течение 3,5-4,5 ч при 37°C и экстрагированием радиотоксина 70%-ным подкисленным 0,05% соляной кислотой до pH 5,5 этанолом, последующим упариванием экстрагента на роторном испарителе при температуре 20°C до исходного объема, и далее получения белково-кадмиевого радиоантигена сначала путем предварительного дехлорирования кадмия хлорида, получения гидроокиси кадмия, а затем в полученный 2,7%-ный раствор радиоантигена добавляют 0,77%-ный раствор гидроокиси кадмия в соотношении 1:1 с последующим термостатированием при температуре 37°C в течение 30 мин, упариванием и растворением осадка до 12,8%-ной концентрации, дальнейшим получением белково-кадмиевого радиоантигена путем добавления 1,2%-ного раствора смеси трех анатоксинов E. coli и 12,8%-ного раствора кадмиевого радиоантигена в соотношении 1:9, дальнейшего конъюгирования компонентов при комнатной температуре в течение 8-10 часов, стандартизации по сухому веществу до 10%-ной концентрации и дальнейшего розлива во флаконы и хранения при температуре 4-6°C. А дехлорирование кадмия хлорида проводят путем щелочного гидролиза с использованием, например, едкого натрия в соотношении 1:2 соответственно, подогревают до температуры 40-45°C, гидролиз ведут в течение ночи, надосадочную жидкость, содержащую растворенный NaCl, декантируют, а полученный осадок - гидроокись кадмия разводят до 1%-ной концентрации и используют для получения белково-кадмиевого радиоантигена.

Полученные по описанной технологии глобулины обеспечивают эффективное лечение поражений организма, вызванных как при комплексном радиационном, химическом и/или биологическом воздействии, так и при их отдельном воздействии.

Технология получения глобулинов для лечения радиационного, химического и/или биологического поражения и способ лечения радиационного, химического и/или биологического поражения организма состоит из 4 этапов.

На 1 этапе готовят белковую часть комплексного антигена эшерихиозный анатоксин (ЭАТ). Для его получения используют 3 вирулентных (энтеропатогенных) штамма возбудителя эшерихиоза телят: E. coli №378, 379 и 380, которые выращивают на среде Хоттингера в течение 48 ч при 37°C с последующим добавлением формалина (0,4-0,5%), термостатированием при 37°C в течение 10-12 дней и осаждением смеси анатоксинов стерильным раствором гидроокиси алюминия (ГОА) из расчета 1% на весь объем.

После отстаивания анатоксина в течение 2-3 дней надосадочную жидкость декантируют, осадок + смесь анатоксинов в виде геля используют в качестве белка-носителя гаптеновой части конъюгированного антигена (кадмированного производного радиоантигена).

На втором этапе технологического цикла получают микробный радиотоксин (РТ).

В качестве донора антигена используют вакцинный штамм E. coli «ПЛ-6», который высевают на твердую питательную среду (МПА) и выращивают в аэробных условиях 48 ч при температуре 37°C, затем биомассу смывают физиологическим раствором pH 7,2, трехкратно отмывают центрифугированием, центрифугат ресуспендируют в физиологическом растворе в концентрации 1,2-1010 м.к./см3 и используют для выделения РТ. Для этой цели микробную суспензию с указанной плотностью облучают на гамма-установке «Исследователь» в дозе 140-150 Гр с последующим термостатированием культуры в течение 4 ч при температуре 37°C. По истечении указанной экспозиции микробную биомассу осаждают центрифугированием и к осадку прибавляют 96% этанол в соотношении 1:5 и экстрагируют при комнатной температуре в течение 2 ч. Затем экстракт центрифугируют при 8000 об/мин в течение 30 мин, супернатант сливают.

Полученный экстракт упаривают на вакуумном ротационном испарителе до исходного объема и нейтрализуют 0,1 н КОН до pH 7,4, разводят физиологическим раствором до 2,7%-ной концентрации (27 мг/мл) и используют в дальнейшей работе в качестве одного из компонентов (радиоантигена) полиантигенного комплекса.

На третьей стадии получают кадмиевое производное радиоантигена - хиноидного радиотоксина. При этом для снижения токсичности комплексного антигена предварительно проводят дехлорирование кадмия хлорида (CdCl2) путем его щелочного гидролиза с помощью NaCl по реакции:

CdCl2+2NaOH=Cd(OH)2+2NaCl.

Для этого готовят водные растворы 1-молярного раствора CdCl2 (182 г/моль) и 2 молярного раствора NaOH (149,12 г/моль), которые в соотношении 1:2 (например, 100 мл раствора CaCl2 и 200 мл NaOH) сливают, доводят pH раствора до 7,7-8,0, подогревают до 35-40°C и гидролиз ведут в течение ночи, затем надосадочную жидкость, содержащую растворенный NaCl, декантируют и полученный осадок - гидроксид кадмия (Cd(OH)2) разводят до концентрации 1% раствора (10 мг/мл) и используют для получения производного радиоантигена.

Радиоантиген, представляющий собой по химическому составу окисленный хинон (o-хинон), т.е. весьма высокореакционноспособный активный радикал со свободной (разорванной) двойной связью в процессе окисления, способный легко присоединять ионы органических (белок, аминокислоты, ферменты) и неорганических (металлы и другие химические агенты) веществ. В свою очередь, гидроксид кадмия - слабый электролит и в водных растворах он гидролизуется на ионы (Cd+, OH″) и активный Cd+ легко присоединяется к окисленному о-хинону по месту разрыва двойной связи, образуя кадмиевое производное хинона C6H10OCd.

Для получения кадмиевого производного радиоантигена (КПРА) к определенному объему (например, к 50 мл) 2,7%-ного раствора радиоантигена прибавляют равный объем 0,77%-ного раствора гидроксида кадмия (Cd(OH)2) и смесь термостатируют при шуттелировании в течение 30 мин при 37°C. Затем растворитель упаривают на вакуумной центрифуге. Осадок растворяют в минимальном количестве воды и добавляют к раствору белка (анатоксина E. coli), используемого в качестве носителя гаптеновой части полиантигена - кадмиевого радиоантигена. Количество кадмиевого радиотоксина составляет 10-кратный молярный избыток по отношению к количеству белка: к 50 мл 1,2%-ного раствора анатоксина E. coli добавляют 50 мл 12,8%-ного раствор кадмиевого радиоантигена.

Реакцию конъюгирования проводят в течение ночи при комнатной температуре.

Для подтверждения стабильности конъюгированного антигена в растворе, измерения молярного соотношения кадмия, радиоантигена и белка в конъюгате проводят спектральный анализ путем измерения оптических плотностей нативных компонентов антигенов (CdCl2 o-хинона и анатоксина) и самого конъюгированного антигена на спектрофотометре.

Для измерения молярного соотношения кадмиевого производного o-хинона (радиоантигена) и белка используют метод Бредфорда (реагент Бредфорда). Для этого кумасси бриллиантовый синий G-250 (100 мг) растворяют в 50 мл 95% этанола. Затем добавляют 100 мл 85%-ной (мол. об.) фосфорной кислоты, разбавляют водой до 1 л. Используют образец, содержащий 5 мкг белка в 1 мкл. В кювету добавляют 0,5 мл реагента-красителя (реактив Бредфорда), затем вносят 1 мкл образца, хорошо перемешивают. Через 10 мин измеряют оптическую плотность при 595 нм.

Концентрацию белка определяют по калибровочной кривой, построенной с помощью эндотоксина E. coli. Затем по спектру конъюгата определяют молекулярную концентрацию CdCl2, o-хинона, а затем определяют молекулярное соотношение CdCl2, o-хинона и белка в конъюгате. Отсутствие в триантигенном комплексе спектров поглощения, характерных для отдельных компонентов, составляющих единый триантигенный комплекс, свидетельствует о стабильности полученного конъюгата.

Полученный по вышеописанной методике триантигенный комплекс - белково-кадмиевый радиоантиген (БКРА), представляющий собой 10%-ный раствор антигенов, содержащий в 1 мл препарата 100 мг антигенного вещества, из которых на долю анатоксина приходится 10 мг, на долю радиоантигена - 78 мг и на долю кадмия - 12 мг, на следующем 4-м этапе используют в качестве иммунизирующего агента для получения антисывороток. Для исключения токсического действия БКРА на организм исходный (10%-ный) раствор антигена разводят в 50 раз, получая таким образом 0,2%-ный рабочий раствор, в 1 мл которого содержится 2 мг антигенного вещества, из которых, согласно вышеприведенному соотношению компонентов, на долю экзотоксинного белка приходится 0,2, мг, радиоантигена - 1,56 мг и кадмия - 0,24 мг.

Для определения антигенной (антителосинтезирующей) активности конъюгированного антигена (БКРА) используют белых мышей, которых иммунизируют по 4-кратной схеме. Первую иммунизацию проводят путем подкожной инъекции 1 мг конъюгата в 500 мкл ПАВ, 2-ю через 2 недели 1 мг конъюгата в 500 мкл ПАВ, 3-ю через 2 недели 1 мг конъюгата в 500 мкл физиологического раствора, 4-ю через 4 недели 1 мг конъюгата в 500 мкл физиологического раствора.

Для тестирования антисывороток через неделю после 4-й иммунизации у животных отбирают по 50 мкл крови из яремной вены.

Учитывая, что оптимальным методом определения количества антител является иммуноферментный анализ (ИФА), а более доступным и простым его вариантом - непрямой конкурентный метод, при тестировании антисыворток используют последний вариант тест-системы.

Для проведения непрямого конкурентного анализа ИФА приготавливают иммунологические планшеты. Для этого готовят рабочий раствор конъюгата БКРА с концентрацией 10 мкг/мл. В каждую лунку планшета вносят 50 мкл полученного раствора и инкубируют в шейкере-инкубаторе в течение 1 ч при 37°C, 500 об/мин. Промывают планшет 3 раза фосфатно-солевым буферным раствором (ФСБ) pH 7,2 с 0,05% Tween-20. Затем, для предотвращения неспецифической сорбции реагентов, вносят в каждую лунку планшета 100 мкл 2%-ного раствора экзотоксина (анатоксина) E. coli в ФСБ и инкубируют 30 мин при 37°C, 500 об/мин. После этого планшет промывают 5 раз раствором ФСБ (pH 7,2) с 0,05% Tween-20.

В готовые планшеты вносят по 50 мкл последовательных двукратных разведений полученных гипериммунных антисывороток (начиная с 1:2 и заканчивая 1:1024). Каждое разведение вносят в 2 повторностях (т.е. по 2 лунки на каждое разведение).

Инкубируют планшет 1 ч при 37°C, 500 об/мин в шейкере-инкубаторе. Затем промывают планшет 3 раза раствором ФСБ (pH 7,2) с 0,05% Tween-20 и вносят раствор антимышиных антител, конъюгированных с пероксидазой хрена, в ФСБ с 1% экзотоксином E. coli. Инкубируют 1 ч при 37°C, 500 об/мин в шейкере-инкубаторе и промывают планшет 5 раз раствором ФСБ (pH 7,2) с 0,05% Tween-20. Вносят субстрат для пероксидазы хрена (3,3', 5,5' -тетраметилбензидин). Инкубируют 10 мин при комнатной температуре, после чего останавливают цветовую реакцию добавлением равного объема (50 мкл) 1М серной кислоты (H2SO4). В планшетном спектрофотометре регистрируют поглощение при 450 нм, титры полученных сывороток в зависимости от срока иммунизации составляют 1:64-1:500.

Для подтверждения специфичности полученных антисывороток по отношению к свободному анатоксину E. coli, радиотоксину и экотоксиканту - кадмия хлориду их исследуют методом конкурентного ИФА, в ходе которого проверяют взаимодействие сывороток со свободными антигенами, составляющими конъюгированный антиген (БКРА). Для этого сыворотки при выбранном разведении вносят в лунки подготовленного микропланшета с различными разведениями свободных экзотоксина (анатоксина) E. coli, радиотоксина (радиоантигена) и кадмия хлорида. Они ингибируют взаимодействие сывороток с конъюгатом БКРА, сорбированным на твердой фазе (т.е. антитела взаимодействуют со свободными экзотоксином E. coli, радиотоксином и кадмия хлоридом), о чем судят по изменению оптической плотности при 492 нм. Уменьшение оптической плотности от 0,7 до 0,3 (при добавлении анатоксина E. coli) от 0,5 до 0,05 (при добавлении радиоантигена) и от 0,45 до 0,12 (при добавлении CdCl2) свидетельствует о наличии в исследуемых сыворотках специфических антиэшерихиозных, антирадиотоксических и антикадмиевых антител, которые способны взаимодействовать со свободными иммунотоксическими агентами - экзотоксином E. coli, радиотоксином и экотоксикантом - CdCl2 в организме, нейтрализовать их, оказывая, таким образом, антитоксический эффект как при изолированном, так и сочетанном поступлении их в организм.

Таким образом, антисыворотки, полученные путем иммунизации животных комплексным полиантигеном (БКРА), представляют собой поликлональные антитела с различной иммунологической компетентностью, обладающие способностью вступать в химическую связь с экотоксикантами (радиотоксины, экзотоксины, тяжелые металлы), что является основанием для испытания их в качестве средств экстраиммунной терапии, при поражении организма агентами физической (у-лучи), химической (экотоксикант - CdCl2) и биологической (E. coli) природы.

Для стандартизации иммунохимического состава антител и повышения их терапевтической активности из антисывороток выделяют глобулины в соответствии с общепринятыми в иммунохимии методами (см. кн. «Экспериментальная иммунохимия». Под ред. Н.В. Холчева. - М.: Медицина. -1968. - 665 с), осадок глобулинов разводят до 10%-ной концентрации (100 мг/мл), фасуют в стерильные стеклянные флаконы емкостью 500 см3, стерилизуют и хранят в холодильнике при 4-6°C.

Полученный 10%-ный раствор глобулинов вводят облученным, больным эшерихиозом и пораженным кадмия хлоридом животным однократно подкожно в дозах 20-25 мг/кг по белку (0,4 мл/кг).

Способ получения конъюгированного антигена и многофункционального лечебного глобулина иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Для получения эшерихиозного анатоксина энтеротоксигенные вирулентные штаммы E. coli №378, 379, 380 засевали в двухлитровые колбы со средой Хоттингера (pH 7,8), выращивали в течение 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 дней при температуре 35, 36, 37, 38, 39°C. Затем к культуре добавляли формалин до концентрации 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6 и 0,7%, выдерживали в термостате при 35, 36, 37, 38°C в течение 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 дней. Полученный анатоксин осаждали 5, 7, 9, 10, 12, 14%-ным стерильным раствором гидроокиси алюминия (ГОА) из расчета 0,5, 0,7, 0,9, 1,0, 1,1, 1,2% на весь объем. Результаты опытов показали, что наиболее высокой биологической активностью обладает смесь анатоксинов, полученных из трех штаммов E. coli №№378, 379 и 380, выращенных на среде Хоттингера в течение 24 ч с последующим добавлением формалина из расчета 0,4-0,5% и термостатирования культур при 37°C в течение 10-12 дней, и осаждения смеси алюминия из расчета 1 об.%. Любые изменения параметров инкубирования культур (температуры, экспозиции), концентрации формалина и количества штаммов-продуцентов приводило к снижению биологической активности анатоксинов.

Пример 2. Для получения второго компонента - радиоантигена (окисленного о-хинона), штамм E. coli «ПЛ-6» высевали на плотную питательную среду (МПА) и выращивали при 37°C в течение 24, 48, 72 ч. Затем биомассу смывали физиологическим раствором, центрифугировали при 5000, 6000, 7000, 8000, 9000, 10000 об/мин, повторяя эту процедуру 1, 2, 3, 4, 5 раз. Осадок, ресуспендировали в физиологическом растворе из расчета 1,0·1010, 1,1·1010, 1,2·1010, 1,3·1010, 1,4·1010 м.к./см3 и облучали на гамма-установке «Исследователь» в дозах 50, 100, 200, 250, 300 Гр при мощности дозы 2,064 Кл. После облучения культуру инактивировали при 35, 36, 37, 38, 39°C в течение 1, 2, 3, 4, 5, 6 ч и проводили экстрагирование радиотоксина с использованием 50, 60, 70, 80, 90%-ного подкисленного (0,01, 0,02, 0,03, 0,04, 0,05 0,06, 0,07% HCl) до pH 5,1, 5,2, 5,3, 5,4, 5,5, 5,6, 5,7 этанола, повторяя эту операцию 2, 3, 4, 5 раз. Полученные экстракты упаривали на роторном испарителе при 10, 15, 20, 25°C до исходного объема и нейтрализовали 0,05, 0,07, 0,1, 0,2, 0,3 н. КОН до pH 6,4, 6,5, 6,7, 6,8, 7,0, 7,1 и 7,2. Результаты опытов показали, что наиболее активные препараты радиотоксина (радиоантигена) получены при выращивании E. coli «ПЛ-6» при 37°C в течение 24 ч, облучении суспензии микроба с концентрацией 1,2-1010 м.к./см3, в дозе 140-150 Гр, термостатировании в течение 3,5-4,5 при 37°C, этаноловом экстрагировании культуры подкисленным (0,05 HCl) до pH 5,5-5,6, упаривании экстрагента при 37°C. Любые изменения указанных параметров в сторону уменьшения или увеличения приводят к снижению биологической активности радиотоксина.

Пример 3. Для получения кадмиевого радиоантигена (хиноидного РТ) с целью снижения токсичности кадмия хлорида и повышения его реакционной способности вначале проводили его дехлорирование путем гидролиза CdCl2 концентрированным раствором щелочи (NaOH). Для этого готовили насыщенные (40, 50, 60%-ные) растворы щелочи и CdCl2 и смешивали их в молярных соотношениях (г/моль) CdCl2+NaOH 0,5:0,5, 1:1, 1:1,5, 1:2, 1:2,5, 1:3. Гидролиз вели при 20, 25, 30, 35, 40°C в течение 10, 15, 20, 25, 30-часовой экспозиции. По истечении указанных экспозиций надосадок удаляли. Установлено, что максимальный выход гидроксида кадмия которого достигался при молярном соотношении компонентов (CdCl2+NaOH) 1:2 при 10-12-часовой экспозиции и температуре 35°C.

Пример 4. Для получения кадмиевого радиоантигена к 10, 20, 30, 40, 50 мл 1,0, 1,5, 2,0, 2,5, 2,7, 2,9, 3,0%-ного раствора радиоантигена прибавляли 10, 20, 30, 40, 50 мл 0,50, 0,60, 0,65, 0,70, 0,73, 0,77, 0,80, 0,85%-ные растворы гидроксида кадмия (Cd(OH)2) и смесь инкубировали в термостате при 25, 30, 35, 37, 39, 40°C в течение 10, 15, 20, 25, 30, 35 мин.

Результаты спектрального анализа показали, что максимальный выход конечного продукта - кадмиевого радиоантигена достигается при соотношении компонентов 3:1, т.е. при добавлении к 50 мл 2,7%-ного раствора 0,77%-ного раствора кадмия гидроксида, что составляло соотношение 3:1. Любые изменения указанного соотношения приводили к уменьшению выхода конечного продукта.

Пример 5. Для получения конъюгированного белково-кадмиевого радиоантигена (БКРА) готовили 0,03-, 0,06-, 0,07-, 0,08-, 0,09-, 0,1-, 0,2-, 0,3-молярные растворы экзобелка (анатоксина E. coli) и 0,5-, 0,6-, 0,7-, 0,8-, 0,9-, 1,0-, 2,0-, 3,0- молярные растворы кадмиевого радиоантигена и к 50 мл растворов каждого разведения экзобелка прибавляли по 50 мл растворов кадмиевого радиоантигена, реакцию конъюгирования проводили в течение 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 часов при 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36°C.

По истечении указанных экспозиций определяли стабильность конъюгированного антигена и оптимальные молярные соотношения компонентов в полиантигене методом спектрального анализа путем измерения оптических плотностей нативных компонентов антигенов (CdCl2, o-хинона и анатоксина) и самого конъюгированного антигена на спектрофотометре (например, СФ-46). В качестве показателя стабильности полученного антигенного комплекса служило отсутствие в триантигенном комплексе спектров поглощения, характерных для отдельных компонентов полиантигена, а молярные соотношения CdCl2, o-хинона и экзобелка E. coli в полиантигене определяли путем измерения оптических плотностей растворов с различными молярными соотношениями отдельных компонентов и самого конъюгата. Установлено, что значения оптических плотностей полиантигена и отдельных компонентов (экзобелок-анатоксин E. coli: радиоантиген: кадмий) совпадали при молярных соотношениях компонентов 1:7,8:1,2 соответственно.

Пример 6. Для определения антигенности (антителосинтезирующей) активности полученного белково-кадмиевого радиоантигена (БКРА) проводили иммунизацию белых мышей. Использовали 2 группы экспериментальных животных, каждая из которых состояла из 5 особей. Первая группа получала полиантиген внутрибрюшинно, вторая - подкожно. Использовали 4-кратную схему иммунизации с варьированием доз (0,25, 0,50, 1,0, 1,5 мг антигена) и интервала (через 2, 4, 6 недель) между введениями конъюгата.

Результаты тестирования антисывороток в прямом варианте ИФА показали, что наибольший титр антител был обнаружен у животных, подвергнутых по 2 схеме иммунизация (2-я группа), предполагающей 4-кратное подкожное введение антигена с интервалом 2 (1-я, 2-я, 3-я инъекция) и 4 недели (4-я инъекция) в дозах 1 мг БКРА+500 мкл полного адъюванта Фрейнда (ПАФ) (1-я инъекция), 1 мг БКРА+500 мкл неполного адъюванта Фрейнда (НАФ) (2-я инъекция), 1 мг БКРА+500 мкл физиологического раствора (3-я и 4-я инъекция соответственно).

Пример 7. Для оценки радиозащитной, антиэшерихиозной и антикадмиевой активности полиглобулина опыты ставили на облученных в дозе 7,7 Гр, затравленных кадмия хлоридом в дозе 50,8 мг/кг и зараженных возбудителем эшерихиоза 1·109 м.к. белых мышах, которым за 24 ч до и через 24 ч после облучения, затравки CdCl2 и заражения возбудителем эшерихиоза вводили подкожно однократно глобулины в дозах 0,12 (6 мг/кг), 0,25 (12 мг/кг), 0,5 (25 мг/кг), 1,0 мг (50 мг/кг). Перед применением исходный препарат (10%-ный раствор глобулина) разводили в 2, 4 и 8 раз, получая, таким образом, 5, 2,5 и 1,25%-ные концентрации препарата.

Установлено, что максимальная радиозащитная (выживаемость 66,6% облученных животных), антиэшерихиозная (выживаемость 59,1% зараженных возбудителем эшерихиоза животных) и антидотная (выживаемость 61,9% затравленных CdCl2 животных) наступала при однократном подкожном введении глобулинов в дозе 25 мг/кг. Изменение дозы препарата в сторону снижения приводило к снижению лечебного эффекта, а повышение - к увеличению расхода препарата. Следовательно, оптимальной лечебной дозой препарата является 25 мг/кг по белку.

Таким образом, сконструированный конъюгированный полиантигенный препарат позволяет получать поликлональные антитела - глобулины, обладающие полифункциональными лечебными свойствами при экопаталогиях, вызванных агентами радиационной, химической и/или биологической природы.

1. Способ получения глобулинов для лечения радиационного, химического и/или биологического поражения организма, предусматривающий сначала получение белкового антигена из смеси анатоксинов из трех энтеропатогенных вирулентных штаммов возбудителя эшерихиоза телят E. coli №378, 379, 380 путем выращивания их на среде Хоттингера с последующим добавлением 0,4-0,5%-ного формалина, дальнейшим термостатированием при температуре 37°C в течение 10-12 дней и охлаждением смеси анатоксинов стерильным раствором гидроокиси алюминия, затем получения радиоантигена из E. coli «ПЛ-6» путем выращивания культур на мясопептонном агаре в течение 48 часов с последующим смывом биомассы физиологическим раствором и облучением полученной суспензии с концентрацией 1,2·1010 м.к./см3 на гамма-установке в дозе 140-150 Гр с дальнейшим термостатированием в течение 3,5-4,5 часов при температуре 37°C и экстрагированием радиотоксина 70%-ным подкисленным 0,05%-ной соляной кислотой до pH 5,5 этанолом, последующим упариванием экстрагента на роторном испарителе при температуре 20°C до исходного объема, и далее получения белково-кадмиевого радиоантигена сначала путем предварительного дехлорирования кадмия хлорида, получения гидроокиси кадмия, а затем в полученный 2,7%-ный раствор радиоантигена добавляют 0,77%-ный раствор гидроокиси кадмия в соотношении 1:1 с последующим термостатированием при температуре 37°C в течение 30 мин, упариванием и растворением осадка до 12,8%-ной концентрации, дальнейшим получением белково-кадмиевого радиоантигена путем добавления 1,2%-ного раствора смеси трех анатоксинов E. coli и 12,8%-ного раствора кадмиевого радиоантигена в соотношении 1:9, конъюгирования компонентов при комнатной температуре в течение 8-10 часов, стандартизации по сухому веществу до 10%-ной концентрации и розлива во флаконы, хранения при температуре 4-6°C.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что дехлорирование кадмия хлорида проводят путем щелочного гидролиза с использованием, например, едкого натрия в соотношении 1:2 соответственно, подогревают до температуры 40-45°C, гидролиз ведут в течение ночи, надосадочную жидкость, содержащую растворенный NaCl, декантируют, а полученный осадок - гидроокись кадмия разводят до 1%-ной концентрации и используют для получения белково-кадмиевого радиоантигена.

3. Способ лечения радиационного, химического и/или биологического поражения организма, предусматривающий введение 10%-ного раствора комплексного белково-кадмиевого радиоантигена, полученного способом по пп.1, 2, который четырехкратно подкожно вводят животным, получают гипериммунную антисыворотку, затем выделяют из нее глобулины, которые вводят однократно подкожно в дозе 20-25 мг/кг по белку пораженным животным.

4. Способ по п.3, отличающийся тем, что четырехкратное подкожное введение 10%-ного раствора комплексного белково-кадмиевого радиоантигена проводят с интервалом 2 недели (1-я, 2-я, 3-я инъекции), затем с интервалом 4 недели - 4 инъекция, в дозе 1 мг белково-кадмиевого радиоантигена + 500 мкл полного адъюванта Фрейнда для 1-й и 2-й инъекций и в дозе 1 мг белково-кадмиевого радиоантигена + 500 мкл физиологического раствора для 3-й и 4-й инъекций, а через 7 дней после последней инъекции антигена берут пробы крови и полученные антисыворотки тестируют в непрямом варианте ИФА на наличие антиэшерихиозных, антикадмиевых и антирадиотоксических поликлональных антител, а затем из них выделяют глобулины путем высаливания сульфатом аммония.



 

Похожие патенты:
Изобретение относится к медицине, и в частности к препаратам для терапии опухолевых заболеваний, лечения аллергии, профилактики и общего оздоровления организма человека.
Изобретение относится к области медицины и ветеринарии и предназначено для повышения резистентности организма млекопитающих при радиоактивном поражении. В период от 12 часов до 20-30 минут до радиационного облучения и сразу после радиационного облучения млекопитающим вводят 0,11%-ный масляный препарат хлорофилла.
Композиция для лечения окислительного стресса содержит шарики липоевой кислоты или одной из ее солей и, по меньшей мере, одну липофильную окружающую среду. Шарики липоевой кислоты представляют собой частицы, состоящие из инертной сердцевины (ядра), покрытой липоевой кислотой, которая в свою очередь покрыта первым слоем изолирующего полимерного вещества и вторым полимерным слоем, резистентным (устойчивым) при желудочном значении рН.

Изобретение относится к области медицины, в частности токсикологии и радиологии, к лекарственным средствам на основе антиоксидантных белков и способам их применения.

Изобретение относится к медицине и касается фармацевтической композиции для терапии острых токсических состояний. .
Изобретение относится к медицине и фармации и может быть использовано в производстве и применении растворов для внутривенного введения при лечении состояний, связанных с эндогенной интоксикацией.
Изобретение относится к фармацевтической промышленности, а именно к средству, обладающему противовоспалительным действием. .

Изобретение относится к технологии получения углеродных сорбентов с антибактериальными свойствами на основе пористых углеродных адсорбентов и предназначено для применения в медицине и ветеринарии.
Изобретение относится к области медицины и предназначено для лечения язвенно-некротических поражений слизистой оболочки рта пациентов с множественной миеломой. .
Изобретение относится к медицине, конкретно к фармакологии, и касается средств, применяемых в терапии при отравлении фенилгидразином. .
Изобретение относится к области косметологии и представляет собой косметологический набор для лифтинга мягких тканей, характеризующийся тем, что он содержит 25-50 биодеградируемых мезонитей на основе полидиоксанона, прикрепленных на острых концах игл-проводников из высокопрочной стали с размерами 25G-31G, и 0,75-2,5 мл препарата на основе гидролизата плаценты, представляющего собой Лаеннек и/или Курасен, а также способ лифтинга мягких тканей с помощью вышеуказанного набора.

Изобретение относится к медицине, гигиене питания, а именно к способу создания продукта спортивного питания, предназначенного для определения эффективных доз натуральных витаминов и минеральных веществ с целью восполнения их физиологических потребностей в организме высококвалифицированных спортсменов.

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к новым пептидным соединениям, обладающим способностью селективно блокировать мышечный тип ацетилхолинового рецептора.

Изобретение относиться к области фармацевтики. Экстракт семян Fraxinus excelsior, способный активировать PPAR-альфа содержащий нуженид, GI3, сложный метиловый эфир олеозида, эксельсид В, GI5, салидрозид, в эффективных количествах.

Группа изобретений относится к композиции для чистки зубов и способу ее получения. Предлагаемая композиция для чистки зубов содержит в одной фазе орально приемлемый носитель; источник ионов фтора; источник ионов двухвалентного олова; источник ионов цинка и, по меньшей мере, одну полифосфатную соль, выбранную из группы, состоящей из неорганических полифосфатов, которые имеют 3 или менее атомов фосфора; причем общее содержание воды в композиции для чистки зубов составляет менее чем примерно 10% от массы композиции.

Изобретение относится к химико-фармацевтической и косметической промышленности и представляет собой композицию антиперспиранта, включающую a) активный компонент антиперспиранта; b) растительное масло в количестве 12-20% масс., c) первичный гелеобразователь, включающий С16-С18 насыщенную жирную кислоту в количестве 15-21% масс.; d) вторичный гелеобразователь, выбранный из гидрогенизированного соевого масла, частично гидрогенизированного соевого масла, углеводорода формулы CnH2n+2, где n равняется 20-100, и углеводород по меньшей мере на 90% является линейным, гидрогенизированного касторового масла (касторовый воск) и жирного спирта, где композиция представляет собой твердый карандаш или полутвердый продукт с показателем отслаивания, составляющим менее приблизительно 10%.

Изобретение относится к косметической промышленности и представляет собой антицеллюлитное липосомальное средство, содержащее заключенные в липосомы из лецитина водорастворимые экстракты Скумпии (Buxus sinica) и Аниса (Pimpinella anisum), заключенные во внутреннюю фазу липосом, и маслорастворимый экстракт Розового перца (Schinus terebinthifolius), заключенный во внешнюю оболочку липосом.

Изобретение относится к фармацевтической промышленности, а именно к фармацевтической композиции для лечения диабетической язвы. Применение фармацевтической композиции в изготовлении фармацевтического средства в области конечности или на поверхности тела, либо в изготовлении перевязочного материала для лечения диабетической язвы, где фармацевтическая композиция состоит из пищевого пчелиного воска, приготовленного на основе кунжутного масла экстракта корневища шлемника - Huangqin (хуан-циня), корневища коптиса - Huanglian (хуан-ляня), коры бархатного дерева - Huangbai (хуан-бая), дождевого червя и маковой коробочки, взятые в определенном соотношении.

Настоящее изобретение относится к гребнеобразному сополимеру, включающему: (A) одно или более повторяющихся звеньев, получаемых из олефиновых ненасыщенных катионных или катионогенных сомономеров; и (B) одно или более повторяющихся звеньев, имеющих формулу , где Y является фрагментом, образующим часть скелета сополимера и полученным из мономера, выбранного из, по меньшей мере, одного из следующих мономеров: олефиновых ненасыщенных катионных или катионогенных сомономеров, акриламидных мономеров, одного или более олефиновых ненасыщенных гидрофильных мономеров, одного или более олефиновых ненасыщенных мономеров; Z является фрагментом, который способен образовывать ассоциат с другими фрагментами Z или другими фрагментами в препарате, в котором будет использоваться сополимер, и является гидрофобным фрагментом, выбранным из алкильной, арильной, аралкильной, фторалкильной групп, имеющих от 8 до 50 углеродных атомов, кремнийорганической группы, имеющей от 35 до 25 связанных фрагментов SiO, или силана; и b является связью или фрагментом, которые соединяют фрагмент Z с фрагментом Y, и представляет собой ковалентные связи, образуемые, по меньшей мере, одним сложным эфиром, карбонилом, амидом, оксидом амина, углеводородом, амино, простым эфиром, полиоксиалкиленовыми группами, или связь, возникающую через связи ионной соли.
Настоящее изобретение относится к области косметологии и представляет собой способ получения микроэмульсионного очищающего средства накожного применения, заключающийся в смешивании неионогенных поверхностно-активных веществ с масляными компонентами до однородного состояния и добавлении воды и полиолов, отличающийся тем, что предварительно смешивают 40-60 мас.% воды с полиолами, добавляют ее в смесь неионогенных поверхностно-активных веществ с масляными компонентами, перемешивают до однородности и вводят оставшееся количество воды, при этом процесс ведут при интенсивном перемешивании и комнатной температуре.
Изобретение относится к области пищевой промышленности, биотехнологии и касается композиции антибактериальной и штамма бактериофага Escherichia coli, используемого для получения такой композиции.
Наверх