Способ оценки функционального состояния растений in vitro без нарушения стерильности



Способ оценки функционального состояния растений in vitro без нарушения стерильности
Способ оценки функционального состояния растений in vitro без нарушения стерильности
Способ оценки функционального состояния растений in vitro без нарушения стерильности
Способ оценки функционального состояния растений in vitro без нарушения стерильности

 


Владельцы патента RU 2604302:

федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Мичуринский государственный аграрный университет" (ФГБОУ ВО Мичуринский ГАУ) (RU)

Изобретение относится к области сельского хозяйства, биологии и физиологии растений. В способе оценивают функциональное состояние растений in vitro путем определения параметров флуоресценции хлорофилла. При этом регистрируют динамику изменения сигнала медленной индукции флуоресценции хлорофилла в диапазоне длин волн от 670 до 760 нм в течение 10-30 с. Рассчитывают скорость изменения сигнала МИФХ на 10-30 секунде после достижения максимального уровня флуоресценции FM, рассчитывают значение виртуального стационарного уровня флуоресценции методом экстраполяции полученных данных для 120-300 секунды виртуальных измерений, определяют величину удельной фотосинтетической активности по формуле . О функциональном состоянии растений судят по соотношению значения удельной фотосинтетической активности, полученной в результате экстраполяции, и скорости изменения сигнала МИФХ - чем выше один или оба параметра, тем лучше функциональное состояние растений in vitro. Способ позволяет сохранять жизнеспособность растений, оценить функциональное состояние и жизнеспособность клеток, тканей и органов растений in vitro без нарушения стерильности среды обитания, а также выявлять степень устойчивости растений к различным неблагоприятным факторам. 1 ил., 1 пр., 3 табл.

 

Изобретение относится к биологии, физиологии растений и сельскому хозяйству и позволяет оценить функциональное состояние и жизнеспособность клеток, тканей и органов растений in vitro без нарушения стерильности среды обитания, в том числе при оптимизации условий выращивания, а также для выявления степени устойчивости растений к различным неблагоприятным факторам и т.п.

В настоящее время при выращивании растений в культуре ткани используют визуальный контроль за состоянием растений [1, 2). Однако он не позволяет выявить наиболее важный физиологический параметр - активность фотосинтезирующего аппарата. Известны методы оценки функционального состояния растений, основанные на определении количественного содержания фотосинтезирующих пигментов и их качественного состояния по фотометрическим параметрам, когда определяются коэффициенты пропускания, отражения или поглощения на определенных длинах волн [3, 4]. Однако данные методы и реализующая их аппаратура в принципе не позволяют получить достоверную информацию. Получаемые фотометрические коэффициенты в существенной степени зависят от геометрии расположения объекта в оптическом тракте, и она должна быть строго фиксированная и неизменная, что при работе с культурой ткани без нарушения ее стерильности невозможно.

Наиболее близким к заявляемому способу являются методы определения функционального состояния растений по параметрам медленной индукции флуоресценции хлорофилла (МИФХ), когда в течение нескольких десятков секунд снимают кривую Каутского и о функциональном состоянии судят по удельной фотосинтетической активности Y, которая определяется как

Y = ( F м F c ) / F c , ( 1 )

где Fм - максимальный уровень сигнала флуоресценции, определяемый в течение первых 2-5 секунд возбуждения флуоресценции, Fc - стационарный уровень сигнала флуоресценции, определяемый на 120-180 секунде возбуждения флуоресценции [5-8]. Данный критерий является относительным и поэтому может использоваться для работы с растениями, находящимися в пробирках или колбах и по-разному ориентированных в зоне измерений относительно источника и приемника оптического излучения [8]. Недостатками данного метода является длительное время проведения измерений - не менее 2 минут. Растения в культуре ткани отличаются от полевых существенно меньшим порогом устойчивости к фотоокислению. Поэтому в процессе измерений высокие уровни оптического излучения, используемые для возбуждения флуоресценции, могут привести к фотодеструктивному повреждению хлоропластов. Основная проблема заключается в том, что и процессы индукции флуоресценции и процессы фотодеструкции отражаются на стационарном уровне кривой Каутского одинаково. В результате происходит завышение оценки удельной фотосинтетической активности из-за наличия фотодеструкции. Кроме этого, растения получают необратимые фотодеструктивные повреждения, что сказывается на их последующей жизнедеятельности. Заведомо низкие уровни возбуждающего излучения устанавливать неэффективно, так как в этом случае не происходит достаточного восстановления реакционных центров фотосистемы 2 (ФС 2), и значение удельной фотосинтетической активности определяется с занижением ее истинной величины.

Целью данного изобретения является увеличение достоверности информации о функциональном состоянии растений in vitro без нарушения стерильности среды, а также сохранение жизнеспособности растений.

Способ осуществляется следующим образом. Оптическое излучение с длиной волны 460…470 нм и выходной мощностью 4…7 мВт направляют через стенку сосуда (пробирки, колбы) на хлорофилл-содержащий участок растения in vitro, регистрируют динамику изменения сигнала МИФХ в диапазоне длин волн от 670 до 760 нм в течение 10-30 секунд, рассчитывают скорость изменения сигнала МИФХ на 10…30 секунде после достижения максимального уровня флуоресценции FM, рассчитывают значение виртуального стационарного уровня флуоресценции F c методом экстраполяции полученных данных для 120…300 секунды виртуальных измерений и определяют величину удельной фотосинтетической активности по формуле

Y = ( F м F c ) / F c , ( 2 )

Функциональное состояния растений in vitro оценивается по соотношению значения удельной фотосинтетической активности, полученной в результате экстраполяции и скорости изменения сигнала МИФХ - чем выше один или оба параметра, тем лучше функциональное состояния растений in vitro. Благодаря тому, что измерительный цикл сокращается, уменьшается доза излучения до уровней, не приводящих к фотодеструктивным повреждениям клеток, и данный способ можно использовать для оценки активности фотосинтетического аппарата растений in vitro.

Устройство для осуществления предлагаемого способа включает источник оптического излучения синей области спектра (460…470 нм) 1; блок управления мощностью источника 2; регистратор интенсивности рассеянного объектом излучения 3, предварительный усилитель с блоком оцифровки сигналов 4; интерфейс 5; расчетное устройство 6 (фиг. 1). Поток монохроматического излучения направляется на актуальную зону измеряемого объекта 7. Рассеянное от объекта 7 излучение воспринимается регистратором 3, где оптическое излучение преобразуется в электрический сигнал, пропорциональный МИФХ (690-740 нм), и направляется в блок 4 для усиления и оцифровки. С помощью интерфейса 5 данные передаются в расчетное устройство 6, производящее расчет скорости изменения сигнала МИФХ, экстраполяцию кривой МИФХ на 120…300 секунд виртуального времени измерений по 10…30 секундам реального времени измерений и определение удельной фотосинтетической активности на заданное виртуальное время измерений. В качестве расчетного устройства может использоваться компьютер, оснащенный специализированной программой.

Пример. Способ был применен для инструментальной оценки влияния ультрафиолетового излучения на функциональное состояние микропобегов ежевики сорта Блэк сэтин. Для атонального размножения in vitro применяли питательную среду по прописи Murashige, Skoog (MS) [9] с добавлением 1,0 мг/л 6-бензиламинопурина (6-БАП), 0,1 мг/л β-индолил-3-масляной кислоты (ИМК) и 1,0 мг/л гибберелловой кислоты. Культивирование осуществляли при 16-часовом световом дне, освещенности 2500 лк (люминесцентные лампы) и температуре 23±2°С. Через несколько дней после высадки на питательную среду экспланты были подвергнуты облучению ультрафиолетовым излучением УФ-А (300-400 им по уровню 0,1 спектральной кривой) дозами 180 и 540 кДж/м2. Через 1 час после облучения ультрафиолетом и далее в то же самое время суток каждые 24 часа в течение последующих 4 дней проводили оценку функционального состояния фотосинтетического аппарата растений in vitro по заявленным способу и устройству. Запись медленной индукции флуоресценции осуществляли в течение 20 секунд при интенсивности возбуждающего излучения 6500 мкМ/м2с с длиной волны 470±10 нм. Измерения осуществляли через стеклянные стенки колб, без нарушения стерильности культуры, выбирая участки листовой поверхности микропобегов, максимально приближенных к стенке колбы. Определяли максимальный уровень флуоресценции, скорость спада флуоресценции на 5, 10 и 15 секунде от времени отсчета максимума, осуществляли экстраполяцию полученных данных на виртуальное время измерений, равное 120 секундам, по логарифмическому закону, для определения стационарного уровня флуоресценции и рассчитывали удельную фотосинтетическую активность по формуле (2).

Заявляемые способ и устройство позволили уже через 1 час после УФ-облучения зафиксировать достоверное снижение функционального состояния растений in vitro (табл. 1 и 2). Как и следовало ожидать, более негативная реакция соответствует более высоким дозам ультрафиолетового излучения. Благодаря малой длительности измерений кривой МИФХ непосредственно через стенку колбы, без нарушения стерильности культивируемых, растений, можно следить за динамикой изменения функционального состояния растений в пострадиационный период. Растения in vitro, обученные УФ в дозе 180 кДж/м2, практически полностью восстановили свою фотосинтетическую активность на 5 сутки после обработки. А растения, обработанные УФ в дозе 540 кДж/м2, несмотря на попытку запуска репарационных процессов на 2 сутки после облучения, так и не смогли восстановиться ни по одному из измеренный показателей.

Данный способ и устройство позволяют практически мгновенно определять изменения функционального состояния растений in vitro с минимальным влиянием на их жизнедеятельность и благодаря этому их можно использовать для оптимизации условий выращивания, выявления порога устойчивости к различным неблагоприятным факторам, следить за динамикой развития репарационных процессов на всех этапах культивирования, не нарушая при этом условия стерильности.

Литература

1. Бутенко Р.Г. Биология клеток высших растений in vitro и биотехнология на их основе: Учебное пособие. - М: ФБК-ПРЕСС, 1999. - 160 с.

2. Калинин Ф.Л., Сарнацкая В.В., Полищук В.Е. Методы культуры тканей в физиологии и биохимии растений. - Киев: Наукова думка, 1980. - 487 с.

3. Мерзляк, М.Н. Гительсон Α.Α., Чивкунова О.Б., Соловченко А.Е., Погосян С.И. Использование спектроскопии отражения в анализе пигментов высших растений // Физиология растений. - 2003. - Т. 50, №5. - С. 785-792.

4. Кувалдин, Э.В. Специализированный фотометр для измерения патологических и физиологических изменений в растениях / Э.В. Кувалдин, В.Г. Сурин // Оптический журнал. - 1998. - Т. 65, №5. - С. 43-46.

5. Веселовский R.A., Веселова Т.В. Люминесценция растений. Теоретические и практические аспекты. - М.: Наука, 1990. - 200 с.

6. Корнеев, Д.Ю. Информационные возможности метода индукции флуоресценции хлорофилла / Д.Ю. Корнеев. - Киев: Альтенпресс, 2002. - 188 с.

7. Веселова, Т.В. Оценка состояния растений земляники, культивируемых in vitro, люминесцентным методом / Т.В. Веселова, О.Н. Высоцкая, В.А. Веселовский // Физиология растений. - 1994. - Т. 41, №6. - С. 942-946.

8. А.с. №1750556 Способ отбора пробирочных растений земляники для беспересадочного хранения / В.А. Веселовский, Т.В. Веселова, О.Н. Самсонова // Б.И. 1992, №28, с. 18.

9. Murashige T., Skoog F. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures // Physiol. Plarit. - 1962. - V. 15, №13. - P. 473-497.

Способ оценки функционального состояния растений in vitro, заключающийся в определении параметров флуоресценции хлорофилла, отличающийся тем, что регистрируют динамику изменения сигнала медленной индукции флуоресценции хлорофилла в диапазоне длин волн от 670 до 760 нм в течение 10-30 с, рассчитывают скорость изменения сигнала МИФХ на 10-30 секунде после достижения максимального уровня флуоресценции FM, рассчитывают значение виртуального стационарного уровня флуоресценции методом экстраполяции полученных данных для 120-300 секунды виртуальных измерений и определяют величину удельной фотосинтетической активности по формуле: , при этом о функциональном состоянии растений судят по соотношению значения удельной фотосинтетической активности, полученной в результате экстраполяции, и скорости изменения сигнала МИФХ - чем выше один или оба параметра, тем лучше функциональное состояние растений in vitro.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к органической химии и к области химии материалов, а именно к новому типу соединений - бискраунсодержащим дистирилбензолам общей формулы I, в которой A - бензольный фрагмент формулы II или III: где n=0, 1, а также к способу получения соединений формулы I, заключающемуся в том, что бисфосфонаты общей формулы IV, в которых A имеет вышеуказанные значения, R - низший алкил, подвергают взаимодействию с формильными производными бензокраун-эфиров общей формулы V, где n=0, 1, и процесс проводят в среде органического растворителя или смеси органического растворителя с водой.

Изобретение относится к бумажной промышленности, в частности к технологиям мониторинга и регулирования микроскопических загрязняющих веществ (микростиков) и макроскопических загрязняющих веществ (макростиков), и касается способа и устройства измерения эффективности добавки, вводимой в водную суспензию целлюлозной массы.

Изобретение относится к медицинской технике. Устройство для флуоресцентной диагностики и мониторинга фотодинамической терапии содержит источник света в полосе поглощения флуоресцентного маркера (1), источник света в полосе эмиссии флуоресцентного маркера (2), блок коммутации источников света, блок фильтрации излучения (3), объектив (4), CCD камеру (5), процессор сигналов управления и синхронизации и компьютер (6) с устройствами отображения и хранения информации.

Группа изобретений относится к области оптических химических датчиков для определения органофосфатов. Способ изготовления оптического химического датчика для определения органофосфатов с мембраной, полученной по золь-гель технологии, включает следующие стадии: добавление тетраэтоксисилана (TEOS) и метилтриэтоксисилана (MTriEOS) к индикатору Кумарин 1, растворенному в 10-7 М этаноле; перемешивание в ультразвуковой бане в течение 10 мин с последующим добавлением раствора катализатора в виде 0.001 М HCl и перемешиванием в ультразвуковой бане в течение 20 мин; получение покрывающих слоев на стеклянных пластинках путем погружения стеклянных пластинок в полученный золь через 24 ч старения золя в закрытом сосуде при комнатной температуре, вытягивание из него пластинок с последующим удалением покрывающего слоя с одной стороны пластинки и сушкой в течение 24 ч при комнатной температуре с образованием мембраны.

Изобретение относится к области медицины, а именно к способу отбора партий компонентов культивации, подлежащих применению при культивации клетки млекопитающего, экспрессирующей интересующий белок, когда при культивировании используют по меньшей мере два разных компонента, включающему следующие стадии: а) берут спектры разных партий первого компонента, полученные первым спектроскопическим способом, спектры второго компонента, полученные вторым отличным спектроскопическим способом, и выход интересующего белка из культивационного супернатанта, полученный при культивировании с использованием комбинаций данных разных партий первого и второго компонентов, б) идентифицируют связь слитых спектров этих двух различных спектроскопических методов после расчета счетов РСА спектров с выходом культивирования, в) берут спектр дополнительной партии первого компонента, полученный первым спектроскопическим способом, и спектр дополнительной партии второго компонента, полученный вторым спектроскопическим способом, г) выбирают комбинацию взятого первого компонента и взятого второго компонента, если предсказанный выход из культивационного супернатанта, основанный на связи слитых спектров после расчета счетов РСА спектров, идентифицированной в б), находится в пределах +/-10% среднего выхода, приведенного в а).

Изобретение предназначено для обнаружения химического вещества путем использования светового излучения, вызванного химической связью. Химический сенсор содержит подложку и слой плазмонного поглощения.

Изобретение относится к области оптических измерений. Система флуоресцентного анализа может включать в себя головку датчика, которая имеет источник света, сконфигурированный с возможностью излучать свет в поток текучей среды, детектор, сконфигурированный с возможностью обнаруживать флуоресцентные излучения из потока текучей среды, и температурный датчик.
Изобретение относится к области экологической аналитической химии. Способ включает отбор проб массой 2-4 г, их сушку, измельчение и двухкратную экстракцию целевых компонентов дихлорметаном при воздействии на пробу ультразвуковых колебаний, фильтрование объединенного экстракта и упаривание досуха при давлении не выше 0,1 мм рт.ст.

Изобретение относится к измерительной технике и касается способа определения концентрации изотопов молекулярного йода. При реализации способа осуществляют прокачку анализируемой смеси газов через исследуемую и две реперные ячейки, возбуждают в них флуоресцентное излучение перестраиваемыми полупроводниковыми лазерами с длинами волн, соответствующими линиям с максимальным поглощением изотопов газообразного йода и диоксида азота.

Изобретение относится к области оптических измерений и касается способа тестирования маркировки эвакуационного маршрута. Маркировка подсвечивается источником излучения, предназначенным для зарядки маркировки для достижения состояния послесвечения.

Изобретение к области сельского хозяйства. Способ включает отбор образцов сельскохозяйственной культуры в период вегетации по трансекте перпендикулярно лесной полосе и определение их биомассы.

Изобретение относится к измерению качества различных видовых комплексов трав и травянистых растений на пробах, преимущественно на пойменных лугах, и может быть использовано в экологическом мониторинге территорий с травяным покровом.
Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к технологии адаптации растений, выращенных в асептических условиях. Способ включает пересадку растений на основание с подготовленным почвенным субстратом.
Изобретение относится к области сельского хозяйства и ботаники. В способе получают гомогенную суспензию растительных тканей листа липы мелколистной Tilia cordata Mill., содержащей столбчатые и губчатые клетки мезофилла.

Изобретение относится к области сельского хозяйства, в частности к управляемым технологиям земледелия, и может быть использовано в отрасли полевого растениеводства.

Изобретение относится к области сельского хозяйства, а именно к растениеводству. В способе повышают урожайность люпина белого за счет увеличения устойчивости растений к неблагоприятным условиям произрастания.

Изобретение относится к сельскому хозяйству. Меристемные растения опрыскивают 0,1% раствором ПАБК, куда вводят 0,1% биопрепарата Фитолавина при температуре 20-25°С, а при повторном опрыскивании в фазе 3-4 листьев в раствор дополнительно добавляют 0,2-0,3% гумата калия.

Группа изобретений относится к области сельского хозяйства, в частности к растениеводству. Способ включает стадии: a) измерения количества жирных кислот, содержащихся в растении(ях); b) получения процентного содержания линоленовой кислоты по отношению к общему количеству жирных кислот, найденному в результате указанного измерения; и c) оценки урожая растительной биомассы на основании полученного таким образом процентного содержания линоленовой кислоты путем сравнения полученного процентного содержания с эталонным значением.

Изобретение относится к области биологии растений и лесоводству. Способ включает определение активности пероксидазы в ткани растений березы и выявление ее корреляции со степенью узорчатости древесины.

Изобретение относится к области сельского хозяйства, в частности к растениеводству. Способ включает нарезку черенков и посадку их на гряды в условиях защищенного грунта с искусственным туманом.

Изобретение к области сельского хозяйства. Способ включает отбор образцов сельскохозяйственной культуры в период вегетации по трансекте перпендикулярно лесной полосе и определение их биомассы.
Наверх