Экспресс-способ определения атерогенности иммунных комплексов сыворотки крови человека


 


Владельцы патента RU 2549466:

Федеральное государственное бюджетное учреждение "НИИ общей патологии и патофизиологии" РАМН (RU)

Изобретение относится к клинической иммунологии и может быть использовано для экспресс-определения атерогенности иммунных комплексов (ИК) сыворотки крови человека. Сущность изобретения состоит в том, что в предлагаемом способе преципитат ИК из сыворотки крови человека готовят путем обработки буфером, содержащим 10% раствор полиэтиленгликоля с молекулярной массой 3350 (ПЭГ-3350), в соотношении 1:3,5, инкубируют в течение 10 мин при комнатной температуре. Агрегаты ИК осаждают центрифугированием, растворяют в буфере без ПЭГ-3350, определяют содержание холестерина в иммунных комплексах (ХИК) и степень связывания комплемента (ССК) морской свинки преципитированными иммунными комплексами. Рассчитывают атерогенность ИК как отношение ССК к ХИК и при величине менее 4 ЕД констатируют повышенную атерогенность крови. ! табл.

 

Изобретение относится к клинической иммунологии и может быть использовано для определения атерогенности иммунных комплексов, содержащих множественно модифицированные липопротеины низкой плотности (ИК-ммЛПНП) в сыворотке крови человека.

В настоящее время в клинической лабораторной практике отсутствуют доступные для рутинных исследований методы определения атерогенности ИК-ммЛПНП. Учитывая важную патогенетическую роль иммунных комплексов, содержащих множественно модифицированные липопротеины низкой плотности, при атеросклерозе, остается актуальной разработка простых, доступных для лабораторных исследований способов определения атерогенности ИК-ммЛПНП [1, 3, 4].

Известен способ определения атерогенности сыворотки крови по ее способности вызывать накопление холестерина в культивируемых клетках [5]. Недостатком этого способа являются трудоемкость, высокая себестоимость, сложность и длительность проведения исследования.

В качестве прототипа использован способ оценки атерогенности иммунных комплексов, содержащих множественно модифицированные липопротены низкой плотности [2].

В прототипе преципитат иммунных комплексов, содержащих множественно модифицированные липопротеины низкой плотности, из сыворотки крови человека готовят путем обработки буфером, содержащим 8,3% ПЭГ 3350 и 3,3% ПВП 12600, в соотношении 1:1,2, инкубируют в течение 10 мин при комнатной температуре. Преципитат, содержащий ИК-ммЛПНП, отделяют центрифугированием при 3100g в течение 10 мин при 23°С, растворяют в буфере без ПЭГ и ПВП, определяют содержание холестерина в иммунных комплексах (ХИК) с использованием ферментативного набора, степень связывания комплемента (ССК) морской свинки, рассчитывают атерогенность иммунных комплексов, содержащих ммЛПНП, как отношение ССК к ХИК.

Задачей настоящего изобретения является разработка способа экспресс-определения атерогенности иммунных комплексов сыворотки крови человека для рутинных исследований с высокой точностью и с минимальной затратой времени.

Эта задача решается тем, что специфическую преципитацию циркулирующих иммунных комплексов сыворотки, содержащих ммЛПНП, проводят путем обработки сыворотки буферным раствором, содержащим препарат ПЭГ-3350, инкубируют в течение 10 минут при комнатной температуре, затем образовавшиеся агрегаты иммунных комплексов осаждают центрифугированием, декантируют, полученный преципитат ИК растворяют в буфере без ПЭГ-3350, определяют содержание холестерина в преципитированных иммунных комплексах (ХИК) с использованием коммерческого набора «Холестерин» и степень связывания комплемента морской свинки, после чего рассчитывают атерогенность ИК как отношение ССК к ХИК. При величине этого показателя ниже 4 ЕД констатируют повышенную атерогенность ИК-ммЛПНП.

Способ определения атерогенности ИК-ммЛПНП включает:

1. Буфер-1 для преципитации ИК содержит 10% полиэтиленгликоль с молекулярной массой 3350 («Sigma», США) в 0,01 М трис-HCl-буфере с рН 7,4, содержащем 0,15М NaCl;

2. Буфер-2 для растворения преципитата ИК, представляет собой 0,01М Трис-HCl-буфер, рН 7,4, содержащий 0,15 M NaCl.

Способ экспресс-определения атерогенности ИК сыворотки крови осуществляют следующим образом. Проводят забор крови натощак из локтевой вены человека, отделяют сыворотку и определяют уровень холестерина и степень связывания комплемента морской свинки в ПЭГ-преципитатах путем обработки сыворотки крови Буфером-1 в соотношении 1:3,5 для преципитации ИК, инкубацией в течение 10 мин при комнатной температуре, осаждением преципитата центрифугированием, декантацией и последующим растворением его в исходном объеме в Буфере-2. Холестерин в ИК определяют с использованием коммерческого набора «Холестерин». Комплемент-связывающую способность иммунных комплексов, содержащих множественно модифицированные ЛПНП, исследуют с помощью гемолитического теста с использованием комплемента морской свинки, стандартизованных (1,5×108 кл/мл) эритроцитов барана, сенсибилизированных кроличьими антителами (ЕА), в вероналовом солевом буфере, содержащем 0,5 мМ MgCl2 и 0,15 мМ CaCl2 (VBS2+).

Рассчитывают атерогенность ИК в ЕД как отношение ССК к холестерину в преципитированных иммунных комплексах (ХИК). При величине ССК/ХИК менее 4 ЕД констатируют повышенную атерогенность иммунных комплексов сыворотки крови человека.

Этап 1. Определение содержания холестерина в иммунных комплексах в сыворотке крови доноров и больных с атеросклерозом коронарных артерий. Приготовление преципитата иммунных комплексов из сыворотки: к 50 мкл сыворотки крови добавляют 125 мкл буфера-1 и инкубируют 10 мин при комнатной температуре. Образовавшиеся агрегаты иммунных комплексов осаждают центрифугированием при 3000 g в течение 10 мин при 23°С. Супернатант тщательно декантируют и осадок растворяют в 50 мкл буфера-2. Содержание холестерина определяют с использованием коммерческого набора «Холестерин» фирмы «ЗАО Эколаб» (Россия). Полученные результаты представлены в таблице.

Этап 2. Определение степени связывания комплемента морской свинки иммунными комплексами, содержащими ммЛПНП. К 10 мкл растворов преципитатов, разбавленных 1:99 буфером VBS2+, добавляют 12 мкл разбавленного 1:19 раствора комплемента морской свинки. Общий объем доводят до 0,3 мл буфером VBS2+ и инкубируют 20 мин при 37°С. После инкубации добавляют 200 мкл ЕА и повторно инкубируют 30 мин при 37°С. После инкубации реакцию останавливают добавлением 2,5 мл холодного раствора 0,15М NaCl, центрифугируют и определяют величину лизиса эритроцитов по выходу гемоглобина в супернатант. Контрольная проба не содержит преципитата иммунных комплексов. Пониженный гемолиз в опытных пробах по сравнению с контролем свидетельствует о наличии связывания комплемента. Степень лизиса эритроцитов (У) определяют по формуле;

У(%)=[(Х-R)/(Н-R)×100],

где H, R и Х - величины оптической плотности А405 в гемолитических системах контрольной пробы, в контроле спонтанного лизиса ЕА и в опытной пробе соответственно. Степень связывания комплемента (ССК) определяют по формуле:

ССК(%)=100-У.

Полученные результаты представлены в таблице.

Этап 3. Определение атерогенности иммунных комплексов, содержащих ммЛПНП (АИК-ммЛПНП). АИК-ммЛПНП рассчитывают в сыворотке крови обследуемых индивидуумов как отношение степени связывания комплемента к холестерину преципитированных иммунных комплексов, содержащих ммЛПНП (ХИК). Полученные данные представлены в таблице.

Как видно из данных, представленных в таблице, содержание ХИК в сыворотке крови здоровых доноров в 100% случаев было ниже 10 мг/дл (разброс от 2,3 до 9,2 мг/дл), в то время как ХИК в сыворотке крови кардиологических больных, с инструментально подтвержденным атеросклерозом коронарных артерий, был в среднем в 4,7 раза выше нормальных величин и варьировал от 13,8 до 67,5 мг/дл. Степень связывания комплемента морской свинки ПЭГ-преципитатом в группе здоровых доноров была значительно выше, чем в группе больных (в среднем 62% и 47%, соответственно).

Полученные результаты по оценке атерогенности иммунных комплексов свидетельствуют однозначно о том, что иммунные комплексы больных с атеросклерозом коронарных артерий обладают сниженной комплемент-активирующей способностью, в данном случае гетерогенного комплемента морской свинки. И как следствие - повышенный уровень иммунных комплексов, содержащих ммЛПНП, в крови у больных с атеросклерозом каротидных артерий из-за нарушения их солюбилизации и элиминации с участием аутологичной системы комплемента. Сниженная комплемент-активирующая способность иммуноглобулинов в иммунных комплексах больных с атеросклерозом также приводит к незавершенному фагоцитозу и, как следствие, - образованию «пенистых» клеток при данной патологии.

Таким образом, предлагаемый способ позволяет проводить функциональную оценку атерогенности иммунных комплексов с минимальной затратой времени и средств, а также проводить широкие скрининговые обследования, диагностировать атеросклероз на доклинической стадии, прогнозировать течение атеросклеротического процесса у больных в динамике. Выявление повышенного уровня ХИК при широких скрининговых обследованиях может быть предиктором атеросклероза на доклинической стадии. Доступность реагентов и простота способа определения ХИК в лабораторной практике позволяет проводить углубленное исследование патогенеза атеросклеротических заболеваний. С другой стороны, внедрение способа определения атерогенности иммунных комплексов, содержащих ммЛПНП, в лабораторную практику позволит разрабатывать новые методы терапии атеросклероза и контролировать эффективность проводимого лечения.

Литература

1. Собенин И.А., Карагодин В.П., Мельниченко А.А., Орехов А.Н. Холестерин иммунных комплексов как индикатор атеросклероза // Патологическая физиология и экспериментальная терапия. - 2012. - №3. - С.99-103;

2. Шойбонов Б.Б., Кравченко М.А., Шабалина А.А., Костырева М.В., Баронец В.Ю., Панченко Л.Ф. Оценка атерогенности иммунных комплексов, содержащих множественно модифицированные липопротеины низкой плотности // Материалы Всероссийской научно-практической конференции «Неинфекционные заболевания и здоровье населения России» 16-17 мая 2013 г. Москва. Тез. Докладов. / /Профилактическая медицина. - 2013. - Т.16, №2 (выпуск 2). - С.150.

3. Burut D.F.P., Karim Y., Ferns G.A.A. The Role of Immune Complexes in Atherosclerosis // Angiology. - 2010. - V.61, №7. - P.679-689].

4. Lopes-Virella M.F., Brent McHenry M., Lipsitz S., et al. Immune complexes containing modified lipoproteins are related to the progression of internal carotid intima-media thickness in patients with type 1 diabetes // Atherosclerosis. - 2007. - V.190. - P.359-369.

5. Tertov V.V., Orekhov A.N., Nikitina N.A. et al. Peritoneal macrophages: a model for detecting atherogenic potential in pattens′ blood serum // Ann. Med. - 1989. - V.21(6). - P.455-459

Таблица
Содержание холестерина иммунных комплексов (ХИК), степень связывания комплемента (ССК) и атерогенность иммунных комплексов, содержащих ммЛПНП (АИК-ммЛПНП) в ПЭГ-преципитатах сывороток крови доноров и кардиологических больных
Доноры ХИК, мг/дл ССК, % АИК-ммЛПНП Больные ХИК, мг/дл ССК, % АИК-ммЛПНП
1 5,2 56 108 1 16,6 43 2,6
2 6,4 70 109 2 15,6 52 3,3
3 2,3 27 117 3 33,4 74 2,2
4 4,5 80 178 4 13,8 18 3,5
5 9,2 78 85 5 44,5 8 0,2
6 5,0 41 82 6 67,5 22 0,3
7 5,3 53 100 7 34,2 19 0,6
8 5,7 82 144 8 17,5 45 2,6
9 6,8 73 107 9 27,7 89 3,2
10 7,8 69 89 10 24,9 78 3,1
11 8,4 49 58 11 18,6 74 4,0
M±m 6,1±2,0 62±18 107±32 M±m 28,6±16,1 47±28 2,3±1,4

Экспресс-способ определения атерогенности иммунных комплексов (ИК) сыворотки крови человека путем обработки ее в течение 10 мин буфером, содержащим полиэтиленгликоль (ПЭГ), осаждением ИК центрифугированием, определением холестерина в иммунных комплексах (ХИК) и степени связывания комплемента (ССК), отличающийся тем, что обработку сыворотки ведут 10% раствором ПЭГ-3350 в 0,01М Трис-HCl-буфере, pH 7,4, содержащем 0,15М NaCl, при объемном соотношении сыворотка: ПЭГ-3350 (1:3,5), рассчитывают атерогенность ИК как отношение ССК к ХИК и при величине менее 4 ЕД констатируют повышенную атерогенность крови.



 

Похожие патенты:
Изобретение относится к медицине, а именно к кардиологии, и может быть использовано в лечебных учреждениях для оценки риска метаболического синдрома (МС). Определяют диагностические показатели клинико-лабораторными и функциональным методами с последующим расчетом прогностического индекса.

Изобретение относится к области медицины, а именно к способу прогнозирования течения ишемической болезни сердца. Сущность способа состоит в том, что до и после лечения одновременно определяют в сыворотке крови аполипопротеин А-1 (Апо А-1), общий холестерин и модифицированные липопротеины ЛП(а) с помощью дополнительной обработки 0,5 мл сыворотки крови 0,1 мл 0,1% раствором Тритона Х-100, которую инкубируют 15 мин при 20°С, перемешивают смесь методом встряхивания 120 раз в 1 мин, инкубируют с раствором Судана Б в течение 1 ч в темном термостате при 40°С и затем вносят пробу в лунку в геле агарозы с площадью основания 4×20 мм для электрофореза с последующей фиксацией электрофореграмм, их высушиванием, денситометрией.
Изобретение относится к области медицины, в частности к прогнозированию риска раннего развития атеросклероза у больных хроническим простатитом. Сущность способа состоит в том, что в сыворотке крови больных хроническим простатитом молодой возрастной группы определяют уровень общего тестостерона, секссвязывающего глобулина с последующим расчетом индекса свободного тестостерона, а также определяют содержание липопротеидов высокой плотности, триацилглицеридов и рассчитывают коэффициент атерогенного риска по формуле.
Изобретение относится к клинической биохимии, и может быть использовано в лабораторной диагностике для определения атерогенности крови по уровню содержания минимально модифицированных липопротеинов низкой плотности (ММ-ЛПНП) в сыворотке или плазме крови человека.
Настоящее изобретение относится к клинической биохимии и описывает способ определения модифицированных липопротеинов низкой плотности (мЛПНП) в сыворотке (плазме) крови человека путем обработки буфером, содержащим поливинилпирролидон (ПВП) с последующей турбидиметрической регистрацией смеси, где обработку сыворотки или плазмы крови человека ведут 10% раствором ПВП-35000±5000 в 0,01 М Трис-HCl-буфере, рН 7,4, содержащем 0,15 М NaCl, при объемном соотношении сыворотка(плазма) : ПВП от (1:2) до (1:10), инкубируют 10 мин при комнатной температуре, измеряют светопоглощение в опытной и контрольной пробах, вычисляют разность между ними и при величине разности более 15 Е констатируют повышенный уровень атерогенных мЛПНП в крови и наличие атеросклеротического процесса у обследуемого человека.

Изобретение относится к области медицины, а именно к способу скрининговой диагностики инсулинорезистентности. Способ основан на определении биохимических показателей сыворотки венозной крови, в которой ферментативным методом определяют показатели липидного спектра и глюкозы.

Изобретение относится к медицине и может быть использовано в кардиологии, терапии. .
Изобретение относится к медицине, а именно к дерматовенерологии, и касается способа определения резистентности больных распространенными хроническими дерматозами (псориазом, атопическим дерматитом, вульгарной или акантолитической пузырчаткой) к проводимой терапии.
Изобретение относится к клинической биохимии, и может быть использовано в лабораторной диагностике для определения атерогенности крови по уровню содержания минимально модифицированных липопротеинов низкой плотности (ММ-ЛПНП) в сыворотке или плазме крови человека.
Настоящее изобретение относится к клинической биохимии и описывает способ определения модифицированных липопротеинов низкой плотности (мЛПНП) в сыворотке (плазме) крови человека путем обработки буфером, содержащим поливинилпирролидон (ПВП) с последующей турбидиметрической регистрацией смеси, где обработку сыворотки или плазмы крови человека ведут 10% раствором ПВП-35000±5000 в 0,01 М Трис-HCl-буфере, рН 7,4, содержащем 0,15 М NaCl, при объемном соотношении сыворотка(плазма) : ПВП от (1:2) до (1:10), инкубируют 10 мин при комнатной температуре, измеряют светопоглощение в опытной и контрольной пробах, вычисляют разность между ними и при величине разности более 15 Е констатируют повышенный уровень атерогенных мЛПНП в крови и наличие атеросклеротического процесса у обследуемого человека.
Изобретение относится к клинической биохимии и может быть использовано для экспресс-определения атерогенности плазмы крови человека. .
Изобретение относится к медицине, а именно к способу оценки устойчивости мембран эритроцитов к ишемии. Сущность способа состоит в том, что определяют: СОЭ, фибриноген, общий билирубин, простациклин, агрегацию эритроцитов, вязкость крови в сосудах микроциркуляции, мочевину, адгезию тромбоцитов, плазминоген и нитриты.
Изобретение относится к медицине и представляет собой способ прогнозирования развития полипозного риносинусита у больных бронхиальной астмой, который осуществляется путем определения в крови пациентов показателей эндотоксикоза: лейкоцитов, молекул средней массы, креатинина, мочевины и скорости оседания эритроцитов; прогноз осуществляют с помощью дискриминантного уравнения: D=6,900×лейкоциты(×10^9/л)+2,640×скорость оседания эритроцитов (мм/ч)+17,819×молекулы средней массы (ед.
Изобретение относится к медицине, а именно к гепатологии, и может быть использовано для определения прогноза эффективности комбинированной противовирусной терапии (ПВТ) хронического вирусного гепатита С (ХГС).
Изобретение относится к медицине, в частности к гематологии, и описывает способ повышения проницаемости мембраны клеток крови для депонирования ими лекарственных средств, включающий добавление к клеточной массе, полученной путем центрифугирования крови, лекарственных препаратов и последующее проведение фотогемотерапии, причем в качестве «контейнеров» для лекарственного вещества используют отмытые в физиологическом растворе эритроциты, выделенные из клеточной массы после удаления тромбоцитарно-лейкоцитарной пленки, образовавшейся в процессе центрифугирования, помещают их в среду с лекарственным веществом и воздействуют на эритроциты ультрафиолетовым облучением (УФО) с длиной волны 360 нм и общей дозой облучения 0,72 Дж/см2.
Изобретение относится к области медицины, а именно к исследованиям нейтрофилов крови при действии факторов различной природы, и может быть использовано для оценки влияния света, генерируемого светодиодными источниками освещения, на клеточные факторы врожденного иммунитета.

Изобретение относится к области медицины и может быть использовано в медицинской диагностике и терапии. Способ определения физико-биологических параметров кожи и концентраций производных гемоглобина в крови путем посылки на кожу поляризованного оптического излучения с известным спектром, регистрации сигналов диффузно-отраженного кожей света с поляризацией, ортогональной поляризации посылаемого на кожу излучения.

Изобретение относится к медицине и может быть применено в практическом здравоохранении для повышения точности диагностики и снижения риска тромботических, геморрагических и тромбоэмболических осложнений.
Наверх