Способ получения лекарственной формы препарата на основе динатриевой соли флуоресцеина
Владельцы патента RU 2572718:
Федеральное государственное унитарное предприятие "Государственный научный центр "Научно-исследовательский институт органических полупродуктов и красителей" (ФГУП "ГНЦ "НИОПИК") (RU)
Заявлен способ получения лекарственной формы препарата на основе динатриевой соли флуоресцеина. Изобретение относится к области химической технологии, а именно к способу получения лекарственной формы препарата на основе динатриевой соли флуоресцеина (динатриевая соль 2-(6-гидрокси-3-оксо-3Н-ксантен-9-ил)бензойной кислоты), используемой для ангиографии в нейрохирургии и офтальмологии в виде 5-10%-ного инъекционного раствора. Способ заключается в том, что динатриевую соль флуоресцеина получают нейтрализацией флуоресцеина гидроксидом натрия при контролировании ее полноты потенциометрическим и кондуктометрическим методами. Чистота динатриевой соли достигается очисткой как промежуточного продукта - флуоресцеина, так и натриевой соли флуоресцеина, используя на всех технологических стадиях определенное сочетание традиционных методов очистки. Способ позволяет получать лекарственную форму препарата на основе динатриевой соли флуоресцеина по более простой и экологически чистой технологической схеме, исключив при этом синтез и выделение диацетилпроизводного флуоресцеина и его последующий гидролиз в токсичном растворителе - метиловом спирте при кипячении. 2 пр., 4 ил., 1 табл.
Изобретение относится к области химической технологии, а именно к способу получения лекарственной формы препарата на основе динатриевой соли флуоресцеина (динатриевая соль 2-(6-гидрокси-3-оксо-3Н-ксантен-9-ил)бензойной кислоты, уранин, ДСФ), используемой для ангиографии в офтальмологии и нейрохирургии.
В последнее время ДСФ находит применение в качестве субстанции в производстве препаратов, в частности, «Флуоресцеин Новартис» (Швейцария) и «Флуоресцеин» (США), представляющих собой стерильную лекформу в виде 10%-ного раствора для внутривенного введения и предназначенных для диагностики в офтальмологии и нейрохирургии.
Принципиально ДСФ может быть получена по следующим реакциям [Степанов Б.И. Введение в химию и технологию органических красителей. М.: Химия, 1984. С.189; Бородкин В.Ф. Химия красителей. М.: Химия, 1981. С.69]:
Следует отметить, что бесцветная лактонная форма флуоресцеина переходит в щелочной среде в желтую хиноидную форму флуоресцеина - ДСФ. Однако, несмотря на известность принципиального подхода к получению ДСФ, сведения, касающиеся способа ее получения фармакопейного качества, как и самого флуоресцеина, в патентной и в научной литературе весьма ограничены. В то же время показано в работе [Yannuzi et al. Am. J. Ophthalmol. 1974, Vol.78, No. 2, рр. 217-221], что чистота флуоресцеина и его лекарственной формы может влиять на побочные эффекты и переносимость инъекций. Поэтому очистке как флуоресцеина, так и ДСФ придается исключительно важное значение.
Так, для очистки промежуточного продукта - флуоресцеина рекомендуют использовать токсичный пиридин [Германский патент №136498], что является недостатком этого способа.
Получение ДСФ нейтрализацией флуоресцеина гидроксидом натрия по реакции (2) осложняется существованием различных ионных форм в зависимости от рН раствора [N. Klonis and W.H. Sawyer. J. of Luminescence. 1996. V. 6. №3. P. 147; R. Sjoback, J. Nygren, M. Kubista. Absorption and fluorescence properties of fluorescein. Spectrochimica Acta. Part A. 1955, L7-L21. P. 51] (схема 1).
Поэтому важное значение придается величине рН раствора флуоресцеина, так как недостаток основания приводит к неполной нейтрализации его карбокси- и оксигрупп, а его избыток - к повышению агрессивности инъекционного раствора. Так, величина рН 2%-ного раствора субстанции флуоресцеина натрия, нормируемая зарубежными фармстатьями [European Pharmacopeia, 2007. Edition 6. V. 2. Р. 1919; British Pharmacopeia. 2009, v. 3], составляет от 7,0 до 9,0. В то же время рН лекарственного препарата «Флуоресцеин Новартис» (Швейцария) на основе ДСФ имеет более высокие значения - 8,5-9,5, а фирма «Алькон» (США) для своего лекарственного препарата «Флуоресцеин» регламентирует рН от 8,0 до 9,8.
Приведенные данные по величине рН субстанций ДСФ и их лекарственных форм весьма противоречивы, а широкий рекомендуемый диапазон изменения рН субстанции вызывает сомнения, что является основанием для более глубокого изучения и оптимизации процесса нейтрализации флуоресцеина гидроксидом натрия (реакция 2).
Наиболее близкий к предлагаемому способу по технической сущности и достигаемому результату является способ получения стерильного водного раствора флуоресцеина в виде натриевой соли с содержанием 10-25%, суммарным количеством органических примесей не более 0,6% и хлоридов - менее 0,25% по массе флуоресцеина [патент РФ №2477284, С07D 493/10, 2013]. При этом очистку технического флуоресцеина производят диацетилированием технического флуоресцеина уксусным ангидридом с промежуточным выделением диацетилпроизводного с чистотой 99,7% и последующими операциями гидролиза диацетилфлуоресцеина в щелочной метанольной среде при кипячении, отгонки метанола, разбавления концентрата деионизованной водой, подщелачивания раствора до рН 8,5-8,7, обработки активированным углем и выделения из подкисленного этанольно-водного раствора (2:1) до рН 1,0-2,5 при охлаждении. Для получения флуоресцеина для инъекций в виде натриевой соли очищенный флуоресцеин нейтрализуют 7 н раствором гидроксида натрия до рН 9,3-9,5. Недостатками этого способа являются дополнительные стадии технологического процесса - синтез промежуточного продукта - диацетилфлуоресцеина, его выделение и гидролиз. Последний осуществляется с использованием большого количества токсичного растворителя - метанола. Кроме того, при получении лекарственной формы препарата не определяется точный рН полной нейтрализации флуоресцеина, а рекомендуется лишь его диапазон 9,3-9,5.
Задачей настоящего изобретения является упрощение технологии получения лекарственной формы препарата на основе ДСФ, обеспечивающей содержание органических и неорганических примесей в ней в соответствии с нормативной техдокументацией, и повышение экологической безопасности процесса. Для решения указанной задачи используют способ получения лекарственной формы препарата на основе ДСФ, состоящей из следующих технологических стадий:
- очистка технического флуоресцеина обработкой активированным углем в щелочной среде при кипячении с последующим выделением очищенного продукта из раствора хлористоводородной кислотой;
- получение технического флуоресцеина натрия нейтрализацией флуоресцеина гидроксидом натрия, обработкой полученного раствора активированным углем при кипячении и его выделение из раствора упариванием досуха;
- очистка технического флуоресцеина натрия обработкой продукта активированным углем при кипячении в абсолютированном этаноле с последующей частичной отгонкой растворителя;
- дополнительная очистка флуоресцеина натрия перекристаллизацией из абсолютированного этанола с последующей частичной отгонкой растворителя;
- получение лекарственной формы дополнительным взаимодействием очищенного флуоресцеина натрия с гидроксидом натрия до рН полной нейтрализации окси- и карбоксигрупп в флуоресцеине, определенного методами потенциометрии и кондуктометрии.
Поставленная в изобретении задача достигается определенным сочетанием традиционных методов очистки на всех технологических стадиях процесса. Очистку флуоресцеина осуществляют переосаждением из щелочного раствора, который обрабатывают активированным углем при кипячении.
На стадии получения технического флуоресцеина натрия нейтрализацией флуоресцеина гидроксидом натрия вводятся операции очистки щелочного и спиртового растворов активированным углем при кипячении, а также предусматривается дополнительная очистка перекристаллизацией очищенного флуоресцеина натрия из абсолютированного этанола.
Результаты нейтрализации флуоресцеина гидроксидом натрия до ДСФ приведены на фиг.1. Фиг 1: Изменение удельной электропроводности (1) и рН (2) раствора флуоресцеина, подкисленного соляной кислотой, при его нейтрализации гидроксидом натрия. Концентрация флуоресцеина 0,62 г/л.
Для улучшения смачиваемости флуоресцеина в воде суспензия подкислялась соляной кислотой, которая нейтрализуется гидроксидом натрия в начале титрования. Этому процессу соответствует линейный отрезок «а» на кондуктометрической кривой (1).
Неожиданным, как видно из фиг.1, оказалось то, что на кривой нейтрализации (2) в интервале рН 4,0-11,0 наблюдается лишь один скачок резкого изменения величины рН и не происходит селективной нейтрализации карбокси- и оксигрупп. Скачку рН на потенциометрической кривой соответствует излом линейных участков «b» и «с» изменения величины удельной электропроводности раствора на кондуктометрической кривой (1). Величина рН на кривой нейтрализации, соответствующая излому прямых участков изменения удельной электропроводности, является эквивалентной точкой нейтрализации флуоресцеина, составляющая 9,3. При рН 9,3 реакционного раствора достигается полная нейтрализация карбокси- и оксигрупп в флуоресцеине, так как при дальнейшем прибавлении гидроксида натрия рН раствора монотонно увеличивается, достигая величины 11,0-11,5, а удельная электропроводность при этом резко увеличивается, что указывает на избыток титранта.
Для оценки качества очищенного флуоресцеина натрия использовали метод ВЭЖХ, приведенный в Европейской Фармакопее [European Pharmacopeia, 2007. Edition 6. V. 2. Р. 1919], который обеспечивает контроль как идентифицированных, так и неидентифицированных примесей. К идентифицируемым примесям относят резорцин, фталевую кислоту и 2-(2,4-дигидроксибензоил) бензойную кислоту, которые были использованы в качестве свидетелей. Их хроматограммы приведены на фиг.2. Фиг.2:
Хроматограммы идентифицируемых примесей:
а) - смесь резорцина и фталевой кислоты; b) - 2-(2,4-дигидроксибензоил) бензойная кислота.
Установлено, что в полученных по предлагаемой технологии образцах очищенного флуоресцеина натрия не удалось обнаружить наличие следов фталевого ангидрида, резорцина и хлоридов. В то же время суммарное количество неидентифицированных примесей не превышает 0,5%, что допускается нормативной технической документацией [European Pharmacopeia, 2007. Edition 6. V. 2. Р. 1919; British Pharmacopeia. 2009]. Типичная хроматограмма очищенного флуоресцеина натрия приведена на фиг.3. Фиг.3: Типичная хроматограмма очищенного флуоресцеина натрия.
Полученный по предлагаемой технологии очищенный флуоресцеин натрия имеет рН 2%-ного раствора 8,5-8,6, что соответствует требованиям Европейской Фармакопеи [European Pharmacopeia, 2007. Edition 6. V. 2. Р. 1919]. Однако, как показали исследования кинетики нейтрализации флуоресцеина гидроксидом натрия (фиг.1), полная нейтрализация карбокси- и оксигрупп в флуоресцеине, приводящая к образованию ДСФ, достигается при рН раствора 9,3-9,4. Поэтому для ее получения в растворе для инъекций требуется дополнительная нейтрализация очищенного флуоресцеина натрия гидроксидом натрия. Для точного определения рН полной нейтрализации очищенного флуоресцеина натрия с учетом содержания основного вещества и влаги в нем используют комбинацию методов потенциометрического и кондуктометрического титрования (фиг. 4). Фиг. 4: Потенциометрическое (1) и кондуктометрическое титрование (2) субстанции флуоресцеина натрия 0,1 н раствором гидроксида натрия. Для этого взвешивают образец очищенного флуоресцеина натрия (точная навеска) и растворяют его в дистиллированной воде при перемешивании, а затем полученный раствор титруют 0,1 мл раствором гидроксида натрия, добавляя порциями по 0,1 мл. После каждого прибавления титранта раствор флуоресцеина натрия перемешивают в течение 2 минут и измеряют величину удельной электропроводности и рН раствора. По полученным данным строят зависимость рН - V (мл), а линейные участки («а» и «b») кондуктометрической кривой - в координатах ((См/м) - V (мл)) с использованием программы Microsoft Excel и находят для них уравнения: χ1=к1x+b1 и χ2=к2x+b2. Точка пересечения этих прямых при χ1=χ2 указывает на достаточный для обеспечения полной нейтрализации карбокси- и оксигрупп объем гидроксида натрия, а рН раствора на кривой зависимости рН - V (мл), соответствующий точке пересечения, характеризует достижение полной нейтрализация и эту величину можно рассматривать как точный технологический параметр при производстве инъекционного раствора лекарственной формы. Предлагаемый способ иллюстрируется следующими примерами.
Пример 1
Синтез и очистка флуоресцеина
В тигель из нержавеющей стали, снабженный мешалкой и термометром, загружают 357,4 г (2,41 моль) фталевого ангидрида, 521,8 г (2,65 моль) резорцина и нагревают до 180°С (температура в масляной бане 190°C). Затем постепенно (в течение ~ 20 мин) в реакционную смесь прибавляют 214,4 г безводного хлорида цинка, после чего температуру в массе повышают до 210°С и нагревают при этой температуре до отверждения реакционной массы. После этого сплав извлекают из тигля, измельчают и подвергают очистке.
Для очистки технический флуоресцеин загружают в трехгорлую колбу вместимостью 3 л, снабженную мешалкой и холодильником, добавляют в колбу 2300 мл водного раствора гидроксида натрия до рН 9,0, нагревают до кипения и обрабатывают раствор активированным углем марки OY-А ГОСТ 4453-74, который отфильтровывают через бумажный фильтр на воронке Бюхнера. Фильтрат охлаждают до комнатной температуры, переносят в стакан и медленно прибавляют к фильтрату концентрированной HCl до рН 3,0-4,0. При этом осаждается очищенный флуоресцеин, который отфильтровывают на воронке Бюхнера, промывают дистиллированной водой до нейтральной среды, отжимают на фильтре и сушат в сушильном шкафу.
Получено 640 г очищенного флуоресцеина с выходом 81,2%, считая на резорцин. Молярный коэффициент поглощения очищенного флуоресцеина в 0,01 М водном растворе гидроксида натрия при λмакс,=(491±2) нм составляет около 80000 дм3/моль см.
Синтез и очистка технического флуоресцеина натрия
В трехгорлую колбу вместимостью 4,0 л, снабженную мешалкой и холодильником, загружают 2850 мл очищенной воды и 121,3 г (3,03 моль) гидроксида натрия, после растворения гидроксида натрия загружают 471 г (1,417 моль) флуоресцеина и после перемешивания в течение 15 мин определяют рН реакционной смеси. Нагревают реакционную смесь до кипения и кипятят 10 мин, затем добавляют в колбу активированный уголь, кипятят еще 20 мин, отфильтровывают уголь через бумажный фильтр на воронке Бюхнера и промывают фильтр 600 мл очищенной воды. Полученный фильтрат упаривают досуха.
Для очистки технического флуоресцеина натрия его загружают в трехгорлую колбу, снабженную мешалкой и холодильником, затем заливают в колбу 4 л абсолютированного этанола, нагревают реакционную смесь до кипения и кипятят до полного растворения флуоресцеина натрия. Затем в колбу добавляют активированный уголь марки OY-А ГОСТ 4453-74, кипятят реакционную смесь еще 20 мин, отфильтровывают уголь через бумажный фильтр на воронке Бюхнера, а фильтрат упаривают до объема ~ 2100 мл, охлаждают до комнатной температуры и выдерживают при этой температуре до полного осаждения флуоресцеина натрия. Выпавший осадок очищенного продукта отфильтровывают на воронке Бюхнера, промывают 400 мл абсолютированного этанола и сушат.
Дополнительную очистку технического флуоресцеина натрия осуществляют перекристаллизацией из абсолютированного этанола. В стеклянную емкость заливают 2550 мл абсолютированного этанола, а затем при перемешивании мешалкой загружают в него 320 г технического флуоресцеина натрия. Полученную реакционную массу перемешивают, затем раствор кипятят на водяной бане и фильтруют на стеклянном фильтре под вакуумом.
Фильтрат упаривают до объема 850 мл, переносят в локальную чистую зону, загружают в стерильный цилиндрический сосуд и проводят кристаллизацию продукта при охлаждении. Продукт отфильтровывают с помощью вакуума, отжимают в течение 1 часа на фильтре и сушат в газовоздушном стерилизаторе. Полученный очищенный флуоресцеин натрия соответствует требованиям фармстатьи [European Pharmacopeia, 2007. Edition 6. V. 2. Р. 1919]. Показатели качества очищенного флуоресцеина натрия приведены в таблице.
| Показатели качества и нормы показателей очищенного флуоресцеина натрия | ||
| Наименование показателя | Нормативные показатели продукта | Фактические показатели продукта |
| 1 | 2 | 3 |
| 1. Внешний вид | Кирпично-красный порошок | Соответствует |
| 2. Растворимость | Легко растворим в воде, умеренно растворим в этаноле | Соответствует |
| 3. Инфракрасный спектр (ИК-спектр) в области от 4000 до 400 см-1 | Совпадение полос поглощения | Соответствует |
| 4 .Электронный спектр поглощения в области длин волн от 220 до 700 нм должен иметь максимумы, нм | (239±2), (284±2), (322±2), (491±2) | Соответствует |
| 5. Длина волны основного максимума в электронном спектре поглощения в фосфатном буфере с рН 8,0, нм | 491±2 | Соответствует |
| 6. Потеря в массе при высушивании (в пересчете на сухое вещество), %, не более | 15,0 | 13,5 |
| 7. Величина рН 2%-ного водного раствора | 7,0-9,0 | 8,4 |
| 8. Качественная реакция (на наличие флуоресценции) | Появление флуоресценции водного раствора | Соответствует |
| 9. Содержание основного вещества (в пересчете на сухое вещество), % | 95,0-102,0 | 99,1 |
| 10. Качественная реакция (на отсутствие цинка) | Отрицательная (отсутствие взвеси или суспензии) | Отрицательная |
| 11. Содержание хлоридов, %: не более | 0,25 | - |
| 12. Специфические примеси, %: резорцин, не более: фталевая кислота, не более 2-(2,4-дигидроксибензоил) бензойная кислота, не более Максимальное содержание единичной неидентифицирован-ной примеси, %, не более Суммарно неидентифицированных примесей, %, не более |
0,5 0,5 0,5 0,2 0,5 |
0,052 0,14 0,37 |
| 13. Содержание бактериальных эндотоксинов, не более | 0,28 ЕЭ на 1 мг флуоресцеина натрия | Соответствует |
| 14. Микробиологическая чистота | 104 аэробных бактерий, 102 грибов при отсутствии энтеробактерий, Escherichia coli, Salmonella, S. aureus. | Соответствует |
Получение лекарственного средства, содержащего 5,0% динатриевой соли флуоресцеина («Флуоресцеин натрия-5%»).
Перед производством лекарственного средства «Флуоресцеин натрия-5%», содержащего 5,0% ДСФ, предварительно в лабораторных условиях определяют величину рН полной нейтрализации конкретного очищенного флуоресцеина натрия, используя вышеописанную процедуру (см. стр.). Для полученного очищенного флуоресцеина натрия рН полной нейтрализации составляет величину 9,3, которая является контрольной точкой при производстве лексредства.
Очищенный флуоресцеин натрия в количестве 150 г с содержанием влаги 13,5% отвешивают с точностью 0,01 г на весах и загружают в емкость. После чего в эту емкость заливают около 2200 мл воды для инъекций. Осуществляют перемешивание магнитной мешалкой полученного раствора до полного (визуально) растворения флуоресцеина натрия в воде. После этого добавляют 15 мл 2,0%-ного раствора гидроксида натрия, перемешивают раствор магнитной мешалкой и измеряют его рН. Если рН раствора не достигает 9,3, его доводят до этой величины.
Затем добавляют оставшееся количество воды для инъекций до объема раствора 2650 мл и снова перемешивают в течение 15-20 мин, а затем измеряют рН раствора, при необходимости его корректируют. После этого отбирают пробу для анализа по показателю «Количественное определение». Содержание ДСФ в 1 мл раствора составляет 49,0 мг/мл, что соответствует нормативной документации (от 45 до 52,5 мг/мл).
Приготовленный раствор ДСФ передают на стадию мембранной стерилизующей фильтрации с последующей фасовкой.
Пример 2
Получение лекарственного средства, содержащего 10,0% динатриевой соли флуоресцеина («Флуоресцеин натрия-10%»).
Получение и очистку флуоресцеина и натриевой соли флуоресцеина осуществляют аналогично примеру 1.
Определение величины рН полной нейтрализации очищенного флуоресцеина натрия проводят аналогично примеру 1. Для очищенного флуоресцеина натрия рН полной нейтрализации составляет 9,36. Эта величина рН является контрольной точкой при производстве лекарственного средства «Флуоресцеин натрия-10%».
Очищенный флуоресцеин натрия в количестве 150 г с содержанием влаги 11,8% отвешивают с точностью 0,01 г на весах и загружают в емкость. После чего в нее заливают около 1000 мл воды для инъекций. При помощи магнитной мешалки осуществляют перемешивание полученного раствора в течение 10-15 мин до полного (визуально) растворения флуоресцеина натрия в воде. После этого добавляют 2,0%-ный раствор гидроксида натрия, перемешивают раствор в течение 30-40 мин и измеряют его рН. Если рН раствора не достигает 9,36, то добавляют еще 2,0%-ный раствор гидроксида натрия и перемешивают раствор.
После достижения рН раствора 9,36 добавляют оставшееся количество воды для инъекций до объема раствора 1350 мл и снова перемешивают магнитной мешалкой, а затем измеряют рН раствора. После этого отбирают пробу для анализа по показателю «Количественное определение». Содержание ДСФ в 1 мл раствора составляет 98,0 мг/мл, что соответствует нормативной документации (от 90 до 105 мг/мл).
Приготовленный раствор ДСФ передают на стадию мембранной стерилизующей фильтрации с последующей фасовкой.
Таким образом, предлагаемый способ позволяет упростить по сравнению с прототипом технологию получения лекарственного препарата в виде 5-10%-ного инъекционного раствора ДСФ за счет исключения технологических стадий синтеза и выделения промежуточного продукта - диацетилфлуоресцеина, гидролиза диацетилпроизводного в кипящей метанольной щелочи, а также сделать процесс более экологически безопасным благодаря исключению токсичного метанола.
Способ получения лекарственной формы препарата на основе динатриевой соли флуоресцеина очисткой и выделением технического флуоресцеина с последующим получением лекарственной формы взаимодействием очищенного флуоресцеина с гидроксидом натрия при контролируемом рН раствора, отличающийся тем, что технический флуоресцеин чистят обработкой в щелочной среде активированным углем при кипячении и выделяют очищенный продукт соляной кислотой, взаимодействие его с раствором гидроксида натрия проводят при кипячении с активированным углем, а очистку полученного таким образом флуоресцеина натрия осуществляют обработкой активированным углем при кипячении в абсолютированном этаноле с последующей дополнительной очисткой перекристаллизацией из абсолютированного этанола, а получение лекарственной формы проводят до рН полной нейтрализации карбокси- и оксигрупп во флуоресцеине, определяемой совместно методами потенциометрии и кондуктометрии.
