Способ очистки рекомбинантного белка интерфероноподобного фактора iii типа



Способ очистки рекомбинантного белка интерфероноподобного фактора iii типа
Способ очистки рекомбинантного белка интерфероноподобного фактора iii типа
Способ очистки рекомбинантного белка интерфероноподобного фактора iii типа

 

C07K1/02 - Пептиды (пептиды в пищевых составах A23, например получение белковых композиций для пищевых составов A23J, препараты для медицинских целей A61K; пептиды, содержащие бета-лактамовые кольца, C07D; циклические дипептиды, не содержащие в молекуле любого другого пептидного звена, кроме образующего их кольцо, например пиперазин-2,5-дионы, C07D; алкалоиды спорыньи циклического пептидного типа C07D519/02; высокомолекулярные соединения, содержащие статистически распределенные аминокислотные единицы в молекулах, т.е. при получении предусматривается не специфическая, а случайная последовательность аминокислотных единиц, гомополиамиды и блоксополиамиды, полученные из аминокислот, C08G 69/00; высокомолекулярные продукты, полученные из протеинов, C08H 1/00; получение

Владельцы патента RU 2549710:

Федеральное государственное бюджетное учреждение "Государственный научный центр "Институт иммунологии" Федерального медико-биологического агентства (ФГБУ "ГНЦ Институт иммунологии" ФМБА России) (RU)

Изобретение относится к области биотехнологии. Предложен способ получения рекомбинантного белка интерфероноподобного фактора III типа (ИПФ III) штамма-продуцента E. coli. Осуществляют отмывку и растворение тел включения E. coli с использованием 2% водного раствора γ-циклодекстрина. Далее последовательно проводят хроматографии на Ni-Sepharose, Q-Sepharose и SP-Sepharose. Далее осуществляют рефолдинг целевого белка с использованием смеси цистеамина и цистамина при рН 10,5. Затем последовательно проводят хроматографии на Amberchrome Profile ХТ20, Amberchrome Profile HPR10 и Kromasil 300-5С18. Изобретение позволяет оптимизировать условия очистки ИПФ III на этапах отмывки и растворения тел включения клеток E.coli и обеспечивает 12% выход целевого белка.3 ил., 4 пр.

 

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к технологии получения рекомбинантного белка интерфероноподобного фактора III типа (далее - ИПФ III), в частности к способу его очистки.

Известны способы очистки рекомбинантных интерферонов (далее - ИФН), основанные на выделении тел включения, их отмывки и рефолдинга целевого белка с последующими хроматографиями.

Известен способ получения рекомбинантного интерлейкина 29 (IL-29) в нерастворимой форме - в виде тел включения (патент US №7910313, 22.03.2011).

По сравнению с растворимой формой экспрессия белка в виде тел включения имеет ряд преимуществ: нерастворимые агрегаты белка не проявляют токсического действия, практически не атакуются протеазами, с высоким выходом выделяются центрифугированием. В то же время существуют проблемы низкого выхода активного, корректно сложенного белка после проведения рефолдинга и очистки IL-29, что определяется пространственной структурой последнего.

Известен способ очистки интерлейкина IL-29 и использованием детергента додецилсульфат натрия при его получении в нерастворимой форме (патент LIS №7485700, 03.02.2009). Однако при относительно низкой токсичности этого препарата использование додецилсульфата натрия в технологическом процессе сопряжено с целым рядом препятствий: это соединение вызывает значительную денатурацию целевого белка, его не удается удалить из раствора, что в свою очередь делает невозможной последующую ионообменную хроматографию, необходимую для дальнейшего процесса очистки IL-29.

Известен также способ очистки ИФН, позволяющий избежать указанных недостатков применением в качестве детергента γ-циклодекстрина, который не обладает денатурирующими свойствами, не образует ионных связей, является pH-независимым, может быть удален из раствора, делает возможной ионообменную хроматографию.

Наиболее близким, выбранным в качестве ближайшего аналога, к заявляемому является способ очистки интерлейкина IL-29 из тел включения с использованием аффинной хроматографии, катионно-обменной хроматографии и гельфильтрации (патент US №7968315, 28.06.2011).

Однако в этом способе не учитывается возможность использования обращенно-фазовой хроматографии для разделения изомеров с различной пространственной структурой и не охарактеризованы связанные с этим особенности его очистки.

Предлагаемое изобретение решает задачу оптимизации условий очистки ИПФ III на этапах отмывки и растворения тел включения, например, клеток E. coli BL(21)IPF3(7), продуцирующих рекомбинантный белок ИПФ III, в ходе технологического процесса рефолдинга целевого белка и очистки методами высокочувствительной белковой хроматографии (FPLC -Fast protein liquid chromatography) и высокоэффективной жидкостной хроматографии (HPLC-High performance liquid chromatography).

Заявляемый способ очистки рекомбинантного белка интерфероноподобного фактора III типа включает отмывку тел включения штамма-продуцента E. coli, происходящую в присутствии 2% водного раствора основного детергента γ-циклодекстрина, растворение тел включения в присутствии 2% водного раствора γ-циклодекстрина, 0,1 М сульфита калия и 0,01М тетратионата натрия, проведение металл-афинной хроматографии на Ni-Sepharose с элюцией линейным градиентом со стартовым буфером 2% γ-циклодекстрин, 6 М мочевина, 20 мМ Tris-HCl с pH 8.0, 10 мМ имидазол, и финальным буфером 2% γ-циклодекстрин, 6 М мочевина, 20 мМ Tris-HCl с pH 8.0, 400 мМ имидазол, с выходом целевого белка в диапазоне концентраций имидазола от 75 до 125 мМ, проведение диализа фракций, содержащих целевой белок против 6 М мочевины, 20 мМ Tris-HCl pH 8.0 и 2% γ-циклодекстрина, проведение анион-обменной хроматографии на Q-Sepharose с элюцией линейным градиентом, при этом стартовым буфером является 6 М мочевина, 20 мМ Tris-HCl с pH 8.0, 10 мМ NaCl, 2% γ-циклодекстрии, а финальным буфером является 6М мочевина, 20 мМ Tris-HCl с pH 8.0, 300 мМ NaCl, 2% γ-циклодекстрин, с выходом целевого белка в диапазоне концентраций NaCl от 115 до 125 мМ, проведение диализа фракций, содержащих целевой белок против 6М мочевины, 20 мМ Tris-HCl pH 8.0 и 2% γ-циклодекстрина, проведение катион-обменной хроматографии на SP- Sepharose с элюцией линейным градиентом со стартовым буфером 6М мочевина, 20 мМ Tris-HCl с pH 8.0, 10 мМ NaCl, 2% γ-циклодекстрин, и финальным буфером 6 М мочевина, 20 мМ Tris-HCl с pH 8.0, 300 мМ NaCl, 2% γ-циклодекстрин, с выходом целевого белка в диапазоне концентраций NaCl от 110 до 130 мМ, рефолдинга целевого белка при pH 10,5 добавлением смеси цистеамина и цистамина до конечных концентраций 1 мМ и 0,1 мМ, последующее проведение обращение - фазовой хроматографии на колонках Amberchrome Profile XT20 при pH 10,5 с элюцией линейным градиентом со стартовым буфером 10 мМ NaCl, 2% ацетонитрил, pH 10,5, и финальным буфером 10 мМ NaCl, 80% ацетонитрил, pH 10,5, с выходом целевого белка при концентрации ацетонитрила 54%, проведение диализа фракций, содержащих целевой белок против раствора 10 мМ NaCl, pH 10,5, проведение хроматографии на Amberchrome Profile HPR10 при pH 10,5 с элюцией линейным градиентом, при этом стартовым буфером является 10 мМ NaCl, 2% ацетонитрил, pH 10,5, а финальным буфером является 10 мМ NaCl, 80% ацетонитрил, pH 10,5, с выходом целевого белка при концентрации ацетонитрила 58%, проведение диализа фракций, содержащих целевой белок против раствора 100 мМ NaCl, добавление трифторуксусной кислоты до 0,1% и pH 1,0, проведение хроматографии на Kromasil 300-5C18 при pH 1,0 с элюцией линейным градиентом со стартовым буфером 0,1% трифторуксусная кислота, 2% ацетонитрил, и финальным буфером 0,1% трифторуксусная кислота, 80% ацетонитрил, с выходом целевого белка при концентрации ацетонитрила 35%.

Заявляемое изобретение поясняется рисунками. На рисунке 1 представлено изменение оптической плотности OD (585) суспензии тел включения в 6М мочевине с 20 mM TrisHCl pH 8.0 в зависимости от повышения концентрации γ-циклодекстрина, на рисунке 2 - хроматографический профиль элюции рефолдированного рекомбинантного белка ИПФ III с аналитической колонки Kromasil 300-5C18, на рисунке 3 - электрофорез рефолдированного рекомбинантного белка ИПФ III после проведения всех этапов HPLC-хроматографической очистки, в котором трек 1 - стандарты молекулярных весов, трек 2 - рекомбинантный белок ИПФ III.

Заявляемый способ очистки рекомбинантного белка интерфероноподобного фактора III типа из тел включения Е. coli штамма-продуцента BL(21)IPF3(7) включает растворение и отмывку тел включения в растворе, содержащем 6 М мочевину, 20 мМ Tris HCl pH 8.0 и 2% γ-циклодекстрина с последующим удалением нерастворившегося материала центрифугированием, окисление целевого белка в растворе, содержащем 6 М мочевину, 20 мМ Tris HCl pH 8.0 и 2% γ-циклодекстрин с добавлением 0,1 М сульфита калия и 0,01 М тетратионата натрия, инкубацию 24 часа при температуре 20 C, разбавление смеси в пять раз, нанесение на колонку с Ni-Sepharose, уравновешенную раствором, содержащим 2% γ-циклодекстрин, 6 М мочевина, 20 мМ Tris-HCl pH 8,0, промывку раствором, содержащим 2% γ-циклодекстрин, 6 М мочевина, 20 мМ Tris-HCl pH 8,0, 0,005М NaCl, элюцию линейным градиентом со стартовым буфером 2% γ-циклодекстрин, 6 М мочевина, 20 мМ Tris-HCl с pH 8.0, 10 мМ имидазол, финальным буфером 2% γ-циклодекстрин, 6 М мочевина, 20 мМ Tris-HCl с pH 8.0, 400 мМ имидазол, с выходом целевого белка в диапазоне концентраций имидазола от 75 до 125 мМ, диализ фракций, содержащих целевой белок против 6 М мочевины, 20 мМ Tris-HCl pH 8.0 и 2% γ-циклодекстрина, нанесение на колонку с Q-Sepharose, предварительно уравновешенную 20 мМ Tris-HCl с pH 8.0, элюцию линейным градиентом со стартовым буфером 6 М мочевина, 20 мМ Tris-HCl с pH 8.0, 10 мМ NaCl, 2% γ-циклодекстрин, финальным буфером 6 М мочевина, 20 мМ Tris-HCl с pH 8.0, 300 мМ NaCl, 2% γ-циклодекстрин, с выходом целевого белка в диапазоне концентраций NaCl от 115 до 125 мМ, диализ фракций, содержащих целевой белок против 6 М мочевины, 20 мМ Tris-HCl pH 8.0 и 2% γ-циклодекстрина, нанесение на колонку с SP-Sepharose, предварительно уравновешенную 20 мМ Tris-HCl с pH 8.0, 2% γ-циклодекстрин, элюцию линейным градиентом со стартовым буфером 6 М мочевина, 20 мМ Tris-HCl с pH 8.0, 10 мМ NaCl, 2% γ-циклодекстрин, финальным буфером 6 М мочевина, 20 мМ Tris-HCl с pH 8.0, 300 мМ NaCl, 2% γ-циклодекстрин, с выходом целевого белка в диапазоне концентраций NaCl от 110 до 130 мМ, доведение pH белкового раствора 1М NaOH до pH 10,5, проведение рефолдинга добавлением смеси цистеамина и цистамина до конечных концентраций 1 мМ и 0,1 мМ соответственно, инкубация 24 часа при температуре 20°C, нанесение на колонку серии Amberchrome Profile XT 20, элюцию линейным градиентом со стартовым буфером 10 мМ NaCl, 2% ацетонитрил, pH 10,5, и финальным буфером 10 мМ NaCl, 80% ацетонитрил, pH 10,5, с выходом целевого белка при концентрации ацетонитрила 54%, диализ фракций, содержащих целевой белок против раствора 10 мМ NaCl, pH 10,5, нанесение на колонку серии Amberchrome Profile HPR 10, элюция линейным градиентом со стартовым буфером 10 мМ NaCl, 2% ацетонитрил, pH 10,5, и финальным буфером 10 мМ NaCl, 80% ацетонитрил, pH 10,5, с выходом целевого белка при концентрации ацетонитрила 58%, диализ фракций, содержащих целевой белок против раствора 100 мМ NaCl, добавление трифторуксусной кислоты до 0,1% с pH 1,0, нанесение на колонку серии Kromasil 300-5С18, элюцию линейным градиентом со стартовым буфером 0,1% трифторуксусная кислота, 2% ацетонитрил, и финальным буфером 0,1% трифторуксусная кислота, 80% ацетонитрил, с выходом целевого белка при концентрации ацетонитрила 35%.

При этом стартовый буфер: 10 мМ NaCl, 2% ацетонитрил, pH 10,5 доводили 1М NaOH, финальный буфер: 10 мМ NaCl, 80% ацетонитрил, pH 10,5 доводили 1М NaOH, содержащих целевой белок против раствора 10 мМ NaCl, pH 10,5 доводили 1М NaOH, нанесение на колонку серии Amberchrome Profile HPR 10, элюция линейным градиентом стартовый буфер: 10 мМ NaCl, 2% ацетонитрил, pH 10,5 доводили 1М NaOH, финальный буфер: 10 мМ NaCl, 80% ацетонитрил, pH 10,5 доводили 1 М NaOH.

Контроль выхода и активности рекомбинантного ИПФ III после очистки показал соответствие следующим критериям: выход 12%, мультимеры по гель-фильтрации <2%, родственные белки по обращенно-фазовой хроматографии <3%, родственные белки по электрофорезу в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия (ДСН-ПААГ) <5%, белки штамма-продуцента по иммуноферментному анализу (ИФА) <5 нг/мг, удельная активность ИПФ III соответствует стандартному препарату L-29 фирмы R&D на модели MDBK/VSV. Удельная активность стандартного препарата L-29 фирмы R&D на модели MDBK/VSV составляет ED50 0,2-1 млн units/mg (известно из сети Интернет http://www.rndsystems.com/Products/1598-IL.

Сочетанное использование обращенно-фазовой хроматографии на колонках с матрицей на основе полистирола/дивинилбензола, позволяющей осуществлять процесс очистки при pH 10,5 и обращенно-фазовой хроматографии на колонках с матрицей на основе сферического силикагеля, модифицированный C18-группами, позволяющей осуществлять процесс очистки при pH 1,0. Такое сочетание обращено-фазовой хроматографии при придельных значениях pH позволяет получить гомогенный препарат с фиксированной пространственной структурой.

Таким образом, предложенный способ очистки рекомбинантного белка ИПФ III (штамма-продуцента BL(21)IPF3(7)) предусматривает оптимизацию процессов отмывания тел включения, их растворения и рефолдинга целевого белка. Очистка рекомбинантного белка ИПФ III (штамма-продуцента BL(21)IPF3(7)) ведется с использованием в качестве основного детергента γ-циклодекстрина для отмывки и растворения тел включения E. coli. Далее проводят хроматографию на Ni-Sepharose, на Q-Sepharose и на SP-Sepharose с последующим рефолдингом белка ИПФ III. Далее проводят окисление с использованием смеси цистеамин/цистамин при pH 10,5, после чего проводят хроматографию на Amberchrome Profile XT20, хроматографию Amberchrome Profile HPR10 и хроматографию на Kromasil 300-5C18. Предложенный способ очистки позволяет обеспечить 12% выход целевого белка и получить рекомбинантный белок ИПФ III с удельной активностью, соответствующей стандартному препарату L-29 фирмы R&D на модели MDBK/VSV.

Заявляемое изобретение можно пояснить следующими примерами.

Пример 1. Трансформация штамма E. coli BL21(DE3) и получение тел включения

Компетентные клетки E. coli штамма BL21(DE3) размораживали на водяной бане, вносили 1,5 мкл раствора плазмиды, нагревали до 42C в течение 2 минут, затем, добавив 1 мл питательной среды LB, инкубировали 1 час при 37C. В результате трансформации получали штамм-продуцент Bl(21)IPF3(7). Трансформант, содержащий штамм-продуцент, переносили в 200 мл среды LB с добавление антибиотика канамицина в концентрации 25 мкг/мл и выращивали 4 часа на шейкере при 37C. Далее индуцировали раствором 0,5 мМ IPTG и инкубировали на шейкере еще 2 час при 37C. За это время клетки Е. coli нарабатывают рекомбинантный белок ИПФ III в телах включения. Клетки осаждали центрифугированием при 4000g в течение 10 минут и лизировали 200 мл раствора, содержащего лизин 2 мг/мл и ДНК-азу 1000 ED/мл в течение 30 минут при 37C. Далее смесь нагревали до 45C. Тела включения осаждали центрифугированием при 8000 g в течение 120 минут.

Пример 2. Трансформация штамма E. coli BLR(DE3) и получение тел включения

Компетентные клетки E. coli штамма BLR(DE3) размораживали на водяной бане, вносили 1,5 мкл раствора плазмиды, нагревали до 42C в течение 2 минут, затем, добавив 1 мл питательной среды ЕВ, инкубировали 1 час при 37C. Трансформант, содержащий штамм-продуцент, переносили в 200 мл среды ЕВ с добавление антибиотика канамицина в концентрации 25 мкг/мл и антибиотика тетрациклина 15 мкг/мл. Культуру наращивали 4 часа на шейкере при 37C. Далее индуцировали раствором 0,5 мМ IPTG и инкубировали на шейкере еще 2 час при 37C. За это время клетки Е. coli нарабатывают рекомбинантный белок ИПФ III в телах включения. Клетки осаждали центрифугированием при 4000 g в течение 10 минут и лизировали 200 мл раствора, содержащего лизин 2 мг/мл и ДНК-азу 1000 ED/мл в течение 30 минут при 37C. Далее смесь нагревали до 45C. Тела включения осаждали центрифугированием при 8000 g в течение 120 минут.

Пример 3. Трансформация штамма E. coli Origami 2 (DE3) и получение тел включения

Компетентные клетки E. coli штамма Origami 2 (DЕ3) размораживали на водяной бане, вносили 1,5 мкл раствора плазмиды, нагревали до 42C в течение 2 минут, затем, добавив 1 мл питательной среды LB, инкубировали 1 час при 37C. Трансформант, содержащий штамм-продуцент, переносили в 200 мл среды ЕВ с добавление антибиотиков канамицина в концентрации 25 мкг/мл, тетрациклина 15 мкг/мл и стрептомицина в концентрации 50 мкг/мл. Культуру наращивали 4 часа на шейкере при 37C. Далее индуцировали раствором 0,5 мМ IPTG и инкубировали на шейкере еще 2 час при 37C. За это время клетки Е. coli нарабатывают рекомбинантный белок ИПФ III в телах включения. Клетки осаждали центрифугированием при 4000 g в течение 10 минут и лизировали 200 мл раствора, содержащего лизин 2 мг/мл и ДНК-азу 1000 ED/мл в течение 30 минут при 37C. Далее смесь нагревали до 45C. Тела включения осаждали центрифугированием при 8000g в течение 120 минут.

Пример 4. Трансформация штамма E. coli Rosetta-gami 2(DE3) и получение тел включения

Компетентные клетки E. coli штамма Rosetta-gami 2(DE3) размораживали на водяной бане, вносили 1,5 мкл раствора плазмиды, нагревали до 42C в течение 2 минут, затем, добавив 1 мл питательной среды LB, инкубировали 1 час при 37C. Трансформант, содержащий штамм-продуцент, переносили в 200 мл среды LB с добавление антибиотиков канамицина в концентрации 25 мкг/мл, тетрациклина 15 мкг/мл, хлорамфеникола в концентрации 35 мкг/мл и стрептомицина в концентрации 50 мкг/мл. Культуру наращивали 4 часа на шейкере при 37C. Далее индуцировали раствором 0,5 мМ IPTG и инкубировали на шейкере еще 2 час при 37C. За это время клетки Е. coli нарабатывают рекомбинантный белок ИПФ III в телах включения. Клетки осаждали центрифугированием при 4000 g в течение 10 минут и лизировали 200 мл раствора, содержащего лизин 2 мг/мл и ДНК-азу 1000 ED/мл в течение 30 минут при 37C. Далее смесь нагревали до 45C. Тела включения осаждали центрифугированием при 8000 g в течение 120 минут.

Для осуществления предлагаемого изобретения были проведены следующие операции.

1. Растворение тел включения Е. coli BL(21)IPF3(7) с использованием γ-циклодекстрина

Тела включения ресуспензировали в 6М мочевине с 20 мМ Tris HCl pH 8.0, измеряли оптическую плотность данной суспензии на хроматографе при 585 нм, значение оптической плотности оказалось OD (585)=0,35OЕ. Суспензию тировали 20% раствором γ-циклодекстрина, измеряя оптическую плотность. В момент снижения оптической плотности в 10 раз, т.е. до значения OD (585)=0,03OE, концентрация γ-циклодекстрина была признана достаточной. Результаты отображены на рисунке 1. Оптимальной признана концентрация γ-циклодекстрина равная 2%.

2. Контроль эффективности способа очистки и рефолдинга рекомбинантного белка ИПФ III из тел включения E. coli BL(21)IPF3(7)

Раствор белка после очистки и рефолдинга диализовали против раствора 10 мМ NaCl и 0,1% трифторуксусной кислоты. Отбирали 150 мкл раствора и наносили на колонку Kromasil 300-5С18 4,6 мм ID × 150 мм. Проводили аналитическую хроматографию. Элюировали линейным градиентом. Стартовый буфер: 0,1% трифторуксусная кислота, 2% ацетонитрил, финальный буфер: 0,1% трифторуксусная кислота, 80% ацетонитрил. Белок выше при концентрации ацетонитрила 33%. Рефолдированный рекомбинантный белок ИПФ III диализовали против раствора 100 мМ NaCl. Чистоту белка так же определяли электрофорезом в ПААГ.

3. Хроматографическая очистка рекомбинантного белка ИПФ III на обращенно-фазовых сорбентах

Хроматографию проводили на колонке Amberchrome Profile XT20 22 мм ID × 250 мм. Реакционную смесь после рефодинга наносили на хроматографическую колонку. Элюировали линейным градиентом. Стартовый буфер: 10 мМ NaCl, 2% ацетонитрил, pH 10,5(доводили 1 М NaOH), финальный буфер: 10 мМ NaCl, 80% ацетонитрил, pH 10,5(доводили 1 М NaOH). Объем градиента 400 мл. Элюат фракционировали по показаниям хроматографа, собирая отдельные пики. Целевым является пик, сходящий при концентрации ацетонитрила 54%. Объем фракций, включивших в себя указанный пик, составил 92 мл. Фракции диализовали против раствора 10 мМ NaCl, pH 10,5 (доводили 1 М NaOH) и наносили на препаративную колонку Amberchrome Profile HPR10 22 мм ID × 250 мм. На колонке Amberchrome Profile HPR10 22 мм ID × 250 мм проводили хроматографию целевого пика, сошедшего с колонки Amberchrome Profile XT 20 22 мм ID × 250 мм. Элюировали линейным градиентом. Стартовый буфер: 10 мМ NaCl, 2% ацетонитрил, pH 10,5(доводили 1М NaOH), финальный буфер: 10 мМ NaCl, 80% ацетонитрил, pH 10,5(доводили 1 М NaOH). Объем градиента 400 мл. Целевым является пик, сходящий при концентрации ацетонитрила 58%. Объем фракций, включивших в себя указанный пик, составил 63 мл. Фракции диализовали против раствора 100 мМ NaCl, далее туда была добавляли трифторуксусную кислоту до 0,1%. Затем проба наносили на колонку Kromasil 300-5C18 21,2 мм ID × 250 мм. Элюировали линейным градиентом. Стартовый буфер: 0,1% трифторуксусная кислота, 2% ацетонитрил, финальный буфер: 0,1% трифторуксусная кислота, 80% ацетонитрил. Объем градиента 500 мл. Целевым является пик, сходящий при концентрации ацетонитрила 35%. Объем фракций, включивших в себя указанный пик, составил 59 мл.

4. Окисление и рефолдинг рекомбинантного белка ИПФ III.

В растворенные тела включения Е. coli BL(21)IPF3(7) в 6 М мочевине с 20 мМ Tris HCl pH 8.0 и 2% γ-циклодекстрином добавляли 0,1 М сульфита калия и 0.01М тетратионата натрия. Инкубировали 24 часа при температуре 20C°.

Раствор рекомбинантного белка ИПФ III в 6 М мочевине, 20 мМ Tris-HCl (pH 8.0), 300 мМ NaCl, 2% γ-циклодекстрине. Данный раствор доводим 1 М NaOH до pH 10,5 и добавляем смесь цистеамина/цистамина до конечной концентрации 1 мМ/0,1 мМ соответсвенно. Инкубируем 24 часа при температуре 20C°. Реакционную смесь наносим на колонку с обращеннофазовым сорбентом серии Amberchrome Profile XT 20.

5. Хроматографическая очистка рекомбинантного белка ИПФ III на Ni-Sepharose, Q-Sepharose и SP-Sepharose в присутствии 2% γ-циклодекстрина.

Раствор окисленных тел включения разбавляли в 5 раз 2% γ-циклодекстрином, 6 М мочевиной и 20 мМ Трис HCl pH 8,0. Центрифугировали в течении 120 минут при 17000 g. Супернатант наносили на колонку с Ni-Sepharose, предварительно уравновешенную раствором: 2% γ-циклодекстрин, 6 М мочевина, 20 мМ Tris-HCl pH 8,0. Промывали раствором: 2% γ-циклодекстрин, 6 М мочевина, 20 мМ Tris-HCl pH 8,0, 0,005М NaCl, для избавления от не связавшихся с сорбентом белками. Целевой белок элюировали линейным градиентом. Стартовый буфер: 2% γ-циклодекстрин, 6 М мочевина, 20 мМ Tris-HCl (pH 8.0), 10 мМ имидазол, финальный буфер: 2% γ-циклодекстрин, 6 М мочевина, 20 мМ Tris-HCl (pH 8.0), 400 мМ имидазол. Целевой белок выходит в диапазоне концентраций имидазола от 75 до 125 мМ. Фракции, содержащие целевой белок объединили и диализовали против 6 М мочевины, 20 мМ Tris-HCl pH 8.0 и 2% γ-циклодекстрина. На колонку с Q-Sepharose., предварительно уравновешенную 20 мМ Tris-HCl (pH 8.0) наносили полученный белковый раствор. Элюировали линейным градиентом. Стартовый буфер: 6 М мочевина, 20 мМ Tris-HCl (pH 8.0), 10 мМ NaCl, 2% γ-циклодекстрин, финальный буфер: 6 М мочевина, 20 мМ Tris-HCl (pH 8.0), 300 мМ NaCl, 2% γ-циклодекстрин. Целевой белок выходит в диапазоне концентраций NaCl от 115 до 125 мМ. Фракции, содержащие рекомбинантный белок ИПФ III объединили и диализовали против 6 М мочевины, 20 мМ Tris-HCl pH 8.0 и 2% γ-циклодекстрина.

На колонку с SP-Sepharose, предварительно уравновешенную 20 мМ Tris-HCl (pH 8.0), наносили полученный белковый раствор. Элюировали линейным градиентом. Стартовый буфер: 6 М мочевина, 20 мМ Tris-HCl (pH 8.0), 10 мМ NaCl, 2% γ-циклодекстрин, финальный буфер: 6 М мочевина, 20 мМ Tris-HCl (pH 8.0), 300 мМ NaCl, 2% γ-циклодекстрин. Целевой белок выходит в диапазоне концентраций NaCl от 110 до 130 мМ.

Способ очистки рекомбинантного белка интерфероноподобного фактора III типа, включающий отмывку тел включения штамма-продуцента E. coli, происходящую в присутствии 2% водного раствора основного детергента γ-циклодекстрина, растворение тел включения в присутствии 2% водного раствора γ-циклодекстрина, 0,1 М сульфита калия и 0,01 М тетратионата натрия, проведение металл-афинной хроматографии на Ni-Sepharose с элюцией линейным градиентом со стартовым буфером: 2% γ-циклодекстрин, 6 М мочевина, 20 мМ Tris-HCl с рН 8,0, 10 мМ имидазол, и финальным буфером: 2% γ-циклодекстрин, 6 М мочевина, 20 мМ Tris-HCl с рН 8,0, 400 мМ имидазол, с выходом целевого белка в диапазоне концентраций имидазола от 75 до 125 мМ, проведение диализа фракций, содержащих целевой белок, против 6 М мочевины, 20 мМ Tris-HCl рН 8,0 и 2% γ-циклодекстрина, проведение анионобменной хроматографии на Q-Sepharose с элюцией линейным градиентом, при этом стартовым буфером является 6 М мочевина, 20 мМ Tris-HCl с рН 8,0, 10 мМ NaCl, 2% γ-циклодекстрин, а финальным буфером является 6 М мочевина, 20 мМ Tris-HCl с рН 8,0, 300 мМ NaCl, 2% γ-циклодекстрин, с выходом целевого белка в диапазоне концентраций NaCl от 115 до 125 мМ, проведение диализа фракций, содержащих целевой белок, против 6 М мочевины, 20 мМ Tris-HCl рН 8,0 и 2% γ-циклодекстрина, проведение катионобменной хроматографии на SP-Sepharose с элюцией линейным градиентом со стартовым буфером: 6 М мочевина, 20 мМ Tris-HCl с рН 8,0, 10 мМ NaCl, 2% γ-циклодекстрин, и финальным буфером: 6 М мочевина, 20 мМ Tris-HCl с рН 8,0, 300 мМ NaCl, 2% γ-циклодекстрин, с выходом целевого белка в диапазоне концентраций NaCl от 110 до 130 мМ, рефолдинга целевого белка при рН 10,5 добавлением смеси цистеамина и цистамина до конечных концентраций 1 мМ и 0,1 мМ, последующее проведение обращенно-фазовой хроматографии на колонках Amberchrome Profile ХТ20 при рН 10,5 с элюцией линейным градиентом со стартовым буфером: 10 мМ NaCl, 2% ацетонитрил, рН 10,5, и финальным буфером: 10 мМ NaCl, 80% ацетонитрил, рН 10,5, с выходом целевого белка при концентрации ацетонитрила 54%, проведение диализа фракций, содержащих целевой белок, против раствора 10 мМ NaCl, рН 10,5, проведение хроматографии на Amberchrome Profile HPR10 при рН 10,5 с элюцией линейным градиентом, при этом стартовым буфером является 10 мМ NaCl, 2% ацетонитрил, рН 10,5, а финальным буфером является 10 мМ NaCl, 80% ацетонитрил, рН 10,5, с выходом целевого белка при концентрации ацетонитрила 58%, проведение диализа фракций, содержащих целевой белок, против раствора 100 мМ NaCl, добавление трифторуксусной кислоты до 0,1% и рН 1,0, проведение хроматографии на Kromasil 300-5С18 при рН 1,0 с элюцией линейным градиентом со стартовым буфером: 0,1% трифторуксусная кислота, 2% ацетонитрил, и финальным буфером: 0,1% трифторуксусная кислота, 80% ацетонитрил, с выходом целевого белка при концентрации ацетонитрила 35%.



 

Похожие патенты:
Изобретение относится к медицине, а именно к медицинской микробиологии, и может быть использовано для культивирования дифтерийных микробов в искусственных питательных средах при бактериологической диагностике дифтерии.
Изобретение относится к биотехнологии и микробиологии. Предложен штамм микромицета Aspergillus foetidus 379-К-5-1 - продуцент комплекса пектиназ, β-глюканазы, ксиланазы, целлюлазы, хитиназы, маннаназы и протеазы для деструкции полисахаридов растительного и микробного сырья.

Группа изобретений относится к штамму Lactobacillus rhamnosus CNCM I-3690 и к молочному пищевому продукту, содержащему указанный штамм. Предложенный штамм обладает специфичными в отношении маннозы адгезионными свойствами.

Изобретения относятся к области биотехнологии. Предложены композиция и способ для контроля численности моллюсков классов Gastropoda и Bivalvia.
Группа изобретений относится к области биотехнологии. Предложены штаммы Cryptococcus flavescens 3C NRRL Y-50378 и Cryptococcus flavescens 4С NRRL Y-50379 для подавления и контроля фузариоза злаков, обладающие устойчивостью к протиоконазолу.
Изобретение относится к молочной промышленности, а именно к способу приготовления кисломолочного продукта. Для получения кисломолочного продукта обезжиренное коровье молоко после пастеризации и охлаждения заквашивают путем добавления суспензии, взятых в равных соотношениях штаммов бактерий Bacillus subtilis ТНП-3-ДЕП и Bacillus subtilis ТНП-5-ДЕП в 1%-ном растворе хлористого натрия в концентрации 5 млрд КОЕ/мл, сквашивают при температуре 38-42°C в течение 6-8 часов до кислотности 100-120°T, вымешивают в течение 30 мин, разливают и направляют на созревание.

Группа изобретений относится к биотехнологии. Предложены способ получения лизогликолипида, способ биоконверсии гликолипидов и способ получения пищевого продукта.
Изобретение относится к области биотехнологии и медицины и касается фармацевтической композиции. Представленная композиция содержит рекомбинантный лизоцим бактериофага FMV Р.

Изобретение относится к микробиологии и может быть использовано для количественной оценки способности микроорганизмов к биопленкообразованию на различных биотических и абиотических поверхностях.

Изобретение относится к области медицины, фтизиатрии и медицинской микробиологии и касается способа генотипирования штаммов Mycobacterium tuberculosis. Охарактеризованный способ основан на однонуклеотидном полиморфизме генов систем токсин-антитоксин II типа суперсемейств VapBC, HigAB и MazEF и характеризуется тем, что для идентификации проводят амплификацию с геномной ДНК с использованием набора олигонуклеотидных праймеров для 10 генов систем токсин-анатоксин.

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к выделенному полипептиду, его применению и фармацевтической композиции на основе данного выделенного полипептида.

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к получению тимус-специфических белков, и может быть использовано в медицине. .

Изобретение относится к области генной и белковой инженерии и может быть использовано в медико-биологической промышленности. .

Изобретение относится к биотехнологии, конкретно к получению белков-цитокинов, и может быть использовано в области клеточных технологий. .

Изобретение относится к области медицины и касается иммунотерапии против ангиогенеза. .

Изобретение относится к генной инженерии и может использоваться для лечения вирусных инфекций. .

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для получения Zalpha11 лиганда и антител к нему. .

Изобретение относится к биотехнологии и предоставляет собой способ получения полезных метаболитов с использованием бактерии семейства Enterobacteriaceae, в частности бактерии, принадлежащей к роду Escherichia, которая модифицирована таким образом, что она содержит генетическую экспрессионную систему, включающую транскрипционный аппарат, регулируемый белком типа LysR, и модифицированную таким образом, что самоиндуцируемая положительная регуляция по типу обратной связи указанной системы опосредована коиндуктором.
Наверх