Штамм а n2269/вниизж/2015 вируса ящура aphtae epizooticae типа а для контроля антигенной и иммуногенной активности и для изготовления биопрепаратов для диагностики и специфической профилактики ящура типа а



Штамм а n2269/вниизж/2015 вируса ящура aphtae epizooticae типа а для контроля антигенной и иммуногенной активности и для изготовления биопрепаратов для диагностики и специфической профилактики ящура типа а
Штамм а n2269/вниизж/2015 вируса ящура aphtae epizooticae типа а для контроля антигенной и иммуногенной активности и для изготовления биопрепаратов для диагностики и специфической профилактики ящура типа а
Штамм а n2269/вниизж/2015 вируса ящура aphtae epizooticae типа а для контроля антигенной и иммуногенной активности и для изготовления биопрепаратов для диагностики и специфической профилактики ящура типа а
Штамм а n2269/вниизж/2015 вируса ящура aphtae epizooticae типа а для контроля антигенной и иммуногенной активности и для изготовления биопрепаратов для диагностики и специфической профилактики ящура типа а
Штамм а n2269/вниизж/2015 вируса ящура aphtae epizooticae типа а для контроля антигенной и иммуногенной активности и для изготовления биопрепаратов для диагностики и специфической профилактики ящура типа а
Штамм а n2269/вниизж/2015 вируса ящура aphtae epizooticae типа а для контроля антигенной и иммуногенной активности и для изготовления биопрепаратов для диагностики и специфической профилактики ящура типа а
Штамм а n2269/вниизж/2015 вируса ящура aphtae epizooticae типа а для контроля антигенной и иммуногенной активности и для изготовления биопрепаратов для диагностики и специфической профилактики ящура типа а
Штамм а n2269/вниизж/2015 вируса ящура aphtae epizooticae типа а для контроля антигенной и иммуногенной активности и для изготовления биопрепаратов для диагностики и специфической профилактики ящура типа а
Штамм а n2269/вниизж/2015 вируса ящура aphtae epizooticae типа а для контроля антигенной и иммуногенной активности и для изготовления биопрепаратов для диагностики и специфической профилактики ящура типа а
Штамм а n2269/вниизж/2015 вируса ящура aphtae epizooticae типа а для контроля антигенной и иммуногенной активности и для изготовления биопрепаратов для диагностики и специфической профилактики ящура типа а
C12N2720/00021 - Микроорганизмы или ферменты; их композиции (биоциды, репелленты или аттрактанты или регуляторы роста растений, содержащие микроорганизмы, вирусы, микробные грибки, ферменты, агенты брожения или вещества, получаемые или экстрагируемые из микроорганизмов или из материала животного происхождения A01N 63/00; пищевые составы A21,A23; лекарственные препараты A61K; химические аспекты или использование материалов для бандажей, перевязочных средств, впитывающих подкладок или хирургических приспособлений A61L; удобрения C05); размножение, консервирование или сохранение микроорганизмов (консервирование живых тканей или органов людей или животных A01N 1/02); мутации или генная инженерия; питательные среды (среды для микробиологических испытаний C12Q)

Владельцы патента RU 2640261:

Федеральное государственное бюджетное учреждение "Федеральный центр охраны здоровья животных" (ФГБУ "ВНИИЗЖ") (RU)

Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии и биотехнологии и касается нового штамма вируса ящура Aphtae epizooticae типа А сем. Picornaviridae, рода Aphtovirus. Охарактеризованный щтамм выделен от больного КРС и получен путем последовательных пассажей на чувствительных гетеро- и гомологичных культурах клеток и депонирован в коллекции ФГБУ «ВНИИЗЖ» под регистрационным номером штамм ВЯ А №2269/ВНИИЗЖ/2015 (производственный), (контрольный КРС), (контрольный свиной). Представленный штамм репродуцируется в перевиваемых культурах клеток почки сибирского горного козерога (ПСГК-30), IB-RS-2, ВНК-21. В течение 17-24 часов инкубирования урожай вируса в указанных культурах клеток достигает значений 6,75-7,75 lg ТЦД50/см3. При высокой множественности заражения (1-10 ТЦД/клетка) вызывает ЦПД через 17-24 часов, сохраняя исходные характеристики при пассировании в клеточных культурах на протяжении 5 пассажей. Представленный штамм вируса может быть использован для контроля антигенной и иммуногенной активности и для изготовления биопрепаратов для диагностики и специфической профилактики ящура типа А. 4 з.п. ф-лы, 1 ил., 7 табл., 7 пр.

 

Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии и биотехнологии, в частности к новому штамму вируса ящура Aphtae epizooticae, и может быть использовано для контроля антигенной и иммуногенной активности противоящурных вакцин, а также при разработке и изготовлении средств диагностики и специфической профилактики ящура типа А.

Ящур - высоко контагиозное вирусное заболевание домашних и диких парнокопытных животных. Относится к категории трансграничных болезней, способных преодолевать границы между государствами, вызывать эпизоотии и наносить большой экономический ущерб животноводству.

Возбудителем болезни является безоболочечный РНК-содержащий вирус ящура, представитель рода Aphtovirus семейства Picornaviridae. Различают семь серотипов вируса: А, О, С, Азия-1, САТ-1, САТ-2, САТ-3. В пределах каждого типа существует множество генетических и антигенных вариантов вируса [1].

Вирус ящура обладает значительной антигенной изменчивостью штаммов в пределах одного серотипа. Причиной антигенной изменчивости является изменение аминокислотной последовательности в полипептидах вирусных белков, образующих капсид вириона. Изменения, которые сохраняются в следующем поколении, становятся постоянными и отражаются в модификации нуклеотидной последовательности генома вируса.

Сдвиги антигенного спектра, соответствующие обновлению структуры нового полевого штамма, могут варьировать от незначительных, улавливаемых моноклональными антителами, до существенных, регистрируемых с помощью традиционных поликлональных иммуноглобулинов. Существенные изменения антигенных характеристик природного штамма с большой вероятностью вызывают ослабление специфического иммунитета, индуцированного негомологичным антигеном. Они вызывают также затруднения штаммоспецифической диагностики [7].

В результате возникает необходимость создания новых средств диагностики и специфической иммунопрофилактики.

Известны штаммы вируса ящура типа А, использовавшиеся в качестве производственных на территории СССР и Российской Федерации в течение последних 50 лет.

К ним относятся следующие штаммы: А7 №103, выделенный в 1962 году в Куйбышевской области; А7 №2, выделенный в 1965 году в Таджикской ССР; А №717/73, выделенный в 1973 году в Ставропольском крае, штамм вируса ящура А22 №550, выделенный в 1964 году в Азербайджане и используемый в Российской Федерации в качестве производственного при изготовлении средств специфической профилактики и диагностики, применяемых на всей территории России и в странах постсоветсткого пространства.

В 1990-2000-х годах в Центральной Азии и на Ближнем Востоке доминировали две генетические линии вируса ящура типа А: линия А/Иран/96 (к этой генетической группе относится российский производственный штамм А/Армения/98) и А/Иран/2005. Штаммы из группы А/Иран/99 и А/Иран/96 не входят в настоящее время в первоочередной перечень рекомендуемых Всемирной референтной лабораторией МЭБ/ФАО по ящуру вакцинных штаммов, тогда как штамм А/Иран/2005 (А/Турция/06) относится к высоко приоритетным [3, 4, 5, 9].

В 2013 г. на территории РФ регистрировались многочисленные вспышки ящура в Забайкальском крае, Амурской области, а также - впервые за несколько десятилетий - в Карачаево-Черкесской Республике, Краснодарском крае и Кабардино-Балкарской Республике. Все российские изоляты, ответственные за вспышки ящура на Северном Кавказе, принадлежат к генетической линии A Iran-05, сублинии SIS - 10.

Результаты филогенетического анализа свидетельствуют о том, что вспышки болезни в Забайкальском крае и Амурской области были вызваны вирусом ящура типа А, принадлежащим к генетической линии A Sea-97. Эта генетическая линия эндемична в странах Юго-Восточной Азии [8].

В настоящее время в ФГБУ «ВНИИЗЖ» освоено производство противоящурных вакцин из штаммов вируса ящура генетических линий А Iran-05, сублинии SIS - 10 (штамм вируса ящура А №2171/Кабардино-Балкарский/13) и A Sea-97 (штамм вируса ящура А №2187/Кути/13). Недостатком вышеуказанных штаммов является то, что изготовленные на их основе вакцины, обеспечивают эффективную защиту животных только против заражения гомологичным вирусом. Однако необходимо учитывать, что вирус ящура постоянно эволюционирует, появляются новые генетические линии. В 2015 г. широкое распространение на территории Саудовской Аравии, Ирана, Турции получил ящур типа А, генетической линии G-VII А, топотипа Азия [13].

В связи с этим возникла необходимость получить новый производственный штамм из эпизоотического вируса ящура серотипа А для обеспечения безопасности территории России и сопредельных государств от этого возбудителя.

Штамм вируса ящура, относящийся к настоящему изобретению, ранее на территории РФ не встречался.

Задача, на решение которой направлено настоящее изобретение, заключается в расширении арсенала производственных штаммов вируса ящура серотипа А, обладающих высокой инфекционной, антигенной и иммуногенной активностью в нативном виде и сохраняющих антигенную и иммуногенную активность после инактивации, пригодных для контроля антигенной и иммуногенной активности вакцин, изготовления чувствительных и высокоспецифичных диагностических препаратов и высокоиммуногенных вакцин, гомологичных эпизоотическому вирусу.

Указанная задача решена путем получения штамма А №2269/ВНИИЗЖ/2015 (авторское наименование) вируса ящура типа А для контроля антигенной и иммуногенной активности, а также для изготовления биопрепаратов для диагностики и специфической профилактики ящура типа А.

Изолят вируса ящура, послуживший источником для получения штамма А №2269/ВНИИЗЖ/2015, был выделен в декабре 2015 года от больных свиней в Республике Армения (экспертиза №2269). Штамм вируса ящура А №2269/ВНИИЗЖ/2015 получен путем последовательных пассажей на чувствительных гетеро- и гомологичных культурах клеток.

Штамм вируса ящура типа А №2269/ВНИИЗЖ/2015 депонирован 01 февраля 2016 года в Коллекцию штаммов микроорганизмов Федерального государственного бюджетного учреждения «Федеральный центр охраны здоровья животных» (ФГБУ «ВНИИЗЖ»), под регистрационным номером (авторским наименованием): штамм ВЯ А №2269/ВНИИЗЖ/2015 (производственный), (контрольный КРС), (контрольный свиной).

По сравнению с известными штаммами штамм А №2269/ВНИИЗЖ/2015 обладает более высокой инфекционной, антигенной и иммуногенной активностью в нативном виде и после инактивации.

Экспериментально подтверждена возможность использования вируса ящура А №2269/ВНИИЗЖ/2015 для контроля антигенной и иммуногенной активности, а также для изготовления биопрепаратов для диагностики и специфической профилактики ящура типа А.

Сущность изобретения пояснена на дендрограмме, отражающей филогенетические взаимоотношения штамма вируса ящура А №2269/ВНИИЗЖ/2015 с эпизоотическими и вакцинными штаммами вируса ящура серологического типа А. Дендрограмма основана на сравнении полных нуклеотидных последовательностей гена VP1.

Сущность изобретения пояснена в перечне последовательностей, в котором:

SEQ ID NO: 1 представляет последовательность нуклеотидов гена белка VP1 штамма А №2269/ВНИИЗЖ/2015 вируса ящура типа А;

SEQ ID NO: 2 представляет последовательность аминокислот гена белка VP1 штамма А №2269/ВНИИЗЖ/2015 вируса ящура типа А.

Штамм А №2269/ВНИИЗЖ/2015 вируса ящура типа А характеризуется следующими признаками и свойствами.

Морфологические признаки

Штамм А №2269/ВНИИЗЖ/2015 вируса ящура типа А относится к семейству Picornaviridae, роду Aphtovirus, серотипу А и обладает морфологическими признаками, характерными для возбудителя ящура: форма вириона икосаэдрическая, размер 23-25 нм. Вирион состоит из молекулы РНК, заключенной в белковую оболочку. Белковая оболочка состоит из 32 капсомеров, расположенных в кубической симметрии.

Антигенные свойства

По своим антигенным свойствам штамм А №2269/ВНИИЗЖ/2015 вируса ящура относится к серотипу А. Вирус стабильно нейтрализуется гомологичной антисывороткой. Вирус не проявляет гемагглютинирующей активности (ГА-активности). У переболевших животных в сыворотке крови образуются антитела, выявляемые в иммуноферментном анализе (ИФА) и реакции микронейтрализации (РМН).

При гипериммунизации морских свинок концентрированный антиген из инактивированного вируса ящура типа А №2269/ВНИИЗЖ/2015 индуцирует образование вирусспецифических антител, выявляемых в РСК в разведении 1:40.

Методом нуклеотидного секвенирования была определена первичная структура гена VP1 вируса ящура типа А №2269/ВНИИЗЖ/2015 и выведена первичная структура белка VP1. Сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей показал, что штамм вируса ящура типа А №2269/ВНИИЗЖ/2015 значительно отличается от производственных штаммов вируса ящура типа А.

Степень нуклеотидных различий последовательностей штамма А №2269/ВНИИЗЖ/2015 со штаммами вируса ящура серологического типа А составило: А22№550 - 21,49%, А22/Ирак/64 - 21,73%, А/Иран/96 - 22,03%, А/Армения/98 - 22,39%, А/Турция/06 - 22,11%, А/Иран/05 - 22,32%.

Филогенетический анализ показал, что штамм А №2269/ВНИИЗЖ/2015 принадлежит к генетической линии G-VII типа А, топотипа Азия.

Антигенное родство штамма ВЯ А №2269/ВНИИЗЖ/2015 с имеющимися производственными штаммами ВЯ типа А исследовано серологическим методом в перекрестной реакции микронейтрализации (РМН). Штамм А №2269/ВНИИЗЖ/2015 антигенно отличается от производственных штаммов А22 №550, А/Ирак/64, А/Иран/97, А/Турция/06 (А/Иран/05), А №2187/Кути/13, А №2171/Кабардино-Балкарский/13.

Результаты исследований в РМН представлены в таблице 1. Антигенное соответствие (r1) составило для А22 №550 - 0,01, А/Ирак/64 - 0,01, А/Иран/97 - 0,05, А/Турция/06 - 0,02, А №2187/Кути/13 - 0,01, А №2171/Кабардино-Балкарский/13 - 0,06. При значении r1≥0,3 полевой изолят и производственный штамм являются близкородственными, и вакцина из производственного штамма будет защищать от эпизоотического вируса, при значении r1<0,3 полевой изолят отличается от производственного штамма, и вакцина из данного штамма не защищает от эпизоотического вируса [10, 12].

Биотехнологические характеристики

Штамм А №2269/ВНИИЗЖ/2015 репродуцируется в перевиваемых культурах клеток почки сибирского горного козерога (ПСГК-30), культурах перевиваемой линии клеток почки свиньи IB-RS-2, перевиваемых культурах клеток почки сирийского хомячка ВНК-21, и в течение 17-24 часов инкубирования вируса в указанных культурах клеток накапливается от 5,7 до 7,75 lg ТЦД50/см3. При высокой множественности заражения (1-10 ТЦД/клетка) вызывает ЦПД через 17-24 часов, сохраняет исходные характеристики при пассировании в клеточных культурах на протяжении 5 пассажей (срок наблюдения).

Генотаксономическая характеристика

Штамм А №2269/ВНИИЗЖ/2015 вируса ящура типа А является РНК-содержащим вирусом с молекулярной массой 7×106Да.

Нуклеиновая кислота представлена одноцепочной линейной молекулой, молекулярной массой 2,8×106Да. Вирион имеет белковую оболочку, состоящую из четырех основных белков VP1, VP2, VP3 и VP4. Липопротеиновая оболочка отсутствует.

Основным антигенным белком является VP1. В вирионе содержится приблизительно 31,5% РНК и 68,5% белка. Вирионная РНК является инфекционной и участвует в образовании белков-предшественников в инфицированных клетках. Предшественники, в свою очередь, расщепляются с образованием более стабильных структурных и неструктурных полипептидов вируса. Из 8 неструктурных полипептидов, накапливающихся в инфицированных клетках, один (VP66a) является РНК-зависимой РНК-полимеразой, участвующей в репликации РНК новых вирионов.

Физические свойства

Масса вириона составляет 8,4×10-18 г. Коэффициент седиментации 146S в градиенте сахарозы. Плавучая плотность 1,45 г/см3.

Устойчивость к внешним факторам

Штамм А №2269/ВНИИЗЖ/2015 устойчив к эфиру, хлороформу, фреону, ацетону и другим органическим растворителям и детергентам. Наиболее стабилен при рН 7,2-7,6. Сдвиги рН как в кислую, так и в щелочную сторону ведут к инактивации вируса. Чувствителен к формальдегиду, УФ-облучению, γ-облучению, высоким температурам.

Дополнительные признаки и свойства

Иммуногенная активность - иммуногенен в составе инактивированной вакцины.

Антигенная активность - введение инактивированного антигена морским свинкам индуцирует образование вирусоспецифических антител.

Реактогенность - реактогенными свойствами не обладает.

Патогенность - патогенен для парнокопытных животных, новорожденных мышат, морских свинок.

Вирулентность - вирулентен для естественно-восприимчивых животных при контактном, аэрозольном и парентеральном заражении.

Стабильность - сохраняет исходные биологические свойства при пассировании в чувствительных биологических системах в течение 5 пассажей (срок наблюдения).

Сущность предлагаемого изобретения пояснена примерами его использования, которые не ограничивают объем изобретения.

Пример 1

Вирусный изолят, послуживший источником для получения штамма А №2269/ВНИИЗЖ/2015, был выделен в ФГБУ «ВНИИЗЖ» из проб афтозного материала, полученных в декабре 2015 года от подозреваемых в заболевании ящуром свиней из села Аразап Армавирской области Республики Армения (экспертиза №2269). Пробы афтозного материала поступили в ФГБУ «ВНИИЗЖ» 25 декабря 2015 года.

При выделении вируса с целью получения его однородной популяции, обладающей оптимальными биотехнологическими свойствами, использовали комплекс биологических, вирусологических и биохимических методов, предусмотренных методическими указаниями по выявлению и идентификации штаммов вируса ящура [2].

Биологические и вирусологические методы включали:

Выделение вируса проводили на культуре перевиваемых линиях клеток ПСГК-30, IB-RS-2, ВНК-21 с последующей адаптацией (5 пассажей). Для постановки биопроб на перевиваемых культурах клеток их выращивали на соответствующих питательных средах, в стационарных условиях во флаконах с площадью поверхности 25 см2, отмывали от ростовой среды и заражали 10% суспензией афтозного материала (множественность заражения составляла 1-10 ТЦД50 на клетку), приготовленной в растворе Хенкса с 0,5% гидролизата лактальбумина (ГЛА) и антибиотиками по стандартной рецептуре. Для удаления микрофлоры и балластных клеточных компонентов суспензию обрабатывали 10% хлороформом. После 30-минутного контакта при 37°С во флаконы вносили по 5 см поддерживающей среды и инкубировали при 37°С до появления ЦПД вируса. При наличии ЦПД (округление клеток, повышение их оптической плотности, дегенерация и отделение клеток от стекла) флаконы подвергали замораживанию-оттаиванию, очистке клеточной взвеси хлороформом и центрифугированию при 3000 g в течение 15 мин. Полученный вируссодержащий материал использовали для последующих пассажей и исследования в РСК на наличие вирусного антигена, при этом использовали коммерческие типоспецифические сыворотки, хранящиеся в музее штаммов ФГБУ «ВНИИЗЖ». Вирус считался адаптированным к культурам клеток, если в течение 18-24 часов проявлялось (%) 90-100 ЦПД в монослое.

Вирус, адаптированный к культурам клеток ПСГК - 30, IB-RS-2 и ВНК-21, использовали для получения антигена для РСК.

Результаты адаптации вируса к различным клеточным культурам представлены в таблице 2.

Данные, приведенные в таблице 2, свидетельствуют о высокой адаптационной способности штамма вируса ящура А №2269/ВНИИЗЖ/2015 к использованным клеточным культурам.

Изолированный с помощью перечисленных методов вирусный препарат был исследован в РСК с целью идентификации его типовой принадлежности (таблица 3). Проведена проверка штамма на отсутствие контаминации посторонними вирусами в ПЦР и ОТ-ПЦР.

Приведенные в таблице 3 результаты свидетельствуют о том, что в афтозном материале экспертизы №2269/ВИИЗЖ/2015 выявлен антиген вируса ящура типа А в разведении 1:2 в РСК.

Контаминации бактериальной и грибной микрофлорой, микоплазмами и посторонними вирусами не обнаружено.

Пример 2

Для гипериммунизации морских свинок использовали антиген из штамма А №2269/ВНИИЗЖ/2015 вируса ящура типа А, репродуцированный в монослойной культуре клеток ПСГК-30. Вируссодержащую суспензию концентрировали в 100 раз добавлением 8-10% полиэтиленгликоля (ПЭГ) м.м. 6000, очищали от балластных примесей добавлением 10% хлороформа. Очищенный вирус инактивировали аминоэтилэтиленимином (АЭЭИ) в концентрации 0,025-0,05% при значении рН 8,0-8,3.

Инактивированный концентрат антигена в смеси с равным объемом масляного адъюванта типа неполного адъюванта Фрейнда вводили морским свинкам в объеме 1,0 см3 внутримышечно. Через 21 и 7 дней иммунизацию повторяли и через 10 дней после последнего введения антигена животных обескровливали. Индивидуальные пробы сыворотки крови проверяли на типовую специфичность и активность в РСК в соответствии с методическими рекомендациями по выявлению и идентификации штаммов вируса ящура [12].

После этого готовили серию штаммоспецифической сыворотки путем смешивания индивидуальных проб сыворотки крови морских свинок одинаковой активности. Штаммовую специфичность серийного препарата определяли в одно- и двусторонних реакциях с гомо- и гетерологичными антигенами.

После консервирования азидом натрия (1:5000) и выдерживания при температуре 4°С в течение 30 дней полученную сыворотку расфасовали во флаконы по 1,0 см3 и лиофилизировали методом сублимации под вакуумом.

Способом, описанным в примере 2, была приготовлена 1 серия гипериммунной сыворотки, характеристика которой представлена в таблице 4.

Данные, приведенные в таблице 4, свидетельствуют о том, что получена диагностическая сыворотка, по специфической активности отвечает требованиям ГОСТа 25384-82.

Пример 3

Для получения антигена для серологических и иммунохимических реакций использовали вирус ящура типа А штамма А №2269/ВНИИЗЖ/2015, адаптированный к культуре клеток перевиваемых линий IB-RS-2. Для адаптации использовали вируссодержащий материал в виде 10% афтозной суспензии. Пассирование проводили в течение 5 последовательных пассажей. Полученный вирус использовали для наработки вирусного сырья. Заражение клеточных культур и сбор вирусного материала проводили по общепринятой методике.

Полученную вируссодержащую суспензию концентрировали в 100 раз добавлением (%) 8-10 ПЭГ. Полученный концентрат инактивировали АЭЭИ, расфасовали во флаконы и лиофилизировали методом сублимации под вакуумом. Данные представлены в таблице 5.

Пример 4

Для изготовления вакцины инактивированной сорбированной типа А №2269/ВНИИЗЖ/2015 вирус ящура репродуцировали при температуре 36-37°С. Через 6-7 часов инкубирования проводили подсчет живых и мертвых клеток с помощью окраски трипановым синим. Если количество живых клеток составляло 15-20%, то инкубирование продолжали еще 2-3 часа. При достижении количества мертвых клеток 90-95% культивирование прекращали и вируссодержащую суспензию контролировали на стерильность и содержание 146S и 75S компонентов. Количество 146S+75S компонентов в суспензии должно составлять не менее 0,5 мкг/см3. Сразу по окончании цикла репродукции вируса, не прекращая термостатирования, в вируссодержащую суспензию добавляли 15-20% раствор АЭЭИ, подкисленный ледяной уксусной кислотой до рН 8,0-8,5. Конечная концентрация АЭЭИ в вируссодержащей суспензии должна быть равной 0,025-0,05%. Инактивацию инфекционности вируса проводили в течение 12-24 часов при 36-37°С и рН 7,2-7,6 с перемешиванием через 5-6 часов в течение 3-5 минут. Остаток АЭЭИ нейтрализовали добавлением тиосульфата натрия.

В теплую суспензию добавляли 10% раствор ПГМГ до концентрации 0,005-0,007% для флокуляции балластных примесей и инактивации возможных контаминантов. Флокулированные балластные примеси подвергали седиментации с последующей декантацией [6].

Пример 5

В таблице 6 приведены результаты культивирования штамма А №2269/ВНИИЗЖ/2015 вируса ящура типа А в суспензии клеток ВНК-21, из которых следует:

1) штамм А №2269/ВНИИЗЖ/2015 имеет время репродукции 15,35±0,58 ч;

2) у штамма А №2269/ВНИИЗЖ/2015 наблюдается накопление вирусспецифического белка в пределах 2,33±0,23 мкг/см3;

3) накопление иммуногенных компонентов (146S+75S) у штамма А №2269/ВНИИЗЖ/2015 - 1,67±0,17 мкг/см3.

Пример 6

Полученный антиген контролировали на авирулентность, содержание вирусспецифического белка, 146S и 75S компонентов вируса и стерильность. Необходимую концентрацию 146S и 75S компонентов в 1 см адсорбированной вакцины получают путем концентрирования антигена ГОА.

Расчетный объем ГОА 3% концентрации добавляют в охлажденную суспензию антигена при работающей мешалке. Перемешивание ведут в течение 30 минут. После седиментации ГОА сливают расчетный объем оставшейся суспензии. Конечная концентрация ГОА должна быть в пределах 1,75±0,30, Р<0,001, мг/см3 n=10, а концентрация 146S и 75S компонентов вируса ящура по меньшей мере 3,0 мкг/см3 готового препарата. Затем в суспензию добавляют дополнительно 10% раствор сапонина до конечной концентрации 0,075%, что соответствует 750,0 мкг сапонина в 1 см3 готовой вакцины. Вакцину расфасовывают в стеклянные или пластиковые флаконы и проводят контроль ее стерильности в соответствии с ГОСТ 28085-89.

Авирулентность и безвредность вакцины проверяют на 5 головах КРС, вводя вакцину сначала под слизистую языка в дозе 2 см3, затем подкожно в дозе 10 см3. Наблюдение за клиническим состоянием животных ведут в течение 5 суток. Авирулентную, безвредную и стерильную вакцину проверяют на иммуногенную активность на КРС.

Пример 7

Контроль иммуногенной и антигенной активности вакцины инактивированной сорбированной из вируса ящура типа А №2269/ВНИИЗЖ/2015 осуществляли следующим образом. Для проверки иммуногенной активности препарата использовали 17 голов КРС массой 200+250 кг, доставленных из благополучных по ящуру зон. Первой группе животных из 5 голов КРС ввели вакцину подкожно в цельном виде. Второй группе животных из 5 голов КРС ввели подкожно разведение вакцины на фосфатно-буферном растворе в соотношении 1:4 и третьей группе из 5 голов в разведении 1:16. Четвертая группа из 2 голов осталась без вакцинации.

Объем прививной дозы составил 2,0 см3. На 21 день после вакцинации у вакцинированных и 2 контрольных голов КРС взяли пробы сыворотки крови и провели контрольное заражение животных введением под слизистую языка суспензии вируса ящура типа А №2269/ВНИИЗЖ/2015 в дозе 104,0 ИД50/0,2 см3.

Данные по иммуногенной активности вакцины в прививной дозе представлены в таблице 7.

Через 8 дней после заражения провели патологоанатомическое исследование КРС. Заболели все контрольные животные, 1 животное, вакцинированное вакциной в разведении 1:4, и 4 животных, вакцинированных разведением вакцины 1:16.

ИмД50 вакцины составила 0,25 см3. Прививная доза вакцины содержала 8 ПД50, что свидетельствует об эффективности препарата. Такая вакцина считается иммуногенной и пригодной для практического применения.

Источники информации

1. Бурдов А.Н., Дудников А.И., Малярец П.В. и др. Ящур / Под ред. А.Н. Бурдова. - М.: Агропромиздат, 1990, 320 с.

2. Методические указания по выявлению и идентификации штаммов вируса ящура / Гусев А.А., Захаров В.М., Шажко Ж.А. [и др.]. Владимир, 2002, 31 с.

3. Пат. РФ №2140452, C12N 7/00, А61К 39/135, G01N 33/569, А61К 39/42, С07К 16/08, 27.10.1999 г.

4. Пат. РФ №2242513, C12N 7/00, А61К 39/135, 20.12.2004 г.

5. Пат. РФ №2451745, C12N 7/00, А61К 39/135, 27.05.2012 г.

6. Промышленный регламент на производство вакцины против ящура типов А, О, С, Азия-1, Сат-1, Сат-2 и Сат-3 инактивированной сорбированной моно- и поливалентной (из вируса, выращенного в клетках ВНК-21): утв. директором ФГУ «ВНИИЗЖ», 11.09.2009. - Владимир, 2009. - 216 с.

7. Сюрин В.Н., Самуйленко А.Я., Соловьев Б.В. и др. Вирусные болезни животных. - М.: ВНИИТИБП, 1998, с. 532-548.

8. Щербаков А.В. Филогенетический анализ изолятов вируса ящура, вызвавших вспышки болезни в России в 2013 году [Текст]: научное издание / А.В. Щербаков, А.М. Тимина, Н.Г. Зиняков // Ветеринария. - 2014. - №7. - С. 22-25.

9. Foot-and-mouth Disease. Situation worldwide and major epidemiological events in 2005-2006 / K. Sumption, J. Lubroth, T. Murrai, S. De La Rocqe // EMPRESS/ Focus on…, 2007, №1, 11 P.

10. OIE. Manual of diagnostic tests and vaccines for terrestrial animals - 7th Ed. Paris, 2012. - Vol. 1, Chapter 2.1.5. - P. 166-169.

11. OIE. Terrestrial Animal Health Code - 24th Ed., Paris, 2015. - Vol. 2, Chapter 8.8. - P. 455-477.

12. Selection of foot and mouth disease vaccine strains - a review / D.J. Paton, J.-F. Valacher, J. Bergman [et al.] // Rev. Sci. Tech. OIE. - 2005. - Vol. 24(3). - P. 981-993.

13. WRLFMD Quarterly Report 2015 - URL http://www.wrlfmd.org/ref_labs/ref_lab_reports/OIE-FAO.

1. Штамм вируса ящура Aphtae epizooticae типа А, сем. Picornaviridae, род Aphtovirus, депонированный в коллекцию штаммов микроорганизмов ФГБУ «ВНИИЗЖ» под регистрационным номером штамм ВЯ А №2269/ВНИИЗЖ/2015 (производственный), (контрольный КРС), (контрольный свиной) для контроля антигенной и иммуногенной активности и для изготовления биопрепаратов для диагностики и специфической профилактики ящура типа А, характеризующийся тем, что он получен в течение последовательного пассирования в культурах клеток гомологичного и гетерологичного происхождения, обладающий высокой биологической, антигенной, иммуногенной активностью в нативном виде.

2. Штамм по п. 1, характеризующийся тем, что он получен в течение 5 последовательных пассажей в перевиваемой культуре клеток почки сибирского горного козерога (ПСГК-30) с титром инфекционной активности не менее 6,79 lg ТЦД50/см3, стабилен в течение 5 последовательных пассажей.

3. Штамм по п. 1, характеризующийся тем, что он получен в течение 3 последовательных пассажей в перевиваемой культуре клеток почки свиньи (IB-RS-2) с титром инфекционной активности не менее 6,75 lg ТЦД50/см3, стабилен в течение 5 последовательных пассажей.

4. Штамм по п. 1, характеризующийся тем, что он получен в течение 5 последовательных пассажей в перевиваемой культуре клеток почки сирийского хомячка (ВНК-21) с титром инфекционной активности не менее 7,75 lg ТЦД50/см3, стабилен в течение 5 последовательных пассажей.

5. Штамм по любому из пп. 1-4, характеризующийся тем, что после инактивации он индуцирует в организме морских свинок образование вирусоспецифических антител, выявляемых в РСК в разведениях 1:40.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к области биотехнологии и касается рекомбинантного штамма E. coli, являющегося продуцентом антигена возбудителя сибирской язвы Bacillus anthracis.

Изобретение относится к области биотехнологии и касается рекомбинантного штамма E. coli, являющегося продуцентом антигена возбудителя сибирской язвы Bacillus anthracis.

Настоящее изобретение относится к вирусологии и медицине. Предложен штамм вируса гриппа свиней A/swine/Siberia/1sw/2016 H1N1-субтипа, выделенный из гомогената легочной ткани домашней свиньи на территории Западной Сибири и депонированный в Государственной коллекции вирусов на базе Института вирусологии им.

Изобретение относится к области медицинской вирусологии и микробиологии и касается штамма вируса Эбола Заир. Представленный штамм вируса Эбола Заир H.sapiens-wt/GIN/2015/Kalidie-Kindia-1022 выделен из крови больного лихорадкой Эбола во время эпидемии в Гвинее 2014-2015 гг.

Настоящее изобретение относится к вирусологии и медицине. Предложен штамм вируса гриппа птиц A/black-headed gull/Kamchatka/123/2013 H11N8-субтипа, выделенный от озерной чайки (Larus ridibundus) и депонированный в Государственной коллекции вирусов на базе Института вирусологии им.

Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии и биотехнологии и касается штамма вируса геморрагической болезни кроликов, семейства Caliciviridae, род Lagovirus. Представленный штамм депонирован под номером 55 в Автономной некоммерческой организации «Научно-исследовательский институт диагностики и профилактики болезней человека и животных».

Предложены композиция вакцины для предотвращения репродуктивно-респираторного синдрома свиней корейского типа, содержащая вирус репродуктивно-респираторного синдрома свиней (РРСС) корейского типа (номер доступа в КСТС 12096 ВР) в количестве от 2×105 до 2×107 БОЕ/мл в качестве эффективного ингредиента, способ предотвращения РРСС корейского типа, использующий такую вакцину, набор для диагностики вируса РРСС корейского типа и способ обнаружения вируса РРСС корейского типа.

Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии. Получен штамм Эшли вируса калицивироза кошек, депонированный в ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» под номером V-697, обладающий стабильной инфекционной активностью, адаптированный к перевиваемым культурам клеток.

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к клинической лабораторной диагностики вирусных инфекций, и может быть использовано для генотипирования вируса герпеса 6-го типа (ВГЧ-6).

Изобретение относится к области биохимии, генной инженерии и биотехнологии, в частности к способу создания живой вакцины на основе биологически активного штамма Еnterococcus faecium L3 за счет включения в структуру его пилей антигена клинически актуального патогенного микроорганизма.

Предложенная группа изобретений относится к области медицины. Предложены фармацевтическая композиция для предупреждения или лечения бокового амиотрофического склероза, содержащая изоформы фактора роста гепатоцитов (HGF) или полинуклеотид, кодирующий изоформы, и способ предупреждения или лечения бокового амиотрофического склероза, включающий введение млекопитающему указанной композиции.

Группа изобретений относится к области биотехнологии. Предложены рекомбинантный полипептид гемагглютинин (НА) вируса гриппа для вызова иммунного ответа на вирус гриппа H5N1, содержащий аминокислотную последовательность из остатков 2-568 SEQ ID NO: 1, кодирующая его нуклеиновая кислота, содержащие предложенный полипептид слитый белок и вирусоподобная частица (VLP) для вызова ответа на вирус гриппа H5N1, вектор экспрессии, содержащий нуклеиновую кислоту, и выделенная клетка, его содержащая, композиция и способ вызова иммунного ответа против вируса гриппа H5N1, а также способ иммунизации субъекта.

Представлены способ селекции рекомбинантных клеток млекопитающих, способ получения антитела, экспрессионный вектор и его применение. Способы включают трансфекцию клеток млекопитающего экспрессионным вектором, содержащим- первую экспрессионную кассету, содержащую в направлении 5'-3' промотор hCMV, нуклеиновую кислоту, кодирующую легкую цепь антитела, bGH поли(А)-сигнальную последовательность и последовательность терминатора hGT, и- вторую экспрессионную кассету, содержащую в направлении 5'-3' промотор hCMV, нуклеиновую кислоту, кодирующую тяжелую цепь антитела, bGH поли(А)-сигнальную последовательность и последовательность терминатора hGT,где первая экспрессионная кассета и вторая экспрессионная кассета расположены в одном направлении, и где указанный экспрессионный вектор дополнительно содержит селекционный маркер, и получение множества рекомбинантных клеток млекопитающего с последующей селекцией из этого множества единичных рекомбинантных клеток млекопитающего.

Изобретение относится к области биохимии, генной инженерии и биотехнологии, в частности штамму Е. coli RosettaTM (pRARE2, pR752), ВКПМ B-11308.

Группа изобретений относится к области ветеринарной вирусологии и биотехнологии. Способ изготовления вакцины включает культивирование вирусного антигена в суспензионной культуре клеток ВНК-21 при температуре 36-37°С, очистку вирусной суспензии от балластных примесей, инактивацию, концентрирование полученного антигена вируса ящура и соединение концентрата антигена с адъювантом.

Группа изобретений относится к медицине, а именно к биотехнологии и иммунологии, и может быть использована для получения вакцины против ящура. Вакцина включает вирусный антиген ящура, гидроокись алюминия, сапонин и в качестве адъюванта дополнительно используют натриевую соль сукцината хитозана при следующем соотношении компонентов, мас.%: сапонин 0,25-0,75, натриевая соль сукцината хитозана 05,-1,5, гидроокись алюминия в гликолевом буфере с рН 7,-8,6 15,0-25,0 и вирусный антиген ящура – остальное.

Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии и биотехнологии и касается нового штамма вируса ящура Aphtae epizooticae типа А сем. Picornaviridae, рода Aphtovirus, депонированного в коллекции ФГБУ «ВНИИЗЖ» под регистрационным номером штамм вируса ящура А №2166/Краснодарский/2013 (производственный, контрольный КРС).

Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии и биотехнологии и касается нового штамма вируса ящура Aphtae epizooticae типа А сем. Picornaviridae, рода Aphtovirus, депонированного в коллекции ФГБУ «ВНИИЗЖ» под регистрационным номером штамм вируса ящура А №2155/Забайкальский/2013 (производственный).

Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии и биотехнологии. Вакцина содержит активное вещество и целевые добавки.

Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии и биотехнологии и касается вакцины, содержащей активное вещество и целевые добавки. В качестве активного вещества вакцина содержит смесь из авирулентных очищенных антигенных материалов из штаммов вируса ящура А №2171/Кабардино-Балкарский/2013, А №2187/Кути/2013, Азия-1 №1946/Шамир 3/89 и О №2123/Южная Осетия/2011, полученных в перевиваемой культуре клеток ВНК-21, представляющих собой суспензию, содержащую преимущественно 146S и 75S иммуногенные компоненты вируса ящура.

Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии и биотехнологии и касается нового штамма вируса ящура Aphtae epizooticae типа А сем. Picornaviridae, рода Aphtovirus. Охарактеризованный щтамм выделен от больного КРС и получен путем последовательных пассажей на чувствительных гетеро- и гомологичных культурах клеток и депонирован в коллекции ФГБУ «ВНИИЗЖ» под регистрационным номером штамм ВЯ А №2269ВНИИЗЖ2015,,. Представленный штамм репродуцируется в перевиваемых культурах клеток почки сибирского горного козерога, IB-RS-2, ВНК-21. В течение 17-24 часов инкубирования урожай вируса в указанных культурах клеток достигает значений 6,75-7,75 lg ТЦД50см3. При высокой множественности заражения вызывает ЦПД через 17-24 часов, сохраняя исходные характеристики при пассировании в клеточных культурах на протяжении 5 пассажей. Представленный штамм вируса может быть использован для контроля антигенной и иммуногенной активности и для изготовления биопрепаратов для диагностики и специфической профилактики ящура типа А. 4 з.п. ф-лы, 1 ил., 7 табл., 7 пр.

Наверх