Способ идентификации живых и мертвых организмов мезозоопланктона в морских пробах



Способ идентификации живых и мертвых организмов мезозоопланктона в морских пробах
Способ идентификации живых и мертвых организмов мезозоопланктона в морских пробах
Способ идентификации живых и мертвых организмов мезозоопланктона в морских пробах
Способ идентификации живых и мертвых организмов мезозоопланктона в морских пробах
Способ идентификации живых и мертвых организмов мезозоопланктона в морских пробах
Способ идентификации живых и мертвых организмов мезозоопланктона в морских пробах
Способ идентификации живых и мертвых организмов мезозоопланктона в морских пробах

 

G01N1/30 - Исследование или анализ материалов путем определения их химических или физических свойств (разделение материалов вообще B01D,B01J,B03,B07; аппараты, полностью охватываемые каким-либо подклассом, см. в соответствующем подклассе, например B01L; измерение или испытание с помощью ферментов или микроорганизмов C12M,C12Q; исследование грунта основания на стройплощадке E02D 1/00;мониторинговые или диагностические устройства для оборудования для обработки выхлопных газов F01N 11/00; определение изменений влажности при компенсационных измерениях других переменных величин или для коррекции показаний приборов при изменении влажности, см. G01D или соответствующий подкласс, относящийся к измеряемой величине; испытание

Владельцы патента RU 2541462:

Институт биологии южных морей им. А.О. Ковалевского (RU)

Изобретение относится к способу идентификации живых и мертвых организмов мезозоопланктона в морских пробах, который включает отбор пробы, крашение организмов соответствующими красителями, визуальную оценку интенсивности окраски особей под микроскопом, которую выполняют одновременно с микрофотосъемкой организмов, используя настройки фотокамеры в ручном режиме, сохраняя эти настройки неизменными на протяжении фотосъемки по крайней мере одной пробы, после чего в полученных изображениях, применяя редактор растровой графики, например программный пакет Adobe Photoshop, измеряют средние для каждой особи цветовые и яркостные характеристики и относят особи к классу живых или мертвых, осуществляя дискриминантный анализ измеренных цифровых величин.

 

Изобретение относится к гидробиологии и может быть использовано для дифференцированного учета живых и мертвых организмов в морских пробах.

Количественное соотношение живых и мёртвых организмов в пробах мезозоопланктона - один из базовых показателей смертности сообщества, который может быть использован при изучении закономерностей функционирования морских экосистем, их биопродуктивности и круговорота веществ, а также для оценки экологического состояния акваторий.

Известны два основных методических подхода для идентификации живых и мёртвых организмов зоопланктона: визуальная оценка и окрашивание. При визуальном анализе оценивают внешнее и внутреннее состояние организма на фиксированном материале, другими словами, выявляют наличие или отсутствие признаков разложения. Этот подход начали применять ещё в 30-х годах XX в. и продолжают использовать в настоящее время [1,2], однако, он не лишен серьёзных недостатков: во-первых, - исследователю необходим большой опыт работы с зоопланктоном; во-вторых, - достоверное выявление признаков разложения возможно лишь спустя 2-3 часа после гибели организма (в некоторых случаях и позднее), что неминуемо приводит к недооценке доли мёртвых особей в пробе.

Известен способ, получивший свое развитие в 70-е годы прошлого века, основанный на окрашивании планктона различными красителями [3]. Главный недостаток этого подхода заключается в том, что степень окрашенности организмов в природных пробах может сильно варьировать. Следовательно, вывод исследователя о принадлежности организма с «сомнительной» окраской к той или иной категории носит субъективный характер. Если же численность таких организмов в пробе велика, достоверные и воспроизводимые результаты получить невозможно.

В основу изобретения «Способ идентификации живых и мёртвых организмов мезозоопланктона в морских пробах» поставлена задача получения достоверных, объективных и воспроизводимых результатов путем классификации организмов по степени окрашенности.

Поставленная задача решается тем, что в способе, осуществляя под микроскопом визуальную оценку интенсивности окраски особей, одновременно производят их микрофотосъёмку с настройками фотокамеры в ручном режиме, сохраняя эти настройки неизменными в течение фотосъемки, по крайней мере, одной пробы, после чего для полученных изображений выполняют измерение средних для каждой особи цветовых и яркостных характеристик, применяя редактор растровой графики, например программный пакет Adobe Photoshop, и классифицируют полученные значения, применяя дискриминантный анализ.

Между перечисленными существенными признаками и ожидаемым техническим эффектом присутствует следующая причинно-следственная связь. Независимо от того, какой краситель используется для маркировки живых/мёртвых организмов, основополагающим является наличие или отсутствие цвета и/или яркости. Цветовые (тоновые) и яркостные характеристики каждой из анализируемых особей, представленные в цифровом виде, позволяют применить дискриминантный анализ для объективного и достоверного разделения всей исследуемой популяции на два класса - живых и мёртвых особей.

Изобретение поясняется иллюстрациями. На фиг. 1 представлены Цифровые изображения копепод, окрашенных флуоресцеин диацетатом - FDA (А, Б) и нейтральным красным - НК (В, Γ)· А и В - живые особи, Б и Г - мёртвые особи. Пунктиром выделена область наиболее интенсивной окраски - цефалоторакс; на фиг. 2 - Измерение осредненных цветовых характеристик особи копеподы, окрашенной НК, с применением палитры цветов редактора Adobe Photoshop CS2; на фиг. 3 - Выявление кластеров живых и мёртвых организмов после их окраски FDA (А) и НК (Б). Данные получены для живой и убитой температурным шоком культуры копепод (Calanipeda aquae dulcís). На фиг. 4 - Формат данных в пакете Statistica 5.0; на фиг. 5 - Основные результаты анализа; на фиг. 6 - Кластеры точек, соответствующие классам организмов L (живые, □), D (мёртвые, ∇) и Q (сомнительные, +), на 2-параметрических диаграммах с разными независимыми переменными: А - зелёный (Green) и синий (Blue); Б - зелёный и оттенок (Hue); В - зелёный и красный (Red). На диаграмме В представлены результаты классификации особей класса Q с помощью дискриминантного анализа: ■- отнесены к живым; ▼- отнесены к мёртвым. Стрелкой указан единственный «выброс» класса D; пунктирная прямая - условная граница между классами L и D; на фиг. 7 - Фрагмент таблицы апостериорных вероятностей принадлежности особей к тому или иному классу.

Способ реализуется следующим образом:

1. Отбор пробы мезозоопланктона и её окраска для идентификации живых/мёртвых организмов - осуществляются в соответствии с методами, предусмотренными для этих целей.

2. Исследование репрезентативной выборки организмов под микроскопом:

а) отнесение каждой из особей к одному из трёх классов по визуальным признакам (интенсивности окраски):

- «Живые» (L);

- «Мёртвые» (D);

- «Сомнительные» (Q).

Визуальная оценка интенсивности окраски особей производится в поле зрения микроскопа в соответствии с методикой применения красителя. Каждую особь относят к одному из двух классов - «Живые» (L) или «Мёртвые» (D). Если это затруднительно или невозможно, особь относят к классу «Сомнительные» (Q).

б) получение цифровых изображений каждой из особей с помощью микрофотографирования.

Микрофотосъёмка окрашенных организмов производится цифровой фотокамерой в цветном режиме. Автоматический режим камеры (автоматический выбор экспозиции) не рекомендуется использовать, т.к. если в поле зрения попадают только яркие (например, живые организмы, окрашенные FDA) или только тёмные объекты (например, близкие по яркости к темному фону мёртвые организмы), то автокоррекция изображений, производимая фотокамерой, будет искажать цветовые и яркостные (контраст объекта с фоном) характеристики объектов, и, как следствие этого, сопоставление таких изображений будет невозможным. Рекомендуется выбрать настройки фотокамеры в ручном режиме таким образом, чтобы избежать, во-первых, - пересветов на наиболее ярких объектах (т.е. потери информации о яркости и цвете) и, во-вторых, - сливания объектов с фоном (например, неокрашенные объекты на тёмном поле люминесцентного микроскопа), и сохранять эти настройки неизменными в течение фотосъемки, по крайней мере, одной пробы. Это гарантия того, что изображения как живых, так и мёртвых организмов одной и той же пробы получены в одинаковых условиях и, следовательно, могут быть использованы для дальнейшего анализа. Чем реже приходится изменять настройки фотокамеры, адаптируя их к каждому конкретному красителю, виду организмов или серии проб, тем выше достоверность получаемых результатов. Вместе с тем, индивидуальные особенности фотокамер, которыми пользуются разные исследователи (отличия в уровне шума, смещение в балансе белого и др.), не могут отразиться на качестве получаемых результатов. Это означает, что анализ одной и той же пробы зоопланктона, проведенный на разном оборудовании, но в соответствии с предлагаемым способом, даст близкие результаты оценки соотношения живых и мёртвых организмов в пробе.

3. Измерение средних для каждой особи цветовых и яркостных характеристик (цветовые модели HSB, RGB, CMYK, LAB) в графическом редакторе.

В качестве программного обеспечения для дальнейшей работы с изображениями применяют любой редактор растровой графики, который позволяет определять основные цветовые и яркостные характеристики любого из пикселей изображения в соответствии с тремя цветовыми моделями: HSB (Н- цветовой тон, S - насыщенность, В - яркость), RGB (R - красный, G - зелёный, В - синий) и CMYK (С - циановый, M - пурпурный, Y - жёлтый, K - черный). Для этих целей можно использовать, например, программный пакет Adobe Photoshop или ряд бесплатных графических редакторов, которые свободно распространяются в Интернете, например, Eyedropper 4.0 beta, Pixel Pick 1.5, SI ColorPicker 1.0 и др.

Для каждой анализируемой особи получают один набор значений характеристик HSB, поэтому важное значение имеют локализация и способ отбора пробы цвета в пределах границ изображения организма. Отбор должен производиться в зонах с наибольшей интенсивностью окраски (например, у копепод, окрашенных FDA или нейтральным красным, это цефалоторакс; выделен на фиг. 1, А и В). У неокрашенных организмов используется та же зона (фиг. 1, Б и Г). Если изображение интересующей исследователя области неоднородно по цвету и яркости, имеет пятна и/или зернистость (как, например, это часто бывает у копепод, фиг. 1, В), рекомендуется сначала выделять всю окрашенную область (инструмент «лассо», Lasso Tool, в Adobe Photoshop) и осреднять её яркостные и цветовые характеристики, а потом уже производить их измерение.

4. Сведение полученных данных в таблицу в формате, пригодном для дискриминантного анализа.

По завершении измерений цветовых характеристик всех особей пробы (см. фиг. 2), полученные цифровые данные сводятся в таблицу, в которой каждая строка соответствует одной особи, количество строк равно количеству особей. Каждая особь, отнесенная к одному из классов, I, D или Q (категориальная переменная CLASS), характеризуется цветовыми переменными, максимальное число которых может составлять 13 (RGB, HSB, CMYK, LAB). Оптимальный путь - ограничиться 6-ю переменными моделей RGB и HSB. Для работы с каждым конкретным красителем, как правило, требуется небольшой набор переменных. Например, при окраске зоопланктона красителем FDA, имеющим флуоресценцию зеленого цвета, достаточно измерить насыщенность и яркость (соответственно, S и В из HSB). Уменьшить размерность данных (т.е. количество анализируемых переменных) можно после того, как будет ясно, какие именно переменные позволяют наиболее эффективно выявлять классы живых и мёртвых организмов. На 2-параметрических диаграммах последние будут выглядеть как хорошо отличимые кластеры точек (фиг. 3, А). Если кластеры L и D не могут быть выявлены ни на одной из диаграмм и, как следствие этого, затруднён выбор переменных, значение которых велико для классификации организмов, уменьшение размерности данных производится с помощью дискриминантного анализа (см. ниже).

5. Применение дискриминантного анализа для:

а) уменьшения размерности данных (пошаговый анализ с включением переменных);

б) построения классификации объектов, используя классы L и D в качестве обучающей выборки;

в) отнесения каждого из организмов класса Q к классам L или D в соответствии с дискриминантной моделью.

Классификация организмов со слабо выраженной окраской. В природных пробах обычно присутствует большое число организмов, интенсивность окраски которых невелика (класс Q), и которые трудно отнести к живым или мёртвым с помощью визуального анализа. На диаграммах они образуют облако точек, которое накладывается на кластеры L и D (см. ниже пример), что затрудняет выбор цветовых переменных, которые бы обеспечили объективную и достоверную классификацию. Для решения обеих проблем мы предлагаем использовать дискриминантный анализ - эффективный метод построения классификации с помощью обучающей выборки. Последняя должна включать организмы, которые были без затруднений отнесены исследователем к классам L или D в ходе микроскопирования пробы. В сводной таблице данных информация о принадлежности организма к тому или иному классу содержится в категориальной переменной CLASS. В дискриминантом анализе её используют в качестве группирующей зависимой переменной (grouping dependent variable), а цветовые характеристики (Hue, Saturation, Brightness, Red, Green и др.), измеренные в метрической шкале, считают независимыми переменными (independent variables). Уменьшение размерности данных может производиться в пошаговом анализе дискриминантных функций. На каждом шаге просматриваются все независимые переменные, и находится та из них, которая вносит наибольший вклад в различие между классами. Модель дискриминантного анализа, которая строится на основе обучающей выборки, позволяет установить с определённой достоверностью принадлежность организмов со спорной окраской (класс Q) к классам L или D. Иллюстрация применения дискриминантного анализа к решению подобного рода задачи приводится в Примере.

Пример.

Определение доли живых копепод в морском зоопланктоне после окраски нейтральным красным (НК).

Пробы морского зоопланктона отбирали в прибрежных водах г. Севастополя (Чёрное море) и окрашивали НК в соответствии со стандартными методами. Живые организмы окрашенные НК, приобретали красный цвет, в то время как мёртвые оставались бледно жёлтыми. Фотосъёмку организмов производили с помощью микроскопа Nikon Eclipse TS100-F, оборудованного камерой Ikegami ICD-848P, в световом (светлое и темное поле для НК) и люминесцентном режимах (набор светофильтров для возбуждения в синей области спектра для FDA). Осреднение и измерение цветовых переменных производили в графическом редакторе Adobe Photoshop CS2. Анализ результатов был затруднен присутствием в пробе слабо окрашенных организмов (19 из 108 исследованных особей копепод), поэтому требовалось применение дискриминантного анализа (StatSoft 8ΤΑΉ8ΤΙΟΑ 5.0). Для построения дискриминантной модели использовали 5 независимых переменных (HSB, RGB), а классы «Живые» (L) и «Мёртвые» (D) - в качестве обучающей выборки. Переменная Brightness была исключена из анализа, как малозначимая для классификации (формат данных показан на фиг. 4). Полученная дискриминантная модель является статистически значимой (р<0,001). Информация о вкладе каждой независимой переменной в различение классов представлена на фиг. 5. Только две переменные Green и Red оказались статистически значимыми (p<0,01) и вносили решающий вклад в различение классов. Это отражают 2-параметрические диаграммы, в которых одна из переменных - зелёный цвет Green. Если вторая переменная - синий цвет Blue (фиг. 6, А), значение которого в дискриминантной модели невелико (p=0,84), то хорошо заметно перекрывание кластеров L и D. Цветовой оттенок Hue вносил больший вклад в классификацию (p=0,26) и совместно с Green давал лучшую обособленность кластеров (фиг. 6, Б). Применение обеих статистически значимых переменных Green и Red на диаграмме фиг. 6, В, позволило максимизировать дистанцию между кластерами L и D.

Модель классифицировала все организмы со спорной окраской, отнеся их с некоторой долей вероятности к одному из классов - L (13 особей) или D (6 особей). Графическое представление этой классификации - на фиг. 6, В. Фрагмент таблицы апостериорных вероятностей принадлежности организмов к классам показан на фиг. 7. Лишь одна особь из обучающей выборки была отмаркирована в таблице, как классифицированная неверно (на фиг. 6, В она обозначена стрелкой). Дискриминантная модель отнесла её к классу L, хотя по визуальным признакам она была определена в класс D. В данном случае копепода была хорошо окрашена (что отражено в её цветовых характеристиках), но отнесена исследователем к мёртвым, поскольку имела визуальные признаки разложения. Дискриминантный анализ выявил это противоречие.

Заявляемый способ обладает рядом преимуществ:

- способ позволяет избежать субъективности в классификации организмов по характеру их окрашенности, тем самым увеличивая точность и достоверность результатов;

- способ универсален, поскольку он может быть применён для решения иных исследовательских задач, в которых требуется объективная классификация организмов по степени окрашенности.

Источники информации:

1. Кастальская-Карзинкина М.А. Методика определения живых и отмерших компонентов планктона на фиксированном материале // Труды лимнологической станции в Косине. - 1935. - № 19. - С. 91 - 103.

2. Губарева Е.С., Светличный Л.С., Ишинибилир М., Бельмонте Г. Распределение живого и мёртвого мезозоопланктона в прибосфорских районах Чёрного и Мраморного морей: солёностная толерантность Acartia clausi и A. tonsa II Морской экологический журнал. - 2008. - Т. 7, № 4. - С. 27 - 39.

3. Dressel D.M., Heinle D.R., Grote М.С. Vital starting to sort dead and live copepods // Chesapeake Sci. - 1972. - V. 13. - P. 156 - 159.

Способ идентификации живых и мёртвых организмов мезозоопланктона в морских пробах, включающий отбор пробы мезозоопланктона, окрашивание организмов соответствующими красителями, визуальную оценку интенсивности окраски особей под микроскопом, отличающийся тем, что визуальную оценку интенсивности окраски особей совмещают с одновременной микрофотосъёмкой организмов, используя настройки фотокамеры в ручном режиме, сохраняя эти настройки неизменными в течение фотосъемки по крайней мере одной пробы, после чего у полученных изображений, применяя редактор растровой графики, например программный пакет Adobe Photoshop, измеряют средние для каждой особи цветовые и яркостные характеристики и относят особи к классу живых или мертвых, осуществляя дискриминантный анализ измеренных цифровых величин.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к биологии и медицине, а именно к молекулярной биологии, микробиологии и хирургии, и может быть использовано в диагностических целях для идентификации синегнойной палочки Pseudomonas aeruginosa в клиническом биоматериале.

Изобретение относится к области агропромышленных технологий и может быть использовано для анализа выноса с луговой травой биохимических веществ. Для этого проводят учет колебаний урожайности в зависимости от структуры фитоценоза в виде травяного покрова.

Изобретение относится к медицине, а именно к патологической анатомии и судебно-медицинской экспертизе, и может быть использовано для верификации смерти больного от фибрилляции желудочков при инфаркте миокарда.

Изобретение относится к области лабораторной диагностики и может быть использовано для определения присутствия патогенных микроорганизмов в биологических образцах.

Изобретение относится к медицине, в частности к области лечения гнойных ран, и описывает способ определения эффективности лечения воспалительного процесса гнойных ран под физиотерапевтическим воздействием, а именно под воздействием низкочастотной ультразвуковой кавитации.
Изобретение относится к медицине. Сущность способа ранней диагностики хронической болезни почек состоит в том, что используют диапазон доз Допамина от 1 до 3 мкг/кг массы тела и стандартную водную нагрузку в количестве 200 мл.

Изобретение относится к медицине, в частности к экспериментальной фармакологии и биофармации, и описывает способ количественного определения углеродных наноструктур, в частности наноалмазов и нанотрубок, в биологических образцах и их распределение в организме ex vivo, основанное на использовании метода масс-спектрометрии с индуктивно-связанной плазмой.
Изобретение относится к медицине, а именно к онкогематологии, и может быть использовано для прогнозирования эффективности лечения больных неходжкинскими лимфомами с поражением костного мозга.
Изобретение относится к медицине, а именно к дерматологии, и может быть использовано для дифференциальной морфометрической диагностики эритродермической формы грибовидного микоза и синдрома псевдолимфомы кожи.

Изобретение относится к биохимии и может быть использовано для управления биохимическими реакциями in vitro и in vivo. Управление осуществляется посредством воздействия на магнитную наносуспензию, содержащую биоактивную макромолекулу, прикрепленную непосредственно или через лиганд к однодоменным магнитным наночастицам, внешним низкоинтенсивным низкочастотным переменным магнитным полем, обеспечивающим деформацию и/или изменение конформации участвующих в реакции биоактивных макромолекул.

Изобретение относится к способу и системе для анализа свойств флюидов в микрофлюидном устройстве. Флюид вводится под давлением в микроканал, и в ряде мест, расположенных вдоль микроканала, оптически детектируются фазовые состояния флюида.

Изобретение относится к способам определения содержания лигнина Класона. Способ определения лигнина заключается в том, что к лигноцеллюлозному материалу добавляют водно-диоксановый раствор, полученный смешением концентрированной азотной кислоты и 1,4-диоксана в соотношении 1:4 (по объему), реакционную смесь нагревают на кипящей водяной бане в течение 15 минут, затем добавляют 2 М раствор гидроксида натрия, объем реакционной смеси доводят дистиллированной водой и фильтруют, измеряют оптическую плотность фильтрата при 440 нм, и по величине оптической плотности судят о содержании лигнина в целлюлозном полуфабрикате.
Изобретение относится к медицине, в частности к клинической биохимии, и предназначено для определения окислительной модификации белков в пуле веществ средней молекулярной массы в биологической среде при любых патологических состояниях путем биохимического исследования.

Группа изобретений относится к горному делу, в частности к геофизическим исследованиям скважин, и может быть использовано для осмотра скважин при проведении ремонтных работ.

Изобретение относится к контролю формы, которая имеет пористый слой оксида алюминия на своей поверхности с множеством мельчайших углублений. Способ включает этап обеспечения на основании зависимости между первым параметром, который является показателем толщины пористого слоя оксида алюминия, и цветовым параметром, который является показателем цвета света, отраженного от пористого слоя оксида алюминия, первой цветовой информации, которая представляет допуск на первый параметр пористого слоя оксида алюминия, который имеет неровную структуру, которая находится в пределах допуска, этап обеспечения формы, которая является объектом контроля, при этом форма имеет пористый слой оксида алюминия на своей поверхности; этап получения цветового параметра, который является показателем цвета света, отраженного от пористого слоя оксида алюминия формы-объекта контроля, и этап определения пригодности первого параметра формы-объекта контроля на основании полученного цветового параметра и первой цветовой информации.
Изобретение относится к аналитической химии, а именно к фотометрическим способам определения редкоземельных элементов в природных объектах и технических материалах.

Настоящее изобретение относится к сенсорике катионов металлов с использованием фотохромных соединений в жидких средах для мониторинга окружающей среды и биологических объектов.

Изобретение относится к области оптического приборостроения и касается спектрометра на основе поверхностного плазмонного резонанса. Спектрометр содержит последовательно расположенные на одной оптической оси источник излучения света с непрерывным спектром, коллиматор, поляризатор, цилиндрическую линзу или цилиндрическое зеркало, устройство нарушенного полного внутреннего отражения с отражающим элементом, диспергирующее устройство, фокусирующий объектив и светочувствительную фотоматрицу, установленную в фокусе объектива.

Изобретение относится к аналитической химии, в частности к способам определения концентрации примесей в питьевой воде. Способ включает обработку проб воды раствором йодида калия, поочередное измерение оптической плотности проб диоксида хлора при pH 7 и хлорит-иона и диоксида хлора при pH 2,5, определение из градуировочных графиков концентрации диоксида хлора при pH 7 и суммарной концентрации хлорит-иона и диоксида хлора при pH 2,5, расчет концентрации хлорит-иона по формуле: ( C 2 16,86 − C 1 67,46 ) × 16,86 , где C1 - концентрация диоксида хлора при pH 7, мг/дм3; C2 - суммарная концентрация диоксида хлора и хлорит-иона при pH 2,5, мг/дм3; 67,46 - окислительный эквивалент диоксида хлора, соответствующий pH 7; 16,86 - окислительный эквивалент хлорит-иона, соответствующий pH 2,5.

Изобретение относится к области пищевой промышленности, в частности к способу и устройству определения зрелости икры. Икру (W) погружают на загрузочный лоток (6), направляют свет от светового излучателя (11) на икру (W) и изображение, по меньшей мере, части икры (W) в состоянии облучения светом от светового излучателя (11) икры (W) снимают с помощью устройства для съемки изображений (12).

Изобретение относится к области фотометрии и касается пламенного фотометра. Фотометр включает горелку, оснащенную устройством впрыска раствора исследуемого вещества.
Наверх