Сульфатированные гиалуроновые кислоты в качестве регуляторов цитокиновой активности

Настоящее изобретение относится к новому и неожиданному применению сульфатированной гиалуроновой кислоты в качестве регулятора цитокиновой активности для предупреждения и/или лечения астмы и дегенеративного суставного остеоартроза, связанных с активацией IL-1, IL-2, IL-6, IL-7, IL-8 и IL-12, указанная сульфатированная гиалуроновая кислота приготовлена начиная с гиалуроновой кислоты, имеющей молекулярный вес от 10000 до 50000 Да, от 150000 до 250000 Да и от 500000 до 750000 Да, где сульфатированная гиалуроновая кислота имеет степень сульфатирования, равную 1 или 3. Изобретение обеспечивает расширение арсенала средств для предупреждения и/или лечения астмы и дегенеративного суставного остеоартроза. 2 з.п. ф-лы, 25 пр., 4 табл., 12 ил.

 

Область техники, к которой относится изобретение

На протяжении многих лет в научной/патентной литературе анализируется и описывается сульфатированная гиалуроновая кислота, которая получена изначально из гиалуроновой кислоты (HA), соответствующим образом сульфатированной, согласно описанию в предшествующем уровне техники (EP0940410B1 и EP0702699B1), которой приписывают антикоагулянтное действие. HAS также можно получить в результате деацетилирования и последующего сульфатирования глюкозамина НА (определяемая как HA-NS) (EP0971961B1), для производства хирургических инструментов и материалов и фармацевтических композиций. Также известны патенты на изобретения EP0754460B1 и EP1385492B1, в которых описано применение HAS при таких патологиях, как, например, ARDS (острый респираторный дистресс-синдром), суставной ревматизм, ревматоидный артрит и дерматит.

Настоящее изобретение относится к новому и неожиданному применению HAS в качестве регулятора цитокиновой активности, поскольку авторы обнаружили исключительную способность HAS модулировать активность определенных цитокинов (как про-, так и противовоспалительных), изучали механизм действия и выявили существенное различие между двумя типами сульфатированного продукта (HAS и HA-NS), но самое главное, авторы данного изобретения неожиданно обнаружили непредвиденно высокую активность против различных типов и штаммов вируса герпеса, ВИЧ, цитомегаловируса и вируса везикулярного стоматита.

Начиная с 1970-х, ученые поняли, что селектированные популяции лимфоидных клеток могут продуцировать и высвобождать в кровеносное русло молекулы белковой природы, не ассимилируемые антителами, определенные термином «цитокины». Они представляют собой новый тип «гормонов», способный действовать на различные клеточные мишени в различных частях организма.

Прогресс в научных познаниях, относящихся к синтезу и биологическим/биохимическим функциям этих белков, изменил «старое» представление об иммунной системе (ИС) в том же научном мире и открыл новые горизонты для понимания ее многочисленных функций, тем самым создавая новые перспективы для лечения различных патологических процессов, местного и/или системного, в том числе новые терапевтические возможности, относящиеся к иммунотерапии рака.

Главными клетками ИС являются лимфоциты, они представляют собой приблизительно 20% белых клеток крови и, с учетом их различных функций, образуют 3 группы: В-лимфоциты, Т-лимфоциты и лимфоциты-киллеры. Многие цитокины представляют собой растворимые белки, продуцируемые лимфоцитами и/или моноцитами, способные действовать против других клеток/тканей, даже расположенных очень далеко от места их выработки. Они, фактически, обладают иммунологическими функциями, а также регуляторными функциями в синтезе других цитокинов различными клетками ИС, или клеток-мишеней, вовлеченных в каскад реакций, запущенный ИС.

До настоящего времени был изучен целый ряд различных цитокинов, также имеющих целый ряд различных аббревиатур, но заявитель данного изобретения изучал, в частности, следующие: Интерлейкин 1 и 2, Интерлейкин 6, 7 и 12, далее обозначаемые как IL-1, IL-2, IL-6, IL-7 и IL-12, которые, с TNF, определяются как цитокины провоспалительной природы, в то время как Интерлейкин 10 (IL-10), наоборот, представляет собой цитокин с сильными противовоспалительными свойствами.

Первым цитокином для изучения был, несомненно, IL-1, представленный двумя формами α и β, мощный индуктор воспалительного процесса, как местного, так и системного. Он, главным образом, продуцируется лимфоцитами В, Т и макрофагами в ответ на бактериальный возбудитель или стимуляцию со стороны других агентов, в том числе других цитокинов; он также секретируется альвеолярными, перитонеальными макрофагами, клетками Купфера, нейтрофилами периферической крови, эндотелиальными, эпителиальными и гладкомышечными клетками, фибробластами, клетками Лангерганса в коже, остеокластами, синовиоцитами и клетками многих других типов. Он также присутствует в цереброспинальной жидкости, где он и секретируется, и транспортируется. Обе формы связываются с одним и тем же рецептором и имеют очень похожие, если не идентичные, биологические активности. Множество из их провоспалительных функций связаны со стимулированием другими цитокинами, такими как IL-6 и IL-8, и сам их синтез может быть индуцирован цитокинами такими, как TNF, Интерферон, бактериальными эндотоксинами, вирусами и различными видами других агентов. Он вовлечен в процесс септического шока, и также следует упомянуть, что недавние исследования продемонстрировали, что IL-1 способен активировать экспрессию некоторых онкогенов и, таким образом, принимает участие в патогенезе новообразований. Более того, для этого цитокина была предложена аутокринная система контроля роста бластных клеток белого ростка, которые присутствуют в кровеносном русле пациентов с лейкемией: эти бластные клетки фактически неконтролируемо продуцируют IL-1, который, в свою очередь, стимулирует синтез тех факторов роста, которые усиливают пролиферацию тех же самых бластных клеток. В сочетании с другими цитокинами, IL-1, таким образом, представляет собой один из главных медиаторов воспалительного процесса: он, по существу, стимулирует Т-клетки к выработке IL-2, и В-клетки - к выработке иммуноглобулинов. Таким образом, он вовлечен в целый ряд патологических процессов, таких как, например, астроглиоз и демиелинация нервных волокон, он является цитотоксическим для клеток Лангерганса поджелудочной железы, которые вырабатывают инсулин, и также он вовлечен в литические процессы в костях, и активируя остеокласты, и подавляя формирование новой кости, оба процесса вовлечены в патологический процесс остеопороза. Он способен функционировать как пироген, поскольку, повышая высвобождение простагландинов в гипоталамическом центре, обуславливает повышение температуры тела. Он также вовлечен в патогенез ревматоидного артрита и артроза: в действительности, большие количества IL-1 были обнаружены в синовиальной жидкости пациентов, страдающих ревматоидным артритом и/или остеоартрозом. И наконец, он принимает участие в образовании сосудистого повреждения, например венозного тромбоза, и присутствует во всех сосудах при патологии артерио/артериосклеротического типа. В настоящее время проводятся испытания антагонистов рецептора для этого цитокина, поскольку доказано, что блокада рецептора представляет собой эффективный способ лечения этих патологических процессов, где IL-1 принадлежит к числу протагонистов.

TNF : Фактор некроза входит в состав группы цитокинов, которая провоцирует реакцию фазы острого системного воспаления. Таким образом, TNF вовлечен в чрезвычайно большое число процессов, таких как клеточная пролиферация, дифференциация и апоптоз, канцерогенез и вирусная репликация.

Он преимущественно вырабатывается макрофагами и рядом других клеточных типов, в том числе мастоцитами, лимфоидными клетками, мышечными и эпителиальными клетками, фибробластами и нейронами. Его синтез может быть простимулирован бактериальными эндотоксинами, другими цитокинами, такими как IL-2, Интерферон и IL-1, и его можно ингибировать стероидами.

Воздействуя на многочисленные органы и системы, как правило, совместно с другими цитокинами, он принимает участие в развитии и регуляции многих патогенетических процессов:

- модулирует экспрессию многих белков и важных цитокинов, таких как IL-1 и IL-6, в результате чего вовлечен во многие кожные патологии, такие как дерматит, витилиго и экзема;

- стимулирует гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковую систему, повышая высвобождение гормонов некоторых типов;

- подавляет аппетит;

- стимулирует повышение температуры (действует в качестве пирогена, стимулируя гипоталамус к выработке простагландинов);

- стимулирует синтез коллагеназ в синовиоцитах, и по этой причине большое количество TNF обнаружено в синовиальной жидкости пациентов, страдающих артрозом и ревматоидным артритом;

- активирует остеокласты и, таким образом, индуцирует реабсорбцию костной ткани, процесс, свойственный остеопорозу;

- также вовлечен в патологические процессы, затрагивающие нервную систему, такие как астроцитоз и демиелинизация;

- сильно притягивает нейтрофилы и помогает им прикрепляться к эндотелиальным клеткам для транссудации;

- стимулирует выработку макрофагами молекул с окислительным действием;

- вовлечен в отдельные патологические процессы сердечно-сосудистой системы, принимая участие в формировании венозного тромбоза, в патогенез артериосклероза и васкулита;

- повышает резистентность к инсулину, повышает катаболизм белка в мышечной ткани, тем самым подавляя липогенный метаболизм в жировой ткани.

Высокие концентрации TNF могут индуцировать шокоподобные симптомы, в то время как длительное воздействие низких концентраций может вызвать кахексию, синдром, который является причиной истощения белковых и жировых запасов тканей (в частности, мышечной и жировой). TNF способен связываться с двумя рецепторами, TNF-R1 (рецептор для TNF типа 1) и TNF-R2 (рецептор для TNF типа 2), которые экспрессируются во всех соматических клетках, за исключением эритроцитов. Вкратце, TNF вызывает воспалительную реакцию, что в свою очередь запускает множество патологических процессов также аутоиммунной природы, таких как ревматоидный артрит, болезнь Крона, псориаз и астма. Вплоть до настоящего времени в научных исследованиях стараются усовершенствовать «биологические» лекарства (такие как, например, моноклональные антитела), которые ингибируют синтез TNF и/или блокируют его рецептор.

IL-2 : это чрезвычайно провоспалительный, атерогенный цитокин, главным образом продуцируемый Т-лимфоцитами, чей синтез ингибируется стероидами и циклоспоринами. Лейкемические клетки синтезируют вышеупомянутый цитокин и одновременно экспрессируют его рецептор, таким образом создавая аутокринную систему в стимуляции их роста, что приводит к ухудшению патологического процесса лейкемии. IL-2 играет главную роль в регуляции иммунного ответа: фактически, он стимулирует синтез TNF в лейкоцитах периферической крови и индуцирует продукцию IL-1 и TNF. IL-2 также повреждает гематоэнцефалический барьер и целостность эпителия сосудов головного мозга, обуславливая психоневрологические нарушения, такие как дезориентация и депрессивный синдром.

Таким образом, существует целый ряд патологических процессов, связанных с нарушенным производством IL-2, такие как лимфома Ходжкина, отторжение пересаженного органа, рассеянный склероз, ревматоидный артрит, красная волчанка, сахарный диабет и СПИД.

IL-6 : продуцируется многими типами клеток, прежде всего ИС, вместе с TNF он является одним из самых важных членов группы химических медиаторов острой фазы воспалительного процесса и, таким образом, вовлечен в патологические процессы с сильным воспалительным компонентом, такие как астма (при которой он участвует в возникновении и поддержании воспалительного процесса), хроническая флегмона кишечника (болезнь Крона), ревматоидный артрит и артроз. Как подтверждено ранее, фактически, цитокины, такие как TNF, IL-1 и IL-6, в значительной степени вовлечены в процесс дегенеративного суставного остеоартроза, поскольку они имеют первостепенную роль в регуляции экспрессии металлопротеиназ (отвечающих за деградацию хряща), продукции простагландинов и остеокластной активации, и по этой причине высокие уровни цитокинов были зарегистрированы в синовиальной жидкости пациентов, страдающих артрозом и ревматоидным артритом (РА). Эти находки стимулировали применение ингибиторов вышеуказанных интерлейкинов и/или антагонистов рецепторов в качестве нового принципа лечения артрозов.

Высокие концентрации IL-6 также были обнаружены в моче пациентов, перенесших трансплантацию органа, и их присутствие представляет собой ранний признак реакции отторжения данного органа. Уровень этого цитокина в сыворотке также существенно повышен у многих пациентов, страдающих опухолевыми заболеваниями (такими как, например, миелома, лейкемия, миксомы сердца, или при таких патологических процессах, как лимфаденопатии и цирроз печени), и он также может быть использован в качестве индикатора при мониторинге размера опухолевого образования. Наконец, недавние исследования связали рак с продолжительностью жизни и показали, как некоторые опухоли находятся под влиянием качественного/количественного окружения цитокиновых белков у пациента: вкратце, современные данные связывают низкую продукцию IL-10 и высокую продукцию IL-6 с ухудшением клинической выживаемости пациентов, пораженных опухолевыми патологиями, в то время как генотип, способный к производству и поддержанию высоких уровней IL-10 может способствовать выживаемости. Следовательно, лица с высокими уровнями противовоспалительных цитокинов и низкими концентрациями провоспалительных цитокинов обладают генетической предрасположенностью к более продолжительной жизни (Caruso C. et al., Ann N.Y. Acad. SCI., 2004, 1028: 1-13).

IL-7 : цитокин, главным образом, продуцируемый стромальными клетками костного мозга, он также секретируется в тимусе и кератиноцитами. IL-7 индуцирует синтез воспалительных цитокинов, таких как IL-1, IL-6 и TNF, таким образом участвуя в патогенезе некоторых заболеваний кожи (таких как псориаз и кожная лимфома) и костно-суставной системы. В действительности, высокие уровни IL-7 были обнаружены у пациентов, страдающих РА, поскольку IL-1 и TNF (цитокины, прочно вовлеченные в вышеуказанные патологические процессы) могут повышать стромальную выработку IL-7, что в свою очередь стимулирует синтез TNF макрофагами. Наконец, IL-7 может индуцировать созревание остаокластов и, следовательно, усиливать резорбцию кости, способствуя дегенерации суставов.

IL-12 : этот белок также играет центральную роль в регуляции функций ИС. В действительности, он оказывает влияние на дифференциацию лимфоцитов, индуцирует синтез Интерферона и TNF, и его выработка может быть ингибирована посредством IL-10. Сверхпродукция этого белка входит в патогенез заболеваний аутоиммунной природы, таких как колит, артрит, инсулинозависимый сахарный диабет, энцефаломиелит, псориаз и рассеянный склероз (Brahmachari S. et al., Minerva Med., 2008, 99(2): 105-118).

IL-10 : главным образом, продуцируется лимфоцитами, представляет собой цитокин противовоспалительной природы, способный ингибировать синтез IL-2 и Интерферона, вырабатываемого Т-лимфоцитами. Противовоспалительное действие IL-10 также проявляется способностью ингибировать синтез IL-1, IL-6, IL-8, IL-12 и TNF в макрофагах, стимулированных бактериальными эндотоксинами. Недостаток IL-10 связан с такими патологическими процессами, как сахарный диабет и хронические воспаления кишечника, например, болезнь Крона. Недавние результаты привели к тому, что IL-10 также будут испытывать в качестве нового терапевтического подхода к лечению красной волчанки. Низкие уровни IL-10 наблюдали в кожной ткани пациентов, страдающих такими патологическими процессами, как витилиго, псориаз, экзема и дерматит в общем плане. Следует отметить, что и кортикостероиды, и циклоспорин повышают продукцию и/или высвобождение этого интерлейкина из соответствующих компетентных клеток в процессе стандартной иммуносупрессорной терапии при лечении воспалений и отторжения органов (Zhou X. Et al., Current Drug Targets-Immune, Endocrine & Metabolic Disorders, 2005, 5(465475). Экспериментальные данные также продемонстрировали его эффективность в уменьшении высвобождения простагландинов и циклооксигеназ, индуцированного in vitro посредством TNF в синовиоцитах человека, таким образом свидетельствуя о способности IL-10 уменьшать воспалительные процессы, в которые вовлечены суставы, пораженные остеоартрозной дегенерацией (Alaaeddine N. et al., Arthritis & Rheumatism, 1999, 42:710-718). Недавние исследования подтвердили его терапевтическую эффективность в отношении астмы на экспериментальной модели бронхиальной гиперактивности на животных, демонстрируя, что этот цитокин имеет высокий терапевтический потенциал в уменьшении воспаления, которое характерно для дыхательных путей астматических больных, у которых высокие концентрации TNF, IL-1, IL-5, IL-6 и IL-8 были обнаружены в бронхиальном смыве и/или на сывороточном уровне, и/или на тканевом уровне (Stankiewicz W. et al., Mediators of Inflammation, 2002, 11: 307-312). Таким образом, для этого интерлейкина была предположена важная роль регулятора цитокинов поддержания иммунологического гомеостаза.

Астма может быть чрезвычайно инвалидизирующим заболеванием, которым страдают приблизительно 200 миллионов человек во всем мире, и является причиной более 5000 смертей в год. Это патологический процесс, в основе которого лежит деформированная реакция ИС на факторы окружающей среды, в связи с чем связан с повышенной продукцией провоспалительных цитокинов для роста и дифференциации мастоцитов и эозинофилов с другими типами клеток ИС. Причины этой несбалансированной активности иммунной системы до сих пор не совсем понятны, тем не менее, существуют генетические, экологические, вирусные, а также алиментарные факторы, которые вносят свой вклад различными путями в развитие этой патологии. Следовательно, обнаружение эффективной терапии для профилактики/лечения этой патологии делает возможным прекращение и/или снижение использования стероидов (традиционный способ лечения), может представлять собой эффективное решение как для более серьезных форм (поскольку в любом случае это позволит уменьшить использование стероидов), так и в менее серьезных случаях, поскольку прекращение стероидной терапии может быть полным.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к новому и неожиданному применению HAS в качестве регулятора цитокиновой активности, поскольку заявитель изобретения обнаружил ее исключительную способность модулировать активность определенных цитокинов, изучал механизм действия и выявил существенное различие между двумя типами сульфатированного продукта, известных в уровне техники, но самое главное, заявитель данного изобретения обнаружил непредвиденно высокую активность против различных типов и штаммов вируса герпеса, ВИЧ, цитомегаловируса и вируса везикулярного стоматита. Сульфатированная гиалуроновая кислота, подходящая для целей настоящего изобретения, была получена в соответствии с процессом, описанным в EP 702699 B1: сульфатирование осуществляется с помощью комплекса SO₃-пиридин и включает в себя спиртовые гидроксильные группы, представленные в полисахаридной цепи, происходящей из НА, полученной из любого источника, например в результате экстракции из петушиного гребня, либо ферментативно, либо технологически, и имеющий молекулярный вес в диапазоне от 400 до 3×10⁶ Да, в частности от 1×10⁴ Да до 1×10⁶ Да, даже более конкретно от 10000 до 50000 Да, 150000 до 250000 Да и 500000 до 750000 Да.

Полученное производное вещество сохраняет все физические характеристики исходного полимера неизмененными, в частности молекулярный вес исходной НА не изменяется в процессе сульфатирования, тем самым обеспечивается возможность сохранения всех физико-химических характеристик исходного полисахарида. В процесс сульфатирования вовлечены различные гидроксильные группы дисахаридной единицы, и таким образом можно достичь различных степеней сульфатации, от 0,5 до 3,5 (предназначены для обозначения числа сульфатных групп на дисахаридную единицу), посредством изменения количества введенного SO₃-пиридина, как известно в уровне техники.

Производное соединение, используемое во всех осуществленных экспериментах, как правило, имеет степень сульфатации 1 или степень 3, и обозначено далее как HAS1 и HAS3. Все свободные карбоксильные группы в HA могут быть в виде соли, образованной с катионами органического и/или неорганического происхождения.

Обе степени HAS являются водорастворимыми, и они также могут быть простерилизованы с использованием стандартных технологических приемов, известных специалистам в данной области, даже если стерилизация в автоклаве предпочтительнее.

В проведенных экспериментальных работах, описанных здесь, заявитель изобретения демонстрирует, что:

- HAS обладает способностью стимулировать как продукцию новой мРНК, так и белковый синтез противовоспалительных цитокинов (такого как, например, IL-10), таким образом повышая способность клеток к иммунной защите и, следовательно, всего организма. Противовоспалительное действие вышеуказанных цитокинов проявляется способностью ингибировать синтез IL-1, IL-6, IL-8, IL-12 и TNF, все белки провоспалительной природы.

- HAS является эффективной и в уменьшении синтеза новой мРНК, и в плане значительного снижения белкового синтеза IL-2, IL-7 и IL-12 со стороны синовиоцитов (для IL-12) и клеточных компонентов ИС, и то, и другое в ситуациях, когда иммунная реакция не требуется, а также при определенных событиях воспалительной реакции, при которых иммунная клетка отвечает выработкой цитокинового каскада, и, главным образом в этом случае, представленные данные выявляют более значительное ингибиторное действие HAS.

- HAS эффективна в отношении ингибирования связывания TNF, IL-1 и IL-6 с их рецепторами. Эти результаты имеют фундаментальное значение, поскольку они подтверждают, что данное действие сульфата совершенно аналогично таковому специфических моноклональных антител для рецепторов вышеуказанных провоспалительных белков, следовательно, он способен блокировать их функцию, даже если они не обладают этой специфичностью. Эта блокада рецептора является наиболее эффективным способом противодействия провоспалительному и опухолевому эффектам TNF, IL-1 и IL-6 фактора, тем самым открывая новые горизонты в проведении клинических экспериментов, делая возможным усовершенствование новых терапевтических подходов в лечении и/или профилактике чрезвычайно большого количества патологических процессов, учитывая роль, которую TNF, IL-1 и IL- 6 играют в возникновении и прогрессировании целого ряда заболеваний.

В силу вышеизложенного автор изобретения описывает и заявляет новое применение HAS для изготовления лекарственного средства:

- для профилактики и/или лечения патологических процессов, связанных с иммунным дефицитом и, в частности, с дефицитом IL-10, стимулируя синтез противовоспалительных цитокинов в качестве новой местной или системной терапии таких патологий, как витилиго, экзема, псориаз и дерматит;

- для профилактики и/или лечения патологических процессов, связанных с повышением/активацией IL-1, IL-2, IL-6, IL-7, IL-8, IL-12 и TNF;

- для профилактики и/или лечения астмы, ревматоидного артрита и артроза, связанных с активацией IL-1, IL-6 и TNF;

- для профилактики и/или лечения патологических процессов, связанных с повреждением эндотелия кровеносных сосудов;

- для профилактики и/или лечения кожных заболеваний, таких как, например, дерматит и кожная лимфома;

- для профилактики и/или лечения заболеваний аутоиммунной природы, таких как ревматоидный артрит, болезнь Крона (и все хронические воспаления кишечника), псориаз и астма, сахарный диабет, энцефаломиелит, рассеянный склероз, красная волчанка и для лечения отторжения трансплантатов органов;

- для профилактики и/или лечения новообразований, таких как, например, лейкемия и лимфома Ходжкина;

- для профилактики и/или лечения астроглиоза, астроцитоза и демиелинизации нервных волокон;

- для профилактики и/или лечения патологических состояний, связанных с активацией остеокластов, таких как остеопороз;

- для профилактики и/или лечения сосудистых патологий артерио/артериосклеротического типа, венозного тромбоза и васкулитов, связанных с активацией TNF, IL-1 и IL-6;

- для профилактики и/или лечения лихорадочных патологических состояний.

Заявитель изобретения также продемонстрировал, в описанных здесь экспериментальных работах, силу противовирусного действия HAS в отношении вирусов различных типов:

- полученные результаты демонстрируют эффективность HAS (как степени 1, так и степени 3) при ингибировании вирусной репликации вируса ВИЧ 1 и 2. Данный эксперимент также продемонстрировал, что не все сульфатированные гиалуроновые кислоты, известные в уровне техники, действуют эффективно в отношении вирусной репликации, поскольку только для HAS, у которой сульфатирование произошло в отношении гидроксильных групп исключительно, была доказана активность, причем HA-NS не является эффективной при блокировании вирусной цитопатогенности.

- Экспериментальные данные подтверждают противовирусное действие HAS1 и HAS3 против вируса простого герпеса 1 и 2, и против вируса везикулярного стоматита (VSV). Первая форма, чрезвычайно распространенная, отвечает за появление характерных лихорадочных пузырьков, обычно поражающих кожу лица (губы, ноздри); эту форму также называют herpes simplex labialis. Инфекция, обусловленная герпесом губ, может легко появляться снова, поскольку данный вирус выживает внутри клеток и не уничтожается даже с помощью эффективных лекарственных препаратов. Вторая форма представляет собой инфекцию половых органов, также известна как herpes genitalis. Заражение обеими формами происходит в результате физического и полового контакта. Вследствие локализации вирионов в нервных ганглиях, где они могут сохраняться в состоянии покоя в течение длительного периода времени, для герпетической инфекции характерны рецидивы, совпадающие с событиями, вызывающими стресс иммунной системы, и обычно появляются вновь в первичном очаге. Вирус везикулярного стоматита представляет собой РНК-вирус, он поражает млекопитающих (главным образом животных), и его используют в лабораториях для изучения развития жизненного цикла данного РНК-вируса. Сравнение между HA-NS1 и HAS1 еще раз показало, что не все сульфатированные гиалуроновые кислоты являются аналогичными, так как доказано, что HA-NS1 является вообще не активной, в то время как HAS 1 и 3 демонстрируют очень сильную противовирусную активность против вируса простого герпеса, а также против VSV. Ни один из протестированных образцов не оказался цитотоксичным для клетки-хозяина, минимальная полученная цитотоксическая концентрация, по существу, является эквивалентной таковой стандартных лекарственных средств, используемых обычно в клинической практике для лечения герпеса, и в среднем оказалась в 100 раз сильнее, чем показанные активными при ингибировании вирусной репликации.

- Экспериментальные данные, полученные и для HAS1, и для HAS3, показали явный и значимый противовирусный результат в отношении Cytomegalovirus: это особый тип вируса, который внедряется в некоторые типы клеток нашего организма, в которых он воспроизводит сам себя паразитически, что является причиной их гибели. Он принадлежит тому же семейству, что и herpes labialis и herpes genitalis, ветряная оспа и инфекционный мононуклеоз. Эпителиальные клетки, мембраны слизистых оболочек, лимфоузлы представляют собой очаги множественной первичной инфекции. Он сохраняется в латентной форме пожизненно в периферической крови, в эпителии почечных канальцев и в эпителии слюнных желез. У больных с ослабленным иммунитетом (такие как страдающие СПИДом, и пациенты после трансплантации органов, находящиеся под иммуносупрессивной терапией) встречаются тяжелые формы, затрагивающие различные органы: пневмония, гепатит, колит, эзофагит, нефрит. Лечение заключается в приеме лекарственных средств, таких как ганцикловир, валганцикловир и фоскарнет (ингибиторы синтеза вирусной ДНК). Также и в этом случае, было доказано, что HA-NS1 является неэффективным при ингибировании пролиферации данного вируса, подтверждая абсолютное различие, относительно противовирусного потенциала, между двумя типами сульфатированных продуктов.

В силу вышеизложенного автор изобретения описывает и заявляет новое применение HAS для изготовления лекарственного средства:

- для профилактики и/или лечения ВИЧ;

- для профилактики и/или лечения herpes simplex labialis и herpes genitalis;

- для профилактики и/или лечения инфекции, вызванной вирусом пузырькового стоматита;

- для профилактики и/или лечения инфекции, вызванной цитомегаловирусом.

Наконец, заявитель изобретения описывает приготовление различных фармацевтических составов/композиций, включающих в себя HAS в качестве единственного активного компонента, или в сочетании с другими фармацевтически и/или биологически активными агентами, такими как, например, стероиды, гормоны, белки, трофические факторы, витамины, нестероидные противовоспалительные средства (FANS), химиотерапевтические средства, блокаторы кальциевых каналов, антибиотики, противовирусные средства, противосвертывающие средства и/или фибринолитические средства, анестезирующие средства местного действия, ферменты, такие как, например, коллагеназы и/или гиалуронидазы, и/или другие протеазы; также могут быть составлены композиции с полимерами, такими как гиалуроновая кислота и ее производные, карбоксиметилцеллюлоза и/или другие полимеры природного (например, коллаген) или синтетического происхождения.

Обсуждаемую фармацевтическую композицию можно применять системно (внутривенно или артериально, внутримышечно, внутрибрюшинно, подкожно или перорально), ее можно использовать для местного применения посредством кожного и/или чрескожного всасывания, ее можно вводить в организм ингаляционно/аэрозольно (в особенности для лечения астматической патологии), внутрисуставно, или ее можно ввести непосредственно в область, подвергающуюся лечению, посредством прямой инъекции.

Обсуждаемая фармацевтическая композиция может быть сформулирована в виде мази, липогеля, гидрогеля, губной помады, крема, вагинальных овулей и бужей, пены, геля для слизистых оболочек, офтальмологических препаратов, средств для промывания/спринцевания, жидкостей для полоскания ротовой полости, пластырей для кожного и/или чрескожного всасывания, особенно FANS и гормонов, раствора для ингаляционного использования.

Некоторые примеры композиций HAS степени 1 и 3, фармацевтических составов, содержащих их, представлены исключительно для наглядных и неограничивающих целей, вместе с результатами, полученными в экспериментальных работах in vitro.

Пример 1

Получение тетрабутиламмониевой соли гиалуроновой кислоты (НА), имеющей средний молекулярный вес, эквивалентный 200 кД (в диапазоне от 150000 до 250000 Да)

5,00 г гиалуроновой кислоты ферментативного происхождения из натриевой соли (200 кД) растворяли в 250 мл воды и полученный раствор профильтровывали через стеклянную колонку, предварительно заполненную 100 см³ смолы Dowex в форме тетрабутиламмония (TBA). Элюированный раствор соли HA-TBA собирали и лиофилизировали. Получено 7,50 г продукта.

Пример 2

Синтез сульфатированной НА, исходя из НА, имеющей средний молекулярный вес 200 кД и степень сульфатации, эквивалентную 3 сульфатным группам на повторяющуюся единицу

Способ A

10,0 г ТВА-соли гиалуроновой кислоты, имеющей средний молекулярный вес 200 кД, полученной в соответствии с Примером 1, растворяли в 300 мл диметилсульфоксида (DMSO); 26,0 г комплекса SO₃-пиридин (серный ангидрид и пиридин, далее сокращено как PySO₃) диспергировали в 150 мл DMSO, и затем добавляли в раствор НА. После 20 часов механического перемешивания при температуре 21°C реакцию останавливали, добавляя 0,1 объема воды; сырой продукт реакции выделяли посредством осаждения после добавления 2 объемов этилового спирта. Полученное твердое вещество диспергировали в 150 мл воды и доводили значение рН до нейтрального с помощью 1М NaOH. Проводили тщательный диализ данной смеси против воды через мембрану с границей отсекания 12-14000 Да. Данный диализированный продукт подвергают лиофилизации. Получено 9,7 г продукта со степенью сульфатирования, эквивалентной 3 сульфатным группам на повторяющуюся единицу (выход = 88%).

Способ B

32,0 г ТВА-соли гиалуроновой кислоты, имеющей средний молекулярный вес 200 кД, полученной в соответствии с Примером 1, растворяли в 900 мл N-метил-пирролидона (NMP); 100 г PySO₃ диспергировали в 600 мл NMP, и затем добавляли в раствор НА. После 20 часов механического перемешивания при температуре 21±1°C, реакцию останавливали, добавляя 0,5 объема воды; значение рН, изначально менее 2,5, доводили до нейтрального с помощью NaOH (в растворе). Сырой продукт реакции выделяли посредством осаждения, добавляя 2,5 объема метилового спирта и отмывая 2 объемами смеси метиловый спирт/вода 8/2. Данное твердое вещество повторно растворяли и проводили тщательный диализ против воды через мембрану с границей отсекания 12-14000 Да. Получено 30,4 г продукта со степенью сульфатирования, эквивалентной 3 сульфатным группам на повторяющуюся единицу (выход = 86%).

Пример 3

Синтез сульфатированной НА, исходя из НА, имеющей средний молекулярный вес 200 кД и степень сульфатирования, эквивалентную 1 сульфатной группе на повторяющуюся единицу

Применяя процедуру, описанную в Примере 1, готовили 10 г ТВА-соли НА, которые растворяли в 350 мл DMSO. 10,0 г комплекса PySO₃ диспергировали в 100 мл DMSO и затем добавляли в раствор HA. После 20 часов механического перемешивания при температуре 21°C данную реакцию останавливали, добавляя 0,1 объема воды; сырой продукт реакции изолировали посредством осаждения после добавления 2,5 объемов этилового спирта. Полученное твердое вещество диспергировали в 150 мл воды и доводили значение рН до нейтрального с помощью NaOH 1 моль/л. Проводили тщательный диализ данной смеси против воды через мембрану с границей отсекания 12-14000 Да. Данный диализированный продукт подвергают лиофилизации. Получено 7,54 г продукта со степенью сульфатирования, эквивалентной 1,0 сульфатной группе на повторяющуюся единицу (выход = 93%).

Пример 4

Синтез сульфатированной НА, исходя из НА, имеющей низкий средний молекулярный вес (средний МВ 10 кД, в диапазоне от 10000 до 50000 Да), и степень сульфатирования, эквивалентную 3 сульфатным группам на повторяющуюся единицу

Применяя процедуру, описанную в Примере 1, готовили 12,4 г ТВА-соли низкомолекулярной гиалуроновой кислоты, которые растворяли в 300 мл NMP. 40 г PySO₃ диспергировали в 100 мл NMP, и затем добавляли в раствор HA. После 20 часов механического перемешивания при температуре 21°C данную реакцию останавливали, добавляя 0,5 объема воды. Значение pH, изначально менее 2,5, доводили до нейтрального с помощью 4М NaOH. Сырой продукт реакции выделяли посредством осаждения, добавляя 2,5 объема метилового спирта и отмывая 2 объемами смеси метиловый спирт/вода 8/2. Данное твердое вещество повторно растворяли и проводили тщательный диализ против воды через мембрану с границей отсекания 3500 Да. Получено 12,0 г продукта со степенью сульфатирования, эквивалентной 3 сульфатным группам на повторяющуюся единицу (выход = 85%).

Пример 5

Синтез сульфатированной НА, исходя из НА, имеющей низкий средний молекулярный вес и степень сульфатирования, эквивалентную 1 сульфатной группе на повторяющуюся единицу

Применяя процедуру, описанную в Примере 1, готовили 12,4 г ТВА-соли НА, которые растворяли в 300 мл DMSO. 16,0 г PySO₃ диспергировали в 100 мл DMSO, и затем добавляли в раствор HA. После 20 часов механического перемешивания при температуре 21°C данную реакцию останавливали, добавляя 0,1 объема воды; сырой продукт реакции изолировали посредством осаждения, добавляя 2,5 объема этилового спирта. Полученное твердое вещество диспергировали в 150 мл воды и доводили значение рН до нейтрального с помощью NaOH 1 моль/л. Проводили тщательный диализ данной смеси против воды через мембрану с границей отсекания 3500 Да. Данный диализированный продукт подвергают лиофилизации. Получено 9,04 г продукта со степенью сульфатирования, эквивалентной 1,0 сульфатной группе на повторяющуюся единицу (выход = 90%).

Пример 6

Синтез сульфатированной НА, исходя из НА, имеющей молекулярный вес в диапазоне 500-730 кД и степень сульфатирования, эквивалентную 3 сульфатным группам на повторяющуюся единицу

21,0 г натриевой соли гиалуроновой кислоты экстрагированного происхождения (500-730 кД) растворяли в 1,5 л воды и полученный раствор фильтровали через стеклянную колонку, предварительно наполненную 450 см³ смолы Dowex в форме ТВА. Элюированный раствор соли HA-TBA собирали и лиофилизировали. Получили 32,0 г продукта, которые растворили в 1,35 л NMP; 100 г PySO₃ диспергировали в 650 мл NMP, и затем добавляли в раствор HA. После 20 часов механического перемешивания при температуре 23±1°C реакцию останавливали, добавляя 0,5 объема воды. Значение pH, изначально менее 2,5, доводили до нейтрального, добавляя NaOH (в растворе с концентрацией 4 моль/л). Сырой продукт реакции выделяли посредством осаждения, добавляя 2,5 объема метилового спирта и отмывая 3,5 объемами смеси метиловый спирт/вода 8/2. Данное твердое вещество повторно растворяли и проводили тщательный диализ против воды через мембрану с границей отсекания 12-14000 Да. Получено 30,3 г продукта со степенью сульфатирования, эквивалентной 3 сульфатным группам на повторяющуюся единицу (выход = 83%).

Пример 7

Синтез сульфатированной НА, исходя из НА, имеющей молекулярный вес в диапазоне 500-730 кД и степень сульфатирования, эквивалентную 1 сульфатной группе на повторяющуюся единицу

21,0 г натриевой соли гиалуроновой кислоты экстрагированного происхождения (500-730 кД) растворяли в 1,5 л воды и полученный раствор фильтровали через стеклянную колонку, предварительно наполненную 450 см³ смолы Dowex в форме ТВА. Элюированный раствор соли HA-TBA собирали и лиофилизировали. Получили 32,0 г продукта, которые растворили в 1,65 л NMP; 40 г PySO₃ диспергировали в 350 мл NMP, и затем добавляли в раствор HA. После 20 часов механического перемешивания при температуре 25±1°C реакцию останавливали, добавляя 0,5 объема воды. Значение pH, изначально менее 2,5, доводили до нейтрального, добавляя NaOH (в растворе с концентрацией 4 моль/л). Сырой продукт реакции выделяли посредством осаждения, добавляя 3,5 объема метилового спирта и отмывая 3,5 объемами смеси метиловый спирт/вода 8/2. Данное твердое вещество повторно растворяли и проводили тщательный диализ против воды через мембрану с границей отсекания 12-14000 Да. Получено 22,5 г продукта со степенью сульфатирования, эквивалентной 1 сульфатной группе на повторяющуюся единицу (выход = 87%).

Пример 8

Оценка регуляторного эффекта HAS степени 1 и степени 3 на экспрессию генов IL-10 и IL-12 в синовиоцитах человека

Предварительно расширенные in vitro поддерживаемые в культуре при 37°C в среде DMEM, содержащей в себе 10% FCS, синовиоциты человека высевали при концентрации 20000 клеток на лунку. Сульфатированные HA степени 1 (HAS1) и степени 3 (HAS3), полученные, как описано в Примерах 1-3, были затем добавлены в культуральную среду в концентрациях 0,1 и 0,5 мг/мл (для обоих образцов), в то время как контрольная обработка представляет собой несульфатированную НА, имеющую средний молекулярный вес (МВ) 200 кД. После 3 дней обработки провели ПЦР в режиме реального времени для оценки экспрессии генов IL-10 и IL-12: клеточную РНК выделяли, используя тризольный метод, следуя указаниям поставщика (реагент TRIZOL, LIFE Techonologies, GIBCO BRL). Вкратце, клетки лизировали с помощью 1,0 мл тризола и общая РНК была количественно определена посредством измерения ее поглощения при 260 нм. Используя программное обеспечение Primer3 (Roche Molecular Diagnostics, Pleasanton, CA, USA) для каждого гена были подобраны подходящие праймеры для амплификации. Экспрессию генов оценивали посредством ПЦР в режиме реального времени, проводимой с использованием Rotor-gene TM5500 (Corbett research, Sydney, Australia). ПЦР-реакции осуществляли, используя праймеры 300 нм и SYBR Green (Invitroge, Carlsbad, CA, USA) при 40 циклах 15 сек при 95°C, и 1 мин при 60°C. Пороговые значения флуоресценции (Ct) автоматически определяли с помощью программного обеспечения, коэффициент амплификации для изучаемых генов составлял между 92 и 110%. Для каждого образца кДНК значение экспрессии гена выражали при помощи соотношения между Ct для гена домашнего хозяйства (а именно, гена для белка бета-Актин, который представляет собой контрольный ген, поскольку он присутствует в каждой клетке и не подвергается влиянию HAS), и Ct представляющего интерес гена (а именно, ген IL-10 и IL-12), таким образом, значение Ct гена домашнего хозяйства/Ct представляющего интерес гена представлено на оси ординат, что таким образом обозначает количество мРНК, экспрессируемой изучаемым геном.

Полученные результаты представлены на Фиг. 1 и 2:

Фиг. 1: обработка синовиоцитов человека с помощью HAS1 и HAS3 вызвала значительное повышение экспрессии гена цитокина IL-10 по сравнению с контролем, обработанным несульфатированной НА.

Фиг. 2:

также в этом эксперименте для HAS обеих степеней сульфатирования (степень 1 и степень 3) доказана способность значительно снижать экспрессию гена IL-12, сокращая наполовину синтез его мРНК по сравнению с контролем, обработанным несульфатированной НА. Таким образом доказано, что сульфатированная гиалуроновая кислота:

- способна стимулировать продукцию новой мРНК для синтеза противовоспалительных цитокинов, таким образом повышая защитную способность клетки и, следовательно, всего организма, в отношении тех ранее описанных патологических процессов, при которых доказано, что IL-10 имеет фундаментальную значимость для регрессии и/или положительной динамики заболеваний, таких как астма, ревматоидный артрит, артроз и все воспалительные процессы, в которые вовлечен IL-10;

- эффективна в отношении снижения синтеза новой мРНК высоко провоспалительного цитокина IL-12, что доказывает ее эффективность в качестве противовоспалительного агента, способного вмешиваться в процесс экспрессии белков, вовлеченных в патогенез инвалидизирующих заболеваний, таких как псориаз, артрит и все те, которые описаны ранее.

Пример 9

Ингибирование связывания TNF с его рецептором, экспрессируемым в линии моноцитов: оценка эффективности HAS степени 1 и степени 3 при разных значениях МВ

Эти эксперименты были осуществлены для оценки эффективности образцов (полученных в соответствии с Примерами 1-4) тестируемых на способность ингибировать связывание TNF с его рецептором, экспрессируемым клетками ИС, обычно используемых in vitro для такого типа экспериментов, проведены с йодированными цитокиновыми компонентами для оценки в анализе радиолигандного связывания.

Экспериментальная процедура была осуществлена, как описано у Baglioni C. et al., J Biol Chem, 1985, 260: 13395-13397.

Вкратце, использовали линию человеческих гистиоцитов лимфомы U937, со свойствами моноцитов, чувствительных к цитотоксическому действию TNF, экспрессирующую его соответствующий рецептор. Клетки сначала инкубируют с ¹²⁵I-TNF 0,028 нМ (осуществляется в воде), одновременно с тестируемыми образцами (при концентрации 1 мг/мл, что, как доказано, является минимальной концентрацией, которая вызывает максимальное ингибирование), в инкубационном буфере, содержащем в себе 50 нМ Tris-HCl pH 7,4, 0,5 мМ EDTA, при 4°C в течение 3 часов.

По окончании инкубирования клетки центрифугируют с дибутилфтолат/динонилфталат 2/1 и в полученном осадке проводили подсчет с помощью γ-счетчика.

Полученные результаты представлены на Фиг. 3:

полученные результаты демонстрируют эффективность HAS полным (100%) ингибированием связывания TNF с его рецептором, для обеих степеней 1 и 3, со средним и низким МВ. Эти результаты имеют фундаментальную значимость, поскольку являются доказательством того, что действие данного сульфатированного продукта является полностью аналогичным таковому у моноклонального антитела, специфичного для TNF-рецептора, следовательно способен блокировать его функцию. Эта блокада рецептора соответственно представляет собой самый эффективный способ противодействия провоспалительным и опухолевым действиям фактора TNF.

Пример 10

Ингибирование связывания цитокина IL-1 с его рецептором, экспрессируемым в линиях фибробластов: оценка эффективности HAS степени 3 при разных значениях МВ

Эти эксперименты были осуществлены для оценки эффективности образцов (полученных в соответствии с Примерами 1-3 и 4), тестируемых на способность ингибировать связывание IL-1 с его рецептором, экспрессируемым мышиными клетками 3Т3, обычно используемыми in vitro для такого типа экспериментов, проведены с йодированными цитокиновыми компонентами для оценки в анализе радиолигандного связывания.

Экспериментальная процедура была осуществлена, как описано у Chin J et al., J Exp Med, 1987, 165: 70-86.

Вкратце, использовали линию мышиных фибробластов 3Т3, чувствительную к цитотоксическому действию IL-1, экспрессирующую его соответствующий рецептор. Клетки сначала инкубируют с ¹²⁵I-IL-1 10 пМ (осуществляется в воде), одновременно с тестируемыми образцами (при концентрации 1 мг/мл, что, как доказано, является минимальной концентрацией, которая вызывает максимальное ингибирование), в инкубационном буфере, содержащем в себе RPMI 1640, который включает в себя 20 мМ HEPES pH 7,2 и 1% BSA, при 37°C в течение 2 часов. По окончании инкубирования, клетки отмывали в фосфатном буфере, затем разводили в 2,5 М NaOH и проводили подсчет с помощью γ-счетчика.

Полученные результаты представлены на Фиг. 4:

полученные результаты демонстрируют эффективность HAS (и со средним, и с низким МВ) при ингибировании связывания IL-1 с его рецептором на 30%. Эти результаты являются чрезвычайно значимыми, поскольку служат подтверждением того, что данный сульфатированный продукт действует совершенно одинаково с моноклональным антителом, специфическим для представляющего интерес цитокина, таким образом, способен ингибировать его функцию. Эта блокада рецептора представляет собой самый эффективный способ противодействия провоспалительным и опухолевым действиям IL-1, как описано ранее.

Пример 11

Ингибирование связывания цитокина IL-6 с его рецептором, экспрессируемым клетками миеломы человека: оценка эффективности HAS степени 3 при разных значениях МВ

Эти эксперименты были осуществлены для оценки эффективности образцов (полученных в соответствии с Примерами 1-3 и 4), тестируемых на способность ингибировать связывание IL-6 с его рецептором, экспрессируемым миеломой U266 человека, обычно используемыми in vitro для такого типа экспериментов, проведены с йодированными цитокиновыми компонентами для оценки в анализе радиолигандного связывания.

Экспериментальная процедура была осуществлена, как описано у Taga T. et al., J Exp Med, 1987, 166: 967-981.

Вкратце, использовали линию U266 миеломы человека, чувствительную к цитотоксическому действию IL-6, экспрессирующую его соответствующий рецептор. Клетки сначала инкубируют с ¹²⁵I-IL-6 0,08 нМ (осуществляется в воде), одновременно с тестируемыми образцами (при концентрации 1 мг/мл, что, как доказано, является минимальной концентрацией, которая вызывает максимальное ингибирование), в инкубационном буфере, содержащем в себе RPMI 1640, который включает в себя 25 мМ HEPES pH 7,1 и 10% BSA, при 4°C в течение 16 часов. По окончании инкубирования клетки отмывали в фосфатном буфере, центрифугировали при 9000 об/мин и осадок подсчитывали с помощью γ-счетчика.

Полученные результаты представлены на Фиг. 5:

полученные результаты демонстрируют эффективность HAS, и со средним, и с низким МВ, при ингибировании связывания IL-6 с его рецептором на 100%. Таким образом, эти результаты доказывают, что данный сульфатированный продукт, также и в этом случае, действует полностью аналогично с моноклональным антителом, специфическим для рецептора представляющего интерес цитокина, следовательно способен блокировать его функцию. Эта блокада рецептора представляет собой наиболее эффективный способ блокирования провоспалительных эффектов IL-6.

Пример 12

Оценка ингибирующего действия HAS степени 1 и степени 3 на синтез белка цитокинов IL-2, IL-7, IL-10 и IL-12 в МПК человека

Для этих экспериментов использовали мононуклеарные клетки периферической крови (МПК) человека, полученные от множества разных доноров, для оценки эффекта HAS на выработку перечисленных выше цитокинов, используя:

- несульфатированную HA (средний МВ: 200 кД),

- HAS1 и HAS3 (получены, как описано в Примерах 1-3) (средний МВ: 200 кД).

Выделение МПК (Bøyum A., Scand J Clin Lab Invest 21 Suppl, 1968, 97:77-89) осуществляли, используя продукт Ficoll-Paque PLUS (GE Healthcare) и следуя протоколу, указанному поставщиком. В день ноль производили посев 100000 клеток на лунку (используя планшеты на 96 лунок) в 200 мкл среды RPMI 1640, в которую добавляли 10% фетальную телячью сыворотку, HEPES 10 мМ, глютамин 2 мМ, 1% пенициллин-стрептомицин 100 Е/мл. Эффект всех образцов оценивали на необработанных МПК с агентами, которые стимулируют синтез цитокинов, или стимулированных с помощью липополисахарида LPS (10 мкг/мл) (высоко провоспалительный), либо с помощью фитогемагглютинина РНА (10 мкг/мл) (вещество, способное стимулировать лимфоциты к делению), оба агента способны стимулировать синтез цитокинов. Клетки обрабатывали по отдельности тремя соединениями при концентрации 0,1 мг/мл или 1 мг/мл. После 24 часов инкубации при 37°C (5% CO₂) из каждой лунки отбирали 100 мкл супернатанта, для того чтобы провести анализ выработки IL-2, IL-7, IL-10 и IL-12.

Количественный анализ медиаторов воспаления был проведен с помощью технологии SearchLight®, используя планшет Custom Human 9-Plex Array и следуя протоколу, предоставленному поставщиком в техническом паспорте.

Полученные результаты представлены на Фиг. 6-9:

на этих графиках наглядно продемонстрировано, что HAS степени 1 и степени 3 способны значительно снижать синтез IL-2, IL-7 и IL-12 со стороны моноцитов, и в случае, когда клетки не стимулированы, и также в случае, когда, напротив, они стимулированы посредством специфических и сильнодействующих воспалительных факторов и/или митогенов. Таким образом, доказано, что HAS является молекулой с определенными фармакологическими свойствами, способной модулировать/регулировать синтез цитокинов с выраженной противовоспалительной активностью, как в ситуации, когда иммунный ответ не стимулирован, и при специфических воспалительных стрессовых событиях, когда иммунная клетка реагирует посредством выработки цитокинового каскада, и, главным образом, в этом случае представленные данные выявили более сильное модулирующее действие HAS.

На Фиг. 9, с другой стороны, представлено доказательство очевидного стимула для продукции IL-10 также для клеток, таких как моноциты человека (кроме синовиоцитов), принадлежащих иммунной системе. Таким образом, это еще раз подтверждает, что HAS обладает способностью модулировать синтез цитокинов, стимулируя те, которые являются противовоспалительными, и ингибируя синтез провоспалительных цитокинов.

Пример 13

Оценка противовирусного действия HAS степени 1 и степени 3 в сравнении с HA-NS:

Вирус ВИЧ-I (III_B) и ВИЧ-2 (ROD)

Активность тестируемых образцов была определена посредством оценки подавления цитопатогенности, обусловленной вирусом ВИЧ-1 (получен из Т-лимфоцитов, инфицированных вирусом типа III_B) и вирусом ВИЧ-2 (получен из Т-лимфоцитов, инфицированных вирусом типа ROD) в клетках МТ-4. Экспериментальную процедуру проводили, как описано у Baba M. et al., ANTIMICROB. AGENTS CHEMOTHER., 1988, 32: 1742-1745.

Вкратце, для этого анализа использовали Т-лимфоциты человека, называемые МТ-4, инфицированные штаммом III_B вируса ВИЧ-1 и штаммом ROD ВИЧ-2. Для этого теста применяли различные концентрации тестируемых образцов, используя в качестве положительного контроля декстран-сульфат, полисахарид, известный своей способностью ингибировать различные типы вирусов. Протестированные образцы:

1. HS-NS1: сульфатированная гиалуроновая кислота, полученная в результате сульфатирования глюкозамина после деацетилирования, степень 1 (EP0971961), для сравнения с

2. HAS1: гиалуроновая кислота, сульфатированная только в ее гидроксильных группах, степень 1, и

3. HAS3: гиалуроновая кислота, сульфатированная только в ее гидроксильных группах, степень 3, полученная, как описано в Примерах 1-3 (все образцы со средним МВ: 200 кД).

Противовирусная активность протестированных образцов выражена в виде минимальной концентрации, требуемой для подавления цитопатогенности вируса на 50%:IC50. Клетки были обработаны различными концентрациями вышеуказанных образцов сразу после заражения ВИЧ в инфекционных дозах. После 5 дней при 37°C количество живых клеток было определено в МТТ-тесте: соль тетразола подвергается окислительно-восстановительной реакции только митохондриальными ферментами живых клеток. Зараженные и необработанные клетки теряют прогрессирующую способность трансформировать соль тетразола в формазан, соответственно, если эти клетки сохраняют такую способность неизмененной после заражения, это означает, что такая обработка ингибирует вирусную активность и таким образом блокирует патогенность данного вируса (Dezinot F. et al., J Immunol. Methods, 1986, 22 (89): 271-277).

Полученные результаты представлены на Фиг. 10:

полученные результаты демонстрируют эффективность HAS (и степени 1, и степени 3) при ингибировании вирусной репликации вируса ВИЧ 1 и 2, в такой мере, что вполне сопоставимо с положительным контролем (представляющим собой полисахарид декстран-сульфат). Этот эксперимент также продемонстрировал, что не все сульфатированные гиалуроновые кислоты, известные в уровне техники, действуют эффективно в отношении репликации изученного вируса, поскольку заявитель изобретения показал, что только для HAS, чье сульфатирование произошло только по отношению к ее гидроксильным группам, показано сильное противовирусное действие, тогда как HA-NS не является эффективной при блокаде вирусной цитопатогенности.

Вирус простого герпеса-1, вирус простого герпеса-2, вирус везикулярного стоматита

Активность тестируемых образцов определяли посредством оценки ингибирования цитопатогенности, вызванной вирусом простого герпеса-1 (HSV-1: штаммы KOS, F и McIntyre) и вирусом простого герпеса-2, (HSV-2: штаммы G, 196 и Lyons) в фибробластах E₆SM, которые получены из мышечной/эмбриональной кожной ткани. Кроме того, противовирусная активность была протестирована еще раз в отношении клеток E₆SM, инфицированных вирусом везикулярного стоматита (вирус везикулярного стоматита: VSV). HSV-1 представляет собой вирус, который предпочтительно поражает слизистую оболочку рта, в то время как HSV-2 повреждает слизистую оболочку половых органов. Экспериментальную процедуру проводили, как описано у Baba M. et al., ANTIMICROB. AGENTS CHEMOTHER., 1988, 32: 1742-1745.

Вкратце, культуры сливающихся клеток подвергали воздействию инфекционных доз вышеуказанных вирусов в присутствии образцов HS-NS1 (EP0971961), HAS1 и HAS3, полученных, как описано в Примере 1 и 2 (все образцы со средним МВ: 200 кД). После инкубационного периода 1 ч при 37°C данную культуральную среду заменяли на свежую среду, содержащую в себе только тестируемые образцы. Цитопатогенность вируса проверяли на 2-ой день инкубации. Показатель ингибирования вирусной цитопатогенности оценивали по ингибированию синтеза ДНК и РНК в «инфицированных» клетках и подверженных обработке, как указано выше: клетки высевали в микролунки в культуральную среду, содержащую в себе различные концентрации тестируемых образцов с 2,5 мкКи 3H-тимидина и 3H-уридина на мл. Через 16 ч при 37°C клетки обрабатывали трихлоруксусной кислотой, отмывали в этиловом спирте, оставляли сушиться и проводили подсчет в 7,5 мл жидкости с помощью сцинтилляционного счетчика. Противовирусная активность протестированных образцов выражена в виде минимальной концентрации, требуемой для подавления цитопатогенности вируса на 50%: IC50. Кроме того, для того чтобы также оценить цитотоксичность тестируемых образцов, были определены минимальные концентрации, необходимые для того, чтобы вызвать морфологическое повреждение в используемых клетках (видимые с помощью оптического микроскопа). Сравнение проводили с декстран-сульфатом и лекарственным средством Ацикловир (обе молекулы с известной противовирусной эффективностью, поэтому использовались в качестве положительного контроля).

Полученные результаты представлены на Фиг. 11:

эти экспериментальные данные подтверждают то, что наблюдали для ВИЧ, а именно мощное противовирусное действие HAS1 и HAS3: сравнительный анализ между HA-NS1 и HAS1 показывает, что не все сульфатированные гиалуроновые кислоты являются равнозначными, поскольку HA-NS1 не оказалась активной, и эта разница в эффективности не зависит от молекулярного веса или степени сульфатирования гиалуроновой кислоты, таким образом, заключена в самой структуре HA-NS1 по сравнению с HAS1, то есть в сульфатировании. Действительно, HAS демонстрирует эффективность, эквивалентную эффективности декстран-сульфата и сравнимую с эффективностью ацикловира, стандартного лекарственного средства для лечения герпетической лихорадки. Более того, следует отметить, что ацикловир является недействующим против VSV, в то время как HAS степени 1 и 3 имеет очень мощное противовирусное действие против VSV.

Все протестированные образцы являются нетоксичными для клетки-хозяина, полученная минимальная токсичная концентрация является, в действительности, эквивалентной таковой стандартных лекарственных средств, обычно используемых в клинической практике для лечения герпеса, и оказалась в среднем в 100 раз выше, чем та, которая доказана эффективной для ингибирования вирусной репликации.

Цитомегаловирус

Активность тестируемых образцов определяли посредством оценки ингибирования цитопатогенности, вызванной цитомегаловирусом (CMV: штаммы AD-169 и Davis), используя предыдущий протокол. Противовирусная активность была протестирована на клетках HEL (эмбриональные клетки легкого) и выражена в виде концентрации, необходимой для ингибирования некоторого количества бляшек, образованных вышеупомянутым вирусом, на 50%.

Полученные результаты представлены на Фиг. 12: в таблице показан четкий и значимый положительный результат, полученный и для HAS1, и для HAS3, что еще раз подтверждает их эффективность в качестве противовирусных средств. Также в этом случае HA-NS1 оказалась неэффективной при ингибировании пролиферации данного вируса, что подтверждает абсолютное несходство между двумя типами сульфатированных продуктов степени 1 относительно наличия противовирусной функциональной активности.

Пример 14

Получение композиции в виде раствора для ингаляции, содержащего в себе сульфатированную гиалуроновую кислоту степени 1

40 мг (или 20 мг, если HAS имеет МВ 500-730 кД) сульфатированной гиалуроновой кислоты степени 1, имеющей низкий или средний МВ, вносили в стеклянный сосуд объемом 50 мл, после чего туда добавляли 15 мл PBS 0,2 M при стерильном pH 7,4. Данную смесь перемешивали в течение приблизительно 30 минут, до полного растворения данного порошка. После того как было достигнуто полное растворение, 2 мл пропиленгликоля и дополнительно 0,2 М PBS при стерильном рН 7,4 добавляли до конечного объема 20 мл. Данный раствор перемешивали в течение нескольких минут.

Пример 15

Получение композиции в виде раствора для ингаляции, содержащего в себе сульфатированную гиалуроновую кислоту степени 3

100 мг сульфатированной гиалуроновой кислоты степени 3, полученной из НА 200 кД, вносили в стеклянный сосуд объемом 50 мл, после чего туда добавляли 15 мл 0,2 M PBS при стерильном pH 7,4. Данную смесь перемешивали в течение приблизительно 30 минут, до полного растворения данного порошка. После того как было достигнуто полное растворение, 2 мл пропиленгликоля и дополнительно 0,2 М PBS при стерильном рН 7,4 добавляли до конечного объема 20 мл. Данный раствор перемешивали в течение нескольких минут.

Пример 16

Получение композиции в виде раствора для инъекций для внутрисуставного применения, содержащего в себе сульфатированную гиалуроновую кислоту степени 1

500 мг сульфатированной гиалуроновой кислоты степени 1, полученной из НА с МВ 500-730 кД, вносили в стеклянный сосуд объемом 50 мл, и затем туда добавляли PBS 0,2 M при стерильном pH 7,4 до конечного объема 20 мл. Данную смесь перемешивали в течение приблизительно 60 минут, до полного растворения данного порошка.

Пример 17

Получение композиции в виде гидрофильного геля, содержащего в себе HAS, HA и CMC

В дистиллированной воде при 80°C растворяли метил- и пропилпарабен. После охлаждения данного раствора до комнатной температуры, добавляли гиалуронат натрия при перемешивания до растворения, после чего добавляли HAS1 (или HAS3) и продолжали перемешивать до полного растворения. Затем добавляли глицерин и пропиленгликоль, продолжая перемешивать до полного растворения. В заключение, в данную смесь добавляли натрия карбоксиметилцеллюлозу (СМС) и перемешивали до получения гелеобразного раствора.

Пример 18

Получение композиции в виде гидрофильного геля для применения на слизистой оболочке (без консервантов), содержащего в себе HAS и HA

В условиях перемешивания растворяли гиалуронат натрия и затем HAS1 (или HAS3) в количестве воды, приблизительно 90% от предусмотренного в формуле. Добавляли пропиленгликоль, Symdiol 68 после чего добавляли МР-Диол гликоль (MP Diol Glycol) и смесь перемешивали до полного растворения данных разнородных компонентов. Затем добавляли карбомер 974Р и продолжали перемешивать до гомогенного диспергирования последнего. Гранулы гидроксида натрия растворяли в оставшихся 10% воды и этот раствор добавляли в полученный ранее для достижения остудневания водной фазы.

Пример 19

Получение композиции в виде губной помады, содержащей в себе HAS и HA

Нужное количество жидкого парафина, указанное в производственной рецептуре, помещают в подходящую емкость. Его нагревают до 88-92°С и затем при перемешивании добавляют белый мягкий парафин, твердый парафин, осветленный пчелиный воск, церезин, арлацель, перемешивание продолжают до полного расплавления данных разнообразных компонентов. Затем вводят all-rac-α-токоферол ацетат, аллантоин, бутилгидрокситолуол, пропил-п-гидроксибензоат и данную смесь перемешивают до полного растворения, поддерживая данную массу при температуре 88-92°C.

Дистиллированную воду в количестве, предусмотренном в формуле, наливают отдельно в подходящую емкость, затем добавляют гиалуронат натрия, HAS1 (или HAS3) и перемешивают до полного растворения, после чего добавляют динатрия эдетат и перемешивают до полного растворения.

Данную водную фазу переносят при перемешивании в емкость, содержащую в себе расплавленную массу, поддерживая температуру системы при 88-92°C и перемешивая до получения прозрачного раствора. Затем при перемешивании добавляют два ароматизатора и данную смесь перемешивают в течение 10 минут. Данную расплавленную массу заливают в формы для отливки и немедленно охлаждают до T<0°C, пока не получат твердые помады.

Пример 20

Получение композиции в виде вагинальных овулей, содержащих в себе HAS и HA

Желатин оставляют набухать в 70% от общего количества дистиллированной воды при 85°C; гиалуронат натрия и HAS1 (или HAS3) растворяют в оставшемся количестве воды и этот раствор смешивают с глицерином, доведенным до такой же температуры. Данный глицериновый раствор смешивают с раствором набухшего желатина и перемешивают до полного растворения желатина. Данную массу заливают в формы для отлива и охлаждают до T<0°C пока не получат твердые овули.

Пример 21

Получение композиции в виде гидрофильного крема, содержащего в себе HAS и HA

Масляную фазу готовят посредством расплавления жидкого парафина, стеариновой кислоты и Tefose 1500 при перемешивании при 50°C. Водную фазу готовят отдельно, изначально растворяя метилпарабен при 80°C, далее охлаждают до комнатной температуры и вводят глицерин, гиалуронат натрия и затем HAS1 (или HAS3) при перемешивании до полного растворения разнообразных компонентов.

Данную водную фазу соединяют с масляной фазой и осуществляют эмульсификацию, полученную эмульсию М/В охлаждают при перемешивании до комнатной температуры.

Пример 22

Получение композиции в виде мази, содержащей в себе HAS

Мазевую основу готовят, расплавляя светлый жидкий парафин и белый вазелин при перемешивании при 70°C. После охлаждения до комнатной температуры вводят HAS1 (или HAS3) при перемешивании и данную смесь перемешивают до получения гомогенной суспензии.

Пример 23

Получение композиции в виде капсул (твердый желатин), содержащих в себе HAS

HAS1 (HAS3) смешивают с фосфатом кальция, стеаратом магния и диоксидом кремния путем постепенного разбавления. Затем наполняют капсулы.

Пример 24

Получение композиции в виде таблеток, содержащих в себе HAS

HAS1 (или HAS3) подвергают влажной грануляции в кипящем слое с лигандным раствором, состоящим из воды и приблизительно 70% от общего количества натриевой СМС. Полученный гранулят подвергают просеиванию через 0,8-мм сетку.

Оставшиеся ингредиенты (фосфат кальция, микрокристаллическая целлюлоза, натриевая СМС и диоксид кремния) смешивают и просеивают через 0,8-мм сетку.

Ранее полученный гранулят смешивают со смесью, состоящей из оставшихся ингредиентов (экстрагранулы), и в заключение смешивают со стеаратом магния (предварительно просеянным через 0,8-мм сетку), с последующим прессованием.

Пример 25

Получение композиции в виде раствора для инъекций, содержащего в себе HAS

После приготовления (при комнатной температуре) физиологического раствора забуференного при рН 6,4-7,2, в нем растворяют лактозу при перемешивании, а затем HAS1 или HAS3. Полученный таким образом раствор пропускают через фильтр 0,22 микрон.

Таблицы

Гидрофильный гель (Пример 17)
Компоненты	Количество (мг/1 г гидрогеля)
HAS 1 (HAS3)	40 мг (10 мг)
CMC	20 мг
Глицерин	100 мг
Пропиленгликоль	66,75 мг
Гиалуронат натрия	2 мг
Метил-п-гидроксибензоат	2 мг
Пропил-п-гидроксибензоат	0,2 мг
Дистиллированная вода	необходимое количество до 1 г

Таким образом, описаны характеристики, эти методы, безусловно, могут быть модифицированы различными способами. Эти модификации не следует рассматривать как отклонения от сущности и перспектив данного изобретения, и все модификации, которые могут быть очевидны квалифицированному специалисту в данной области, включены в диапазон нижеследующей формулы изобретения.

1. Применение сульфатированной гиалуроновой кислоты для предупреждения и/или лечения астмы и дегенеративного суставного остеоартроза, связанных с активацией IL-1, IL-2, IL-6, IL-7, IL-8 и IL-12, указанная сульфатированная гиалуроновая кислота (ГК) приготовлена начиная с гиалуроновой кислоты (ГК), имеющей молекулярный вес от 10000 до 50000 Да, от 150000 до 250000 Да и от 500000 до 750000 Да и где сульфатированная гиалуроновая кислота имеет степень сульфатирования, равную 1 или 3.

2. Применение сульфатированной гиалуроновой кислоты по п. 1 для системного введения.

3. Применение сульфатированной гиалуроновой кислоты по п. 1 для местного или ингаляционного введения.