Антитромботический комплекс на основе гепарина, способ его получения и применение

Группа изобретений относится к области медицины и фармакологии, а именно к антитромботическому комплексу на основе гепарина, который содержит высокомолекулярный гепарин и глутаминовую кислоту в соотношении (1±0.3)М монозвена гепарина на (1±0.3)М глутаминовой кислоты, к способу его получения и применения в качестве антикоагулянтного, антитромбоцитарного, фибринолитического, фибриндеполимеризационного и снижающего свертывание крови средства. Группа изобретений обеспечивает увеличение выхода готового препарата и повышение его антикоагулянтного, фибринолитического и антитромбоцитарного действия. 3 н. и 3 з.п. ф-лы, 3 пр., 2 табл.

 

Изобретение относится к медицине и фармакологии и касается создания средств на основе гепарина, обладающих антикоагулянтным, антитромбоцитарным, фибринолитическим действием на организм.

Наиболее часто в медицине в качестве антикоагулянтных средств используются препараты на основе гепарина и его производных.

Гепарин является естественным противосвертывающим фактором и относится к антикоагулянтам прямого действия, т.е. непосредственно влияет на факторы свертывания крови. Гепарин обладает не только антикоагулянтным действием, но в некоторой степени может активировать фибринолитические свойства крови и улучшать коронарный кровоток [Клиническая биохимия / под ред. В.А. Ткачука. 2-е изд., испр. и доп. М.: ГЭОТАР-МЕД, 2004. 512 с.].

Противосвертывающее действие гепарина проявляется in vitro и in vivo при внутривенном, внутримышечном и подкожном его введении. Гепарин действует быстро, но относительно кратковременно.

Гепарин применяют при профилактике и терапии различных тромбоэмболических заболеваний и их осложнений. Однако ему присущ ряд отрицательных свойств, таких как тромбоцитопения и аллергические реакции немедленного типа (крапивница, ангионевротический отек или бронхоспазм), при передозировке - возможность развития геморрагии.

Известны антикоагулянтные средства животного происхождения, представляющие собой фрагмент коллагена с М.М. около 12 кДа, содержащий 10,0-12,0% углеводов, 6,0-7,5% сульфатных групп, микро- и макроэлементы [патент РФ №2302250, А61К 35/56, 2007.07.10].

Известно антикоагулянтно-фибринолитическое средство, включающее пептид "Семакс" и гепарин, описанный в патенте РФ №2138289 (А61К 31/725, 1999.09.27). Наименование пептида "Семакс" утверждено решением Фармакологического комитета МЗ РФ от 11.11.93

Указанные средства обладают иным механизмом антикоагулянтного действия, чем механизм действия гепарина, однако способ получения их сложен и длителен и, кроме того, антитромбоцитарное и антикоагулянтное действие их недостаточно.

Гепарин часто используют в сочетании с ферментными фибринолитическими препаратами.

Известно антикоагулянтно-фибринолитическое средство комплекса высокомолекулярного гепарина с протеолитическим ферментом тромбином. Препарат эффективен лишь при внутривенном и внутримышечном введениях. Небольшая длительность действия препарата - 1,5-2,0 часа и наличие побочных эффектов не позволяет его широко использовать в медицинской практике [Ж. "Биохимия животных и человека", "Неферментативный фибринолиз", Ляпина Л.А. и др. г. Киев 1982, №6, с. 64-73].

Известна терапевтическая композиция, обладающая антикоагулянтной активностью на основе комплексов гепарина с веществами, усиливающими антикоагулянтное действие, в частности с аминокислотами, такими как аспарагиновая, антраниловая, р-аминобензойная, а также с глицином, валином и β-аланином [Патент США №3577534, Кл. С08В 37/10. 1971.05.04].

К недостаткам известной композиции следует отнести отсутствие фибринолитических и антитромбоцитарных свойств получаемых продуктов.

Известен тромболитический комплекс гепарина с ферментом трипсином, взятых в соотношении 1:6. Однако использование трипсина придает полученному продукту токсичные протеолитические свойства. Более того, получаемый препарат активен только при внутривенном или внутримышечном введении [Mansfeld V, Hladovec J. Studien über Reactionen des Kristallisierten Trypsins.II.Beziehung zwischen der Aktivität des Heparins und Trypsins-"Collection of Czechoslovak chemical communication]", 1957, т.21, №5, с.1209].

Наиболее близким решением к заявляемому средству по фармакологическому действию является антитромботическая композиция, включающая глутаминовую кислоту и гепарин, описанная в статье Ляпиной Л.Α., Зиадетдиновой Г.А. «Комплексное соединение гепарина с глутаминовой кислотой: получение и его влияние на показатели гемостаза in vitro и in vivo» // Известия РАН. Серия биологическая. 2001. №1. С.82-86.

В известной композиции использованы препарат высокомолекулярного гепарина фирмы Sigma (Германия) с мол. массой 20000 Да и глутаминовая кислота фирмы «Реахим». Указанное средство получают смешением жидкого гепарина с мол. массой 20000 Да и глутаминовой кислоты с мол. массой 147 Да в молярном соотношении глутаминовая кислота:гепарин равном 1:1 (весовое соотношение 136:1), осаждением при рН 4.0 в течение 2-х часов при комнатной температуре с последующим центрифугированием в течение 10-15 мин при комнатной температуре и высушиванием. Препарат обладает антикоагулянтно-фибринолитическим действием при концентрации 10-1 мг/мл. Недостатком указанного средства является его невысокое антикоагулянтное и фибринолитическое действие и малый выход препарата (до 40-50%).

Все вышеизложенное позволяет сделать вывод, что поиск новых эффективных и безопасных антикоагулянтов и фибринолитиков остается до настоящего времени чрезвычайно актуальным.

В основу настоящего изобретения положена задача создания средства, обеспечивающего повышение широкого спектра его противосвертывающих активностей, при повышении эффективности способа с увеличением выхода готового препарата от первоначальной концентрации веществ.

Технический результат достигается за счет получения препарата, обладающего более выраженным антикоагулянтным, фибринолитическим (суммарным, ферментативным и неферментативным) и антитромбоцитарным действием.

Для определения оптимальных соотношений исходных концентраций гепарина и глутаминовой кислоты для образования комплекса, обладающего высокой антикоагулянтной и фибринолитической активностями, была разработана термодинамическая модель химических равновесий системы, включающий высокомолекулярный гепарин (Na4 hep), глутаминовую кислоту (Н2Glu), хлорид кальция (СаСl2) и 0.15М NaCl. Активность комплекса гепарина с глутаминовой кислотой основана на снижении в плазме крови равновесной концентрации иона Са2+ (активатора неактивных факторов плазмы крови, как в первой фазе ферментативного каскада реакций, так и во второй фазе фибринолиза) вследствие образования с ним смешаннолигандного комплекса.

Термодинамическая модель равновесий была рассчитана на основе математического моделирования химических равновесий в системе СаСl2-Na4hep - H2Asp - Н2О - NaCl по компьютерной программе AUTOEQUIL (Кирьянов Ю.А., Николаева Л.С. Свидетельство о государственной регистрации программы на ЭВМ №2008512267 AUTOEQUIL) по данным рН-метрии в физиологическом растворе, адекватном раствору плазме крови по величине ионной силы 0.15М NaCl, температуре (37°С и диапазону изменения концентраций компонент системы n10-3 M, n≤4). Полимерный гепарин был представлен совокупностью мономерных звеньев. Модель идентифицировала в области рН плазмы доминирующий комплекс гепарина с глутаминовой кислотой HhepGlu5- и наиболее устойчивый смешаннолигандный комплекс иона кальция Са2+ с гепарином и глутаминовой кислотой CaHhepGlu-. Комплекс HhepGlu5- из-за образования комплекса CaHhepGlu- уменьшает равновесную концентрацию иона Са2- в 72 раза больше, чем ион Са2+ с чистым гепарином.

Результаты расчета термодинамической модели доказывают, что молярное соотношение исходных концентраций 1:1 монозвена гепарина и глутаминовой кислоты является оптимальным для проявления максимальной антикоагулянтной и фибринолитической активностей комплексной системы высокомолекулярный гепарин - глутаминовая кислота. В этом существенное отличие предлагаемого способа от прототипа, использующего молярное соотношение 1:1 исходных концентраций полимерного гепарина и глутаминовой кислоты.

Согласно результатам термодинамической модели предлагаемое средство получают смешением жидкого гепарина в расчете на концентрацию монозвена с молекулярной массой 600 Да и глутаминовой кислоты в эквимолярном соотношении глутаминовая кислота:гепарин равном 1:1 в молях (1±0.02)М, выдерживанием при температуре 36-37°С в течение 20-30 мин, осаждением после добавления охлажденного чда ацетона и изменения рН до 3.0-4.0 при температуре +4-+6°С в течение 30 мин с последующим центрифугированием при 1800 об/мин в течение 15-18 мин при комнатной температуре и высушиванием. Выход препарата составляет до 70% от первоначальной концентрации веществ.

Таким образом, поставленная задача решается настоящим изобретением тем, что антитромботический комплекс на основе гепарина согласно изобретению содержит высокомолекулярный гепарин и глутаминовую кислоту в соотношении (1±0.3)М монозвена гепарина на (1±0.3)М глутаминовой кислоты.

Поставленная задача решается также способом получения антитромботического комплекса на основе гепарина. В способе получения антитромботического комплекса на основе гепарина, включающего перемешивание гепарина и глутаминовой кислоты согласно изобретению, используют в качестве гепарина жидкий или сухой гепарин при соотношении (1±0.3)М монозвена гепарина на (1±0.3)М глутаминовой кислоты.

Поставленная задача решается также применением антитромботического комплекса на основе гепарина в виде его (1±0.3)М раствора в качестве антикоагулянтного, антитромбоцитарного, фибринолитического, фибриндеполимеризационного и снижающего свертывание крови средства.

Препарат обладает высоким антикоагулянтным, дополнительным антитромбоцитарным, фибриндеполимеризационным действием и удлиняет тромбоэластографические параметры показателей начала, конца образования сгустка, его эластичность, т.е. улучшает реологические свойства (текучесть) крови.

Эксперимент проводили следующим образом.

В условиях in vitro исходный комплекс и его разведения проверяют на наличие фибриндеполимеризационной активности (фибринолитическую активность неферментативной природы), используя нестабилизированные фактором ХIIIа фибриновые пленки. При добавлении композиции к нормальной плазме крови крыс проверяют антикоагулянтные, фибринолитические (ферментативной и неферментативной природы), антитромбоцитарные ее свойства, а также эластичность сгустка и другие тромбоэластографические параметры, свидетельствующие о реологических свойствах крови.

В образцах крови определяли антикоагулянтную активность по тесту активированного частичного тромбопластинового времени (АЧТВ), суммарную (СФА) и неферментативную (НФ), ферментативную (ФФ) фибринолитическую активность, агрегацию тромбоцитов, параметры тромбоэластограммы.

Ниже представлены примеры, иллюстрирующие заявляемое изобретение.

Пример 1.

К 1 мл (1 ME) исходного коммерческого препарата гепарина фирмы Serva (Германия) в расчете на концентрацию (1±0.3)М монозвена добавляют (1±0.3)М глутаминовой кислоты, перемешивая их в течение 20-30 мин. При 36-37°С далее к смеси добавляют 4-6-кратный объем (6 мл) охлажденного ацетона, изменяют рН до 3.0, оставляют на 30 мин в холодильнике при +4-6°С до применения. Далее центрифугируют при 1800 об/мин в течение 15 мин, полученный осадок высушивают при комнатной температуре.

В условиях in vitro полученный препарат обладает высоким фибриндеполимеризационным эффектом, составляющим 200 мм2 (в контроле - 0 мм2), а при добавлении к плазме крови крыс обнаруживает суммарную фибринолитическую активность, равную 159%, фибриндеполимеризационную активность, равную 200%, антикоагулянтная активность составляет 258% от контроля, принятого за 100%, агрегация тромбоцитов снижается до 10%, по данным тромбоэластограммы показатели R (начало образования сгустка) удлиняются на 100%, К (скорость свертывания) на 17%, ma - максимальная амплитуда (свидетельствует о количестве фибриногена крови - на 8%, Ε - эластичность или прочность сгустка увеличивается в 2 раза, S - константа синерезиса (отражает всю фазу свертывания фибриногена) увеличивается на 27%, Т - тотальная константа свертывания увеличивается на 44%, индекс коагуляции уменьшается на 70%.

Полученный комплекс обладает максимальным суммарным и неферментативным фибринолитическим эффектом, а также значительным антикоагулянтным и, что важно, значительным антитромбоцитарным действием в кровотоке после его добавления к плазме крови животных (крыс). Кроме того, по данным тромбоэластограммы препарат увеличивает прочность сгустка, индекс свертывания (коагуляции) уменьшается, а все фазы свертывания крови увеличиваются, что свидетельствует о его высоком спектре противосвертывающих свойств и его способности улучшать реологию крови.

Прототип проявлял антикоагулянтные и фибриндеполимеризационные свойства в концентрации 10-1 M на 20-25% ниже, чем полученный комплекс в широком диапазоне концентраций 10-9-10-1 М.

Пример 2.

Смешивают 10 ME раствора гепарина и 1М глутаминовой кислоты, далее поступают как описано в примере 1.

Полученный комплекс (доза гепарина в 10 раз выше, чем в примере №1) обнаруживает в плазме крови 180% антикоагулянтной активности, 115% фибриндеполимеризационной активности, 114% суммарной фибринолитической активности и не обнаруживает антикоагулянтной и антитромбоцитарной активности. Из-за избытка гепарина полученная композиция обладает слабым суммарным и неферментативным фибринолитическим эффектом и не обладает антитромбоцитарным действием в кровотоке после его перорального введения животным, недостоверно меняет показатели тромбоэластограммы крови.

Пример 3.

Смешивают 0.1 МЕ раствора гепарина и 1М глутаминовой кислоты, далее поступают как в примере №1.

Полученный комплекс не обнаруживает в плазме крови антикоагулянтной, фибриндеполимеризационной активности, суммарной фибринолитической и антитромбоцитарной активности. Следовательно, полученная композиция (доза гепарина в 10 раз ниже, чем в примере №1), из-за недостатка гепарина не обладающая антикоагулянтным, суммарным фибринолитическим, фибриндеполяризационным и антитромбоцитарным действием, и не изменяет параметры тромбоэластограммы крови в условиях in vitro. Для примера 1 показатели плазменного и тромбоцитарного гемостаза после добавления к плазме крови комплекса с гепарином (М±m) приведены в таблице 1. Статистические показатели рассчитаны относительно соответствующих проб контроля (р<0.05, ∗р<0.01).

Примечание к табл. 2. Запись проведена на приборе Hellige (Германия).

Удлинение времени реакции - R, К, Т, S свидетельствует об активации антикоагулянтного звена противосвертывающей системы; Е указывает на значительную эластичность сгустка, на некоторое снижение функциональной активности тромбоцитов и уменьшение количества фибриногена в опыте.

Таким образом, комплекс (1±0.3)М монозвена гепарина + (1±0.3)М глутаминовой кислоты обладает in vitro высокой антикоагулянтной, антитромбоцитарной, суммарной фибринолитической, фибриндеполимеризационной активностью даже в присутствии блокаторов ферментативного фибринолиза, улучшает реологические свойства крови, повышая параметры тромбоэластограммы (эластичность или прочность сгустка, максимальную амплитуду, константу синерезиса, снижая индекс коагуляции). Выход препарата повышается на 20-25%. Комплекс стабилен при хранении при +4-+6°С более 6-ти месяцев. Способ получения его экономически выгоден. Выход препарата составляет до 70% от первоначальной концентрации веществ.

1. Антитромботический комплекс на основе гепарина, характеризующийся тем, что он содержит высокомолекулярный гепарин и глутаминовую кислоту в соотношении (1±0.3)М монозвена гепарина на (1±0.3)М глутаминовой кислоты.

2. Антитромботический комплекс по п. 1, характеризующийся тем, что в качестве высокомолекулярного гепарина использован гепарин с молекулярной массой 20000 Да.

3. Способ получения антитромботического комплекса на основе гепарина по п. 1, включающий перемешивание гепарина и глутаминовой кислоты, где в качестве гепарина используют жидкий или сухой высокомолекулярный гепарин при соотношении (1±0.3)М гепарина в расчете на монозвено на (1±0.3)М глутаминовой кислоты, выдерживание полученной смеси при температуре 36-37°С в течение 20-30 мин с последующими осаждением, центрифугированием и высушиванием осадка при комнатой температуре.

4. Способ по п. 3, характеризующийся тем, что осаждение проводят после добавления охлажденного чда ацетона и изменения рН до 3.0-4.0 при температуре +4-+6°С в течение 30 мин.

5. Способ по п. 3, характеризующийся тем, что центрифугирование осадка осуществляют при 1800 об/мин в течение 15-18 мин при комнатной температуре.

6. Применение антитромботического комплекса на основе гепарина по п. 1 в качестве антикоагулянтного, антитромбоцитарного, фибринолитического, фибриндеполимеризационного и снижающего свертывание крови средства.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к медицине, а именно к коагулогии, и касается лечения подострых венозных тромбозов различной локализации. Для этого вводят препарат дабигатрана «Парадакса» в индивидуально подобранной дозе, которую определяют как обеспечивающую через 2 часа после введения уровень тромбинового времени 100-200 секунд.

Изобретение относится к соединениям формулы IA или IB или их фармацевтически приемлемым солям. Соединения формулы IA или IB обладают sGC-стимулирующей активностью.

Изобретение относится к новому соединению формулы (I) или его фармацевтически приемлемой соли, обладающим свойствами ингибитора коагуляции крови. Соединения могут найти применение при заболеваниях, вызванных образованием тромба, таких как тромбоз, тромбоз глубокой вены, легочная эмболия, церебральный инфаркт, инфаркт миокарда, острый коронарный синдром, сосудистый рестеноз, синдром диссеминированной внутрисосудистой коагуляции или злокачественная опухоль.

Изобретение относится к способу получения 5-xлop-N-({(5S)-2-оксо-3-[4-(3-оксо-4-морфолинил)-фенил]-1,3-оксазолидин-5-ил}метил)-2-тиофенкарбоксамида, представленного формулой I, в модификации (II) (его вариантам).

Изобретение относится к области фармацевтики, фармакологии и может быть использовано в клинической медицине для лечения тромбоцитоза при раке и лимфомах. Капли, обладающие антикоагулирующими свойствами, представляют собой настойку цветков клевера лугового и цветков пижмы обыкновенной на 95%-ном этиловом спирте, при содержании 250-450 мкг субстанции в 1 мл настойки.

Изобретение относится к N,N′-замещенным пиперазинам формулы I и способу получения соединений формулы II. Указанные соединения влияют на систему гемостаза и проявляют антиагрегантные, антикоагулянтные и вазодилаторные свойства.

Изобретение относится к фармацевтической композиции, обладающей эндотелиопротекторным, антиагрегационным, повышающим работоспособность действием, улучшающей психоэмоциональный и когнитивно-мнестический статус организма.

Изобретение относится к новым соединениям общей формулы (I), которые обладают Btk-селективной ингибирующей активностью (ингибиторы тирозинкиназы Брутона). При этом соединения проявляют метаболическую устойчивость и не обладают гепатотоксичностью, то есть являются безопасными терапевтическими средствами для лечения заболеваний, в которых задействованы В-клетки или мастоциты.

Изобретение относится к медицине и может быть использовано как антиагрегантное и антикоагулянтное средство. Для этого применяют 7-О-гентиобиозид формононетина, который выделен из суммарного спиртового экстракта корней Maackia amurensis.

Настоящее изобретение относится к соединениям, охарактеризованным общей формулой (I), в которой А представляет собой двухвалентный ароматический радикал, выбранный из групп, имеющих формулы, приведенные ниже, а остальные радикалы и группы имеют значения, приведенные в формуле изобретения.

Изобретение относится к медицине, а именно к пульмонологии, и может быть использовано для терапии синдрома контузии органов средостения и профилактики вентилятор-ассоциированных пневмоний.
Изобретение относится к медицине и может быть использовано при интракопоральной детоксикации, преимущественно проводимой в стационарных условиях. Для этого используют раствор, содержащий альбумин, фраксипарин, диализирующий раствор.

Изобретение относится к области медицины, а именно к дерматологии, и описывает способ лечения дерматозов, основанный на дезинтоксикации организма пациента путем связывания токсинов с использованием энтеросорбента и их выведением.

Изобретение относится к применению дерматансульфата, выделенного из сулодексида для лечения заболеваний, в которые вовлечена металлопротеиназа ММР-9: варикозного расширения вен и сосудистых патологий с риском тромбоза.

Изобретение относится к медицине, а именно к кардиологии, и касается профилактики развития постперикардиотомного синдрома у больных ишемической болезнью сердца, подвергшихся коронарному шунтированию.
Изобретение относится к медицине, а именно к хирургии и онкологии, и касается профилактики развития послеоперационных венозных тромбоэмболических осложнений у пациентов с колоректальным раком.
Изобретение относится к медицине, а именно хирургии, и может быть использовано для усиления гемоциркуляции в шовной полосе межкишечного анастомоза в эксперименте.

Группа изобретений относится к области фармацевтики и касается фармацевтической композиции в виде мягкой лекарственной формы для лечения заболеваний опорно-двигательного аппарата, обладающей противовоспалительным, обезболивающим и противоотечным действием, включающей комбинацию гепарина натриевой соли, декспантенола, моноэтилового эфира диэтиленгликоля и/или диметилсульфоксида и целевых добавок.
Изобретение относится к химии и представляет собой продукт слияния, который включает полисахариды Т1 и Т2, при этом моносахариды, из которых образованы полисахариды Т1 и Т2, соединены друг с другом альфа-1,4-гликозидными связями.

Изобретение относится к области медицины, а именно к эндокринологии, и касается лечения нейропатических трофических язв при синдроме диабетической стопы. Для этого осуществляют комплексное лечение, включающее введение Октолипена и Сулодексида внутривенно, затем перорально, а также введение Конвалиса при парастезиях и болях в икроножных мышцах и стопах.

Изобретение относится к области нанотехнологии, в частности к способу получения нанокапсул, и описывает способ получения нанокапсул креатина, характеризующийся тем, что в качестве оболочки используется геллановая камедь, а в качестве ядра используется креатин, при осуществлении способа креатин диспергируют в суспензию геллановой камеди в гексане в присутствии поверхностно-активного вещества е472с, при этом массовое соотношение ядро:оболочка при пересчете на сухое вещество составляет 1:1 или 1:3, затем при перемешивании приливают этилацетат, полученную суспензию отфильтровывают и сушат при комнатной температуре.

Группа изобретений относится к области медицины и фармакологии, а именно к антитромботическому комплексу на основе гепарина, который содержит высокомолекулярный гепарин и глутаминовую кислоту в соотношении М монозвена гепарина на М глутаминовой кислоты, к способу его получения и применения в качестве антикоагулянтного, антитромбоцитарного, фибринолитического, фибриндеполимеризационного и снижающего свертывание крови средства. Группа изобретений обеспечивает увеличение выхода готового препарата и повышение его антикоагулянтного, фибринолитического и антитромбоцитарного действия. 3 н. и 3 з.п. ф-лы, 3 пр., 2 табл.

Наверх