Штамм вируса эбола заир h.sapiens-wt/gin/2015/kalidie-kindia-1022 для получения антигена, используемого в качестве компонента иммуноферментной тест-системы для выявления антител классов g и м к вирусу эбола



Штамм вируса эбола заир h.sapiens-wt/gin/2015/kalidie-kindia-1022 для получения антигена, используемого в качестве компонента иммуноферментной тест-системы для выявления антител классов g и м к вирусу эбола
Штамм вируса эбола заир h.sapiens-wt/gin/2015/kalidie-kindia-1022 для получения антигена, используемого в качестве компонента иммуноферментной тест-системы для выявления антител классов g и м к вирусу эбола
Штамм вируса эбола заир h.sapiens-wt/gin/2015/kalidie-kindia-1022 для получения антигена, используемого в качестве компонента иммуноферментной тест-системы для выявления антител классов g и м к вирусу эбола
Штамм вируса эбола заир h.sapiens-wt/gin/2015/kalidie-kindia-1022 для получения антигена, используемого в качестве компонента иммуноферментной тест-системы для выявления антител классов g и м к вирусу эбола
Штамм вируса эбола заир h.sapiens-wt/gin/2015/kalidie-kindia-1022 для получения антигена, используемого в качестве компонента иммуноферментной тест-системы для выявления антител классов g и м к вирусу эбола
Штамм вируса эбола заир h.sapiens-wt/gin/2015/kalidie-kindia-1022 для получения антигена, используемого в качестве компонента иммуноферментной тест-системы для выявления антител классов g и м к вирусу эбола

 


Владельцы патента RU 2631937:

Федеральное бюджетное учреждение науки "Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии "Вектор" (ФБУН ГНЦ ВБ "Вектор") (RU)

Изобретение относится к области медицинской вирусологии и микробиологии и касается штамма вируса Эбола Заир. Представленный штамм вируса Эбола Заир H.sapiens-wt/GIN/2015/Kalidie-Kindia-1022 выделен из крови больного лихорадкой Эбола во время эпидемии в Гвинее 2014-2015 гг. путем 3 последовательных пассажей на мышах-сосунках линии BALB/c и 6 последовательных пассажей на культуре клеток Vero и депонирован в государственной коллекции возбудителей вирусных инфекций и риккетсиозов ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» под номером V-695. Изобретение позволяет получить антиген - компонент иммуноферментной тест-системы для выявления антител классов G и М к вирусу Эбола с титром не менее 2⋅106 ТЦПД50/мл. 6 табл., 6 пр.

 

Штамм вируса Эбола Заир H.sapiens-wt/GIN/2015/Kalidie-Kindia-1022 для получения антигена, используемого в качестве компонента иммуноферментной тест-системы для выявления антител классов G и М к вирусу Эбола

Изобретение относится к штамму эболавируса Заир и антигену, полученному с использованием указанного штамма, и может быть использовано в медицинской вирусологии и микробиологии, а именно для получения основного компонента иммуносорбента набора реагентов для двухстадийного твердофазного непрямого иммуноферментного анализа (ИФА) - антигена эболавируса Заир, при разработке и производстве медицинского изделия «Набор реагентов для выявления антител классов G и М к вирусу Эбола «Вектор ИФА Эбола-АТ».

Известен способ получения антигена на основе рекомбинантного нуклеопротеина (NP) вируса Эбола, полученного в бакуловирусной системе (Saijo М, Niikura М, Morikawa S, Ksiazek TG, Meyer RF, Peters CJ, Kurane I. Enzyme-linked immunosorbent assays for detection of antibodies to Ebola and Marburg viruses using recombinant nucleoproteins // J Clin Microbiol. 2001; 39(1): 1-7).

Недостатки способа в том, что рекомбинантный антиген по своим антигенным свойствам не в полной мере соответствует нативному NP белку из вириона. Антитела у больных и реконвалесцентов имеют широкий спектр антигенной специфичности и в наибольших количествах нарабатываются на вирусные белки NP, VP40, VP35 и GP (Leroy Е.М., Baize S., Volchkov V.E., et al. Human asymptomatic Ebola infection and strong inflammatory response // Lancet, 2000; 355:2210-5; Johnson B.K., Wambui C, Ocheng D., et al. Seasonal variation in antibodies against Ebola virus in Kenyan fever patients // Lancet, 1986; 1:1160; Becquart P., Wauquier N., Mahlakoiv T. et al. High prevalence of both humoral and cellular immunity to Zaire ebolavirus among rural populations in Gabon // PLoS One. 2010; 5(2): e9126. doi: 10.1371/journal. pone. 0009126). По этим двум причинам не все антитела, синтезом которых организм будет отвечать на инфицирование вирусом Эбола, будут связываться с рекомбинантным NP-белком, что приводит к потере чувствительности метода. Кроме того, выявление специфических к NP-белку вируса Эбола антител не может быть использовано для оценки эффективности вакцин против геморрагической лихорадки Эбола, которые представлены в настоящее время только вариантами конструкций, главным компонентом которых является белок GP вируса, а не NP-белок.

Известен штамм Макона эболавируса Заир и антиген, полученный на основе указанного эболавируса Заир шт. Маконе, который используется для выявления антител классов М и G к вирусу Эбола как компонента диагностической ИФА-тест-системы (Krahling V., Becker D., Rohde С. et al., Development of an antibody capture ELISA using inactivated Ebola Zaire Makona virus // Med. Microbiol. Immunol., 2015, DOI 10.1007/s00430-015-0438-6).

Недостатки указанных технических решений в том, что антиген штамма Макона вируса Эбола получали из надклеточной жидкости, в которой находится собранный эболавирус Заир и, следовательно, антиген выявляет главным образом антитела на поверхностный белок вириона - гликопротеин (GP). В то же самое время известно, что антитела у больных и реконвалесцентов имеют широкий спектр антигенной специфичности и в наибольших количествах, как это указывалось выше, нарабатываются на белки NP, VP40, VP35 и GP (Leroy Е.М. et. al, 2000; Johnson В.K. et al., 1986; Becquart P. et al., 2010). Это подтверждают и данные самих авторов: из 4 проверенных в Western-blot анализе сывороток только в одной были обнаружены антитела к GP белку, а в 3 других - антитела к NP и VP40 белкам вируса. Чувствительность ИФА-анализа, проведенного с использованием данного антигена, снижена, это подтверждается тем, что авторы смогли обнаружить появление специфических антител класса G только на 9-14 сутки после появления клинических признаков заболевания. Если учесть, что латентный период составляет 5-12 сут (Volz Е., Pond S. Phylodynamic analysis of ebola virus in the 2014 Sierra Leone epidemic // PLoS Curr. 2014 Oct 24;6. pii: e currents outbreaks. 6f7025f1271821d4c815385b08f5f80e. doi: 10.1371/currents. outbreaks. 6f7025f1271821d4c 815385b08f5f80e), то антитела были определены на 14-26 сутки после заражения. Полученный таким образом антиген больше подходит для оценки эффективности вакцин против геморрагической лихорадки Эбола, которые представлены в настоящее время вариантами конструкций, главным компонентом которых является белок GP вируса Эбола.

Техническим результатом предлагаемого изобретения является повышение чувствительности набора реагентов для одностадийного твердофазного непрямого иммуноферментного анализа (ИФА) с использованием антигена, полученного на основе заявляемого штамма эболавируса Заир.

Указанный технический результат достигается получением штамма вируса Эбола Заир H.sapiens-wt/GIN/2015/Kalidie-Kindia-1022, который используется для получения антигена - компонента иммуноферментной тест-системы для выявления антител классов G и М к вирусу Эбола, депонированный в государственной коллекции возбудителей вирусных инфекций и риккетсиозов ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» под номером V-695.

Антиген вируса Эбола получают из культуральной жидкости, содержащей штамм вируса Эбола Заир H.sapiens-wt/GIN/2015/Kalidie-Kindia-1022 с титром не менее 2⋅106 ТЦПД50 /мл, путем осаждения вируса центрифугированием, очистки антигена от примесей ультрацентрифугированием и его инактивации химическим реагентом с получением очищенного антигена в количестве не менее 2 мг/мл, чистотой не менее 90% и диагностической чувствительностью не менее 98,0%.

Характеристика заявляемого штамма вируса Эбола

Штамм вируса Эбола Заир H.sapiens-wt/GIN/2015/Kalidie-Kindia-1022 получен во ФБУН ГНЦ ВБ "Вектор" и депонирован в государственной коллекции возбудителей вирусных инфекций и риккетсиозов ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» под номером V-695.

Название вируса в соответствии с правилами номенклатуры и положение в современной системе классификации:

Порядок: Mononegavirales
Семейство: Filoviridae
Род: Ebolavirus
Вид: Zaire ebolavirus
Штамм: Заир H.sapiens-wt/GIN/2015/Kalidie-Kindia-1022.

Область использования вируса: диагностический штамм для получения антигена вируса Эбола.

Новый вирусный штамм выделен из крови больного лихорадкой Эбола во время эпидемии в Гвинее 2014-2015 гг. путем 3 последовательных пассажей на мышах-сосунках линии BALB/c и 6 последовательных пассажей на культуре клеток Vero. После проведения пассажей гомология нуклеотидных последовательностей с исходным штаммов составила 99,9%.

БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ

Свойство или иное назначение штамма, послужившее основанием для заявки: диагностический штамм для получения антигена вируса Эбола.

Условия культивирования: среда Игла ДМЕМ с добавлением 2% сыворотки эмбрионов крупного рогатого скота и антибиотиков. Культивирование производится при температуре 37°С в течение 6-7 суток. Титр вируса: 2,0×106 ТЦПД50/мл.

Геном вируса представлен молекулой односпиральной рибонуклеиновой кислоты (РНК) негативной полярности протяженностью около 19000 нуклеотидов. Молекулярная масса РНК вируса Эбола составляет 4,0×106 Да.

Состав вириона: 7 функциональных белков кодируются геномом эболавирусов: нуклеопротеин (NP), мембрано-ассоциированный белок (VP24), белки нуклеокапсида (VP30; УР35-кофактор полимеразы), матриксный белок (VP40), РНК-зависимая РНК-полимераза (L) и гликопротеин (GP). Каждый из генов кодирует 1 белок, за исключением GP, который кодирует sGP and ssGP. Углеводы - гликопротеины GP1 и GP2, ферменты - РНК-полимераза; транскриптаза.

Наличие мутаций в геноме: сравнение нуклеотидных последовательностей геномной РНК вируса Эбола Заир 1976 года (GenBank #AF086833.2) и штамма H.sapiens-wt/GIN/2015/Kalidie-Kindia-1022 эболавируса Заир выявило гомологию нуклеотидных последовательностей на уровне 97%, что составляет в среднем 500 нуклеотидных замен на геном.

Стратегия вирусного генома (способ репродукции): геномная РНК выполняет две матричные функции: транскрипции и репликации. Общая схема репликации: минус - цепь родительской РНК > плюс - цепь РНК > минус - цепь РНК потомства > вирионы потомства.

Форма вириона: преимущественно нитевидные или палочковидные, встречаются колбообразные, кольцевые, булавовидные и U-образные формы. Некоторые частицы имеют ответвления. Форма вирионов определяется стадией инфекционного процесса: в начале заболевания препараты, полученные от больных, содержат нитевидные и палочковидные формы, тогда как на поздних стадиях возрастает удельный вес других форм.

Молекулярная масса вириона составляет 300-600 МДа. Наружный диаметр частиц равен 70-80 нм. Длина вирусных частиц, намного превышая их диаметр, может достигать 14000 нм, при среднем значении 650 нм. Снаружи вирион покрыт липопротеидной мембраной толщиной примерно 20 нм, на которой на расстоянии 10 нм друг от друга располагаются спикулы длиной 7-10 нм.

Патогенен для человека, коэффициент летальности от 50 до 90%, относится к 1 группе патогенности по классификации Роспотребнадзора.

Антигенные свойства комплексного антигена. Выявляет все специфические антитела к эболавирусу Заир в сыворотках больных и вакцинированных людей. Всего было исследовано 150 образцов сыворотки и 356 образцов плазмы крови (см. табл. 1).

Диагностическая чувствительность: 22 образца сыворотки и 103 образца плазмы крови реконвалесцентов и больных лихорадкой Эбола были протестированы набором реагентов «Вектор ИФА Эбола-АТ скрин». При скрининге (совместное выявление антител классов М и G) все 125 образцов выявлены как положительные. При подтверждении (раздельное выявление классов антител) получено 125 положительных результатов. Диагностическая чувствительность составила не менее 98%.

Специфичность: 128 образцов сыворотки и 253 образца плазмы крови здоровых доноров и больных, в том числе различными геморрагическими лихорадками, которым лабораторными методами (ПЦР, биопроба) не был поставлен диагноз «лихорадка Эбола», были протестированы набором реагентов «Вектор ИФА Эбола-АТ скрин». Результат отрицательный в 100% случаев во всех вариантах постановки. Диагностическая специфичность составила не менее 99%.

На основе антигена создан иммуносорбент - основной компонент набора реагентов. Набор реагентов «Вектор ИФА Эбола-АТ скрин» включает в себя:

- Иммуносорбент - планшет;

- К+ контрольный положительный образец;

- К- контрольный отрицательный образец;

- Кг анти-IgM: 20х концентрат моноклональных мышиных антител к IgM человека, конъюгированных с пероксидазой хрена;

- Кг анти-IgG: 20х концентрат моноклональных мышиных антител к IgG человека, конъюгированных с пероксидазой хрена;

- РБР-С буферный раствор для разведения сывороток;

- РБР-К буферный раствор для разведения конъюгата;

- ТМБ хромоген тетраметилбензидин;

- БРС цитрат-фосфатный раствор с перекисью водорода для разведения ТМБ;

- ФСБ-Т (концентрат х25) 25-кратный концентрат фосфатно-солевого буферного раствора с твином;

- стоп-реагент;

- пленка для заклеивания планшета, ванночки для реагентов, наконечники для пипетки на 4-200 мкл.

АНАЛИТИЧЕСКИЕ И ДИАГНОСТИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ НАБОРА

1. Нижний порог обнаружения аналита. Набор реагентов должен выявлять антитела классов G и М к эболавирусу Заир в контрольных образцах №1-№4 рабочей панели образцов предприятия «РП АТ(+/-)Эбола». При титровании не менее чем до 1:10 положительный образец №1 «РП АТ(+/-)Эбола» или аналогичный по содержанию антител должен показывать положительный результат.

2. Специфичность. Антитела классов G и М к эболавирусу Заир не должны выявляться в контрольных образцах №5-№8 РП АТ(+/-)Эбола».

3. Воспроизводимость. Установлена исследованием коэффициента вариации оптических плотностей (ОП) одного и того же положительного образца. Коэффициент вариации не более 10%.

Сравнительный анализ с аналогичными наборами других производителей невозможен ввиду их отсутствия.

4.4 Характеристики рабочей панели образцов предприятия «РП АТ(+/-) Эбола»

В таблице №2 приведена оптическая плотность образцов «РП АТ(+/-) Эбола» при анализе в ИФА с применением набора реагентов «Вектор ИФА Эбола-АТ скрин» и в реакции нейтрализации бляшкообразования эболавируса Заир.

Все положительные образцы №1-№4 получены разведением одного клинически подтвержденного образца (из коллекции ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор») в пуле отрицательных сывороток (см. Таблицу 2).

Пример 1. Способ получения антигена эболавируса Заир

1. Получение вируссодержащей жидкости. Исходные клетки Vero хранили в жидком азоте и выращивали путем серийных пересевов. В качестве ростовой среды использовали раствор Игла MEM с 8-10% эмбриональной сыворотки крупного рогатого скота. Культуру клеток выращивали в течение 3 суток при посевной концентрации клеток 5×105 кл/мл среды и пересевали общепринятым способом.

Вирусом Эбола штамм H.sapiens-wt/GIN/2015/Kalidie-Kindia-1022 в дозе 4,5 lg БОЕ/5 мл заражали 30 культуральных флаконов Т-75 с выращенным в течение 24 часов до концентрации 1×x105 кл/мл монослоем культуры клеток Vero в ростовой среде Игла MEM (ООО «Биолот») с добавлением 10% эмбриональной сыворотки крупного рогатого скота (рабочая площадь поверхности флакона 7500 мм2). После инкубации при 25°С в течение 60 минут добавляли по 30 мл поддерживающей среды Игла MEM (ООО «Биолот») с добавлением 1% сыворотки крупного рогатого скота, 100 ед/мл амфотрецина, 100 ед/мл бензилпеницилина и 100 ед/мл стрептомицина. После инкубации в течение 5 суток при (37+1)°С сливали КВЖ. После отстаивания КВЖ от клеточного дебриса при 4-8°С в течение 18-20 часов аккуратно отделяли КВЖ от осадка. Концентрация вируса в КВЖ была 2×106 ТЦПД50/мл.

2. Осаждение вируса. На первом этапе к КВЖ добавляли ПЭГ-8000 до 8% и растворяли в течение 18-20 часов при температуре 25°С. Затем вирус осаждали «в пуговицу» путем центрифугирования в 0,5 л стаканах ротора JA-10 центрифуги J2-21 (Beckman) в течение 30 мин на скорости 6000 об/мин при температуре 2-4°С. Надосадочную жидкость сливали и дезинфицировали, а осадок растворяли в 10 мл STE-буфера.

Рецепт STE: из 10х концентрата перед применением добавлением в воду очищенную. 100 мл объем 10xSTE готовили заранее из смеси трех компонентов (20 мл компонента 1+10 мл компонента 2+2 мл компонента 3+68 мл воды). Прописи компонентов для 10xSTE:

Компонент 1. 14,6 г NaCl + 44,69 мл HCl;

Компонент 2. 6,06 г TrisHCl + 52,03 мл H2O;

Компонент 3. 9,31 г ЭДТА + 1,014 г NaOH + 44,48 мл H2O.

Пример 2. Ультрацентрифугирование КВЖ

Окончательно антиген для ИФА очищали от чужеродных белков ультрацентрифугированием в градиенте плотности сахарозы. Полученный ранее раствор вируса в STE-буфере наслаивали на раствор 10-60% сахарозы. Для приготовления ступенчатого градиента раствора сахарозы использовали раствор воды очищенной и 6 стеклянных флаконов, отградуированных на объем 50 мл, вместимостью 50 или 100 мл. В каждом приготавливали навески для изготовления 50 мл 10%, 20%, 30%, 40%, 50% и 60% раствора сахарозы. После добавления в каждый флакон 40 мл воды очищенной и перемешивания сахарозы до полного ее растворения, объем доводили до 50 мл. Растворы стерилизовали автоклавированием.

За сутки до ультрацентрифугирования в боксе биобезопасности устанавливали 2 стакана ротора SW-41 центрифуги Beckman L-8-70 с вложенными одноразовыми вкладышами (объем 38 мл) под углом 50-60° от горизонтали. В них осторожно, чтобы не перемешать, наслаивали по 5 мл шести растворов сахарозы различной плотности, начиная с максимальной 60%. Раствор оставляли на сутки для сглаживания ступенек плотностей сахарозы. Общий объем приготовленного ступенчатого градиента составлял 30 мл в двух пробирках.

В день ультрацентрифугирования на градиент сахарозы 10-60% осторожно наслаивали растворенный в STE осадок вируса по 5 мл в каждую пробирку. После установки стаканов в фирменный штатив вертикально к осадку вируса добавляли по 3 мл STE, чтобы уравнять с краями вкладыша содержимое. Стаканы осторожно закручивали и подставляли в штатив 4 пустых закрученных стакана.

Штатив в закрытом пакете переносили в центрифужную, пробирки устанавливали в ротор и закрепляли ротор в центрифуге и включали ее. Режим ценрифугирования - 37000 об/мин при 4-6°С в течение 4 ч.

Опалесцирующую полосу на уровне 42-45%-й сахарозы осторожно отбирали из обеих пробирок в 10 мл герметичный флакон. После определения титра пригодности для ИФА с использованием рабочей панели образцов передавали на сорбцию.

Выход пригодного для ИФА антигена с 1 л КВЖ составлял количество, пригодное для приготовления 50-100 иммуносорбентов.

Стадия инактивации вируса: очищенный в градиенте плотности сахарозы антиген вируса инактивировали разведением 1:200 в 0,1% растворе натрия углекислого с добавлением 0,05% натрия азида pH 12,5 и 5% спиртового фенолфталеина 1:1000.

Контроль остаточной активности вируса. Осуществляли реакцией бляшкообразования (РБО) при титровании разведенного антигена на культуральном планшете.

В результате получен очищенный антиген в количестве не менее 2 мг/мл, чистотой не менее 90% и диагностической чувствительностью не менее 98,0%.

Пример 3. Приготовление иммуносорбента

Приготовление раствора для сорбции: расход сырья, используемого на операции, приведен в таблице 3.

Отмеряют с помощью цилиндра (700±10) мл очищенной воды и переливают ее в чистую стеклянную емкость вместимостью 1 л. Вносят навески натрия углекислого и натрия азида, добавляют 2% фенолфталеина. Перемешивают на магнитной мешалке до полного растворения навесок. Доводят объем раствора до метки 1 л. Водородный показатель раствора не корректировать. Он должен быть в пределах от 10,5 до 11,5 ед. pH.

Приготовление блокирующего раствора: расход сырья, используемого на операции, приведен в таблице 4.

Отмеряют с помощью мерного цилиндра (700±10) мл очищенной воды и переливают ее в чистую стеклянную емкость вместимостью 1 л. Вносят навеску сахарозы, добавляют необходимое количество триптона и натрия азида. Перемешивают на магнитной мешалке до полного растворения. Доводят объем раствора до метки 1 л.

Приготовление рабочего раствора для сорбции: расход сырья, используемого на операции, приведен в таблице 5.

Отмеряют с помощью мерного цилиндра (900±10) мл раствора для сорбции и переливают в чистую стеклянную емкость вместимостью 1 л. Добавляют с помощью полуавтоматического дозатора с одноразовым наконечником с фильтром антиген эболавируса Заир, перемешивают на магнитной мешалке в течение 1 ч при температуре от 18°С до 24°С, наносят и сорбируют на планшеты.

Для сорбции используют планшеты Nunc Medisorp - «Nunc А/S», Дания, или аналогичные им. Объем заполнения лунок - 100-105 мкл. Объем заполнения лунок контролировать пипеткой полуавтоматической одноканальной со сменным наконечником на 200 мкл в лунках A1, D6 и H12 в одном планшете из каждых 100 засорбированных. Сорбцию проводить при температуре от 17°С до 27°С, время сорбции - 18-20 ч.

Удаление раствора. После проведения сорбции содержимое лунок планшета удаляют в емкость для отходов для обеззараживания. Остатки сорбционного раствора из лунок планшета удаляют, постукивая перевернутым планшетом по марлевой ткани.

Блокировка планшетов. Внесение блокирующего раствора в лунки планшетов проводят на автоматическом устройстве активации иммунологических планшетов. Объем заполнения лунок - 200-205 мкл. Объем заполнения лунок контролируют пипеткой полуавтоматической одноканальной со сменным наконечником на 250 мкл в лунках A1, D6 и Н12 в одном планшете из каждых 100 заблокированных. Блокировку проводить при температуре от 17°С до 27°С, время - 2 ч.

Удаление раствора. После проведения блокировки содержимое лунок планшета удаляют в емкость для отходов для обеззараживания.

Сушка планшетов. Планшеты устанавливают в кассеты и помещают в бокс для сушки планшетов. Сушку планшетов проводят 18-20 ч при температуре от 25°С до 27°С. Иммуносорбент и мешочек с силикагелем помещают в этикетированный пакет. Пакет запаивают на вакуумном упаковщике.

Пример 4. Проведение иммуноферментного анализа

Вносят во все предназначенные для исследуемых образцов лунки иммуносорбента по 80 мкл РБР-С. В одну любую пустую лунку дополнительно вносят 100 мкл РБР-С для контроля правильной работы рабочих растворов конъюгата и хромогена. Внесение положительного и отрицательного контролей: в одну любую пустую лунку вносят 100 мкл К+, в две другие пустые лунки вносят по 100 мкл К-. В лунки с 80 мкл РБР-С вносят по 20 мкл исследуемых образцов, тщательно перемешав пипетированием. Иммуносорбент инкубируют 30 мин в термостате при температуре (37±1)°С. По окончании инкубации промывают лунки стрипов 5 раз промывочным раствором и удаляют влагу. Во все лунки иммуносорбента вносят по 100 мкл рабочего раствора конъюгата. Иммуносорбент инкубируют 30 мин в термостате при температуре (37±1)°С. По окончании инкубации промывают лунки стрипов 5 раз промывочным раствором и удаляют влагу. Во все лунки иммуносорбента вносят по 100 мкл рабочего раствора хромогена. Защищенный от света иммуносорбент инкубируют 15 мин в термостате при температуре (37±1)°С. Реакцию останавливают добавлением во все лунки иммуносорбента по 50 мкл стоп-реагента. Время между остановкой реакции и регистрацией результатов не должно превышать 15 мин.

Результаты ИФА регистрируют с помощью планшетного ридера, измеряя оптическую плотность (ОП) с основным фильтром с длиной волны 450 нм. Выведение спектрофотометра на нулевой уровень («бланк») осуществляют по воздуху.

Результаты анализа учитывают только при соблюдении следующих условий.

- каждое значение ОП в лунках с К- (ОП К-) не более 0,200.

- значение ОП в лунке с контролем конъюгата (К Кг) не более 0,150.

- значение ОП в лунке с К+ (ОП К+) более 0,500.

По результатам анализа рассчитывают значение критической оптической плотности (ОПкрит.) по формуле:

где ОП (К-)ср. - среднее значение двух (ОП К-).

Для интерпретации результатов анализа используют коэффициент позитивности (КП):

где ОП ИО - ОП исследуемого образца.

Если КП≤1, результат интерпретировать как отрицательный.

Если КП>1, результат интерпретировать как положительный.

Положительный результат для образца от пациента с подозрением на геморрагическую лихорадку Эбола, в анализе при совместном использовании анти-IgG и анти-IgM, следует подтвердить повторением ИФА в двух лунках этого же набора, но в анализе при раздельном использовании анти-IgG и анти-IgM. При воспроизведении положительного результата хотя бы в одной из лунок, считать положительный результат подтвержденным. В противном случае необходимо исследовать новую порцию сыворотки (плазмы) по той же схеме.

Пример 5. Использование набора реагентов «Вектор ИФА Эбола-АТ» в клинической практике

А. Набор использован во время вспышки заболевания Эбола в 2014-2015 г. в Гвинейской Республике.

1) При анализе 125 проб от больных с клиническими признаками заболевания и лабораторно подтвержденным методом ПЦР диагнозом «лихорадка Эбола» положительный результат (и его последующее подтверждение при раздельном применении коньюгатов хотя бы с одним из коньюгатов) получен в 125 случаях. Диагностическая чувствительность - не менее 98% с доверительной вероятностью 90%;

2) При анализе 381 пробы от здоровых пациентов без клинических признаков заболевания и отрицательным результатом ПЦР на наличие РНК эболавируса Заир отрицательный результат получен в 381 случае. Диагностическая специфичность - не менее 99% с доверительной вероятностью 90%.

3) При анализе 17 проб от больных с клиническими признаками заболевания и лабораторно подтвержденным методом ПЦР диагнозом «лихорадка Эбола» и 29 проб от пациентов с клиническими признаками других заболеваний и отрицательным результатом ПЦР на наличие РНК эболавируса Заир на наборах трех разных серий, хранившихся 3, 8 и 11 месяцев соответственно получено 17 положительных результатов на содержание антител к вирусу Эбола с одновременным применением коньюгатов анти-IgM и анти-IgG (и их последующее подтверждение при раздельном применении коньюгатов хотя бы с одним из коньюгатов) и 29 отрицательных; что свидетельствует о межсерийной воспроизводимости и надежности при исследовании положительных и отрицательных образцов.

Таким образом, набор «Вектор ИФА Эбола-АТ скрин» рекомендуется использовать для совместного и раздельного выявления антител классов G и М к вирусу Эбола в сыворотке и плазме крови человека методом иммуноферментного анализа (ИФА) для клинической лабораторной диагностики болезни, вызванной вирусом Эбола.

Б. Набор использован в 2016 г в р.п. Кольцово Новосибирской области, где проводились работы по изучению титра специфических антител к эболавирусу Заир в сыворотках крови добровольцев, которым вводили вакцину против лихорадки Эбола. Титры специфических антител изучали в реакции нейтрализации бляшкообразования (РНБО), а также методом ИФА с помощью заявляемого набора реагентов.

Результаты сравнения методов ИФА и референс-метода нейтрализации бляшкообразования для определения нейтрализующих антител в сыворотке крови показывают, что наблюдается полная корреляция (100%) всех указанных методов на качественном уровне (положительный или отрицательный) при анализе 40 образцов содержащих и не содержащих антитела к эболавирусу Заир до (20 образцов) и после (20 образцов) иммунизации.

Таким образом, набор реагентов может быть использован для определения напряженности индивидуального иммунитета к заболеванию лихорадка Эбола.

Пример 6. Сравнение эффективности набора реагентов «Вектор ИФА Эбола-АТ» с коммерческими наборами

Эффективность набора реагентов «Вектор ИФА Эбола-АТ» на основе заявленного антигена сравнивалась с эффективностью набора реагентов «Human Anti-ZEBOV GP IgG» (производитель Alpha Diagnostic Intl. Inc., США, Cat. No AE-320620-1). К качестве антигена в наборе реагентов «Human Anti-ZEBOV GP IgG» используется рекомбинантный полноразмерный белок GP вируса Эбола, который входит в состав иммуносорбента. Для сравнительных исследований были взяты:

- 5 образцов сыворотки крови реконвалесцентов, которым на основании лабораторных исследований был поставлен диагноз «лихорадка Эбола»,

- 1 образец сыворотки крови реконвалесцента, которому на основании лабораторных исследований был поставлен диагноз «лихорадка Марбург»,

- 4 образца сыворотки крови реконвалесцентов, которым на основании лабораторных исследований был поставлен диагноз «лихорадка Западного Нила».

Сыворотки титровали с шагом 1:2, начиная с разведения 1:100 и заканчивая разведением 1:102400, и проводили исследование полученных образцов на наличие антител к вирусу Эбола наборами «Вектор ИФА Эбола-АТ скрин» и «Human Anti-ZEBOV GP IgG» согласно инструкции по использованию. Результаты приведены в таблице 6.

Представленные в таблице №6 данные показывают, что оба набора выявляют антитела к вирусу Эбола в сыворотки крови реконвалесцентов, которым был поставлен лабораторно подтвержденный диагноз «лихорадка Эбола». Оба набора не выявляют антитела к вирусу Эбола в сыворотки крови реконвалесцентов, которым был поставлен лабораторный подтвержденный диагноз «лихорадка Марбург» «лихорадка Западного Нила». Чувствительность набора «Вектор ИФА Эбола-АТ скрин» выше, чем чувствительность набора «Human Anti-ZEBOV GP IgG»: титры положительных образцов в 64-128 раз выше по результатам ИФА, проведенного с использованием набора «Вектор ИФА Эбола-АТ скрин». Полученные данные свидетельствуют об эффективности заявленного иммуносорбента.

Штамм вируса Эбола Заир H.sapiens-wt/GIN/2015/Kalidie-Kindia-1022 для получения антигена, используемого в качестве компонента иммуноферментной тест-системы для выявления антител классов G и М к вирусу Эбола, депонированный в государственной коллекции возбудителей вирусных инфекций и риккетсиозов ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» под номером V-695.



 

Похожие патенты:
Изобретение относится к медицине, а именно к онкоурологии, и может быть использовано для прогнозирования риска развития стеноза везикоуретрального анастомоза после радикальной простатэктомии.

Изобретение относится медицине, а именно к дерматологии, и может быть использовано для определения субпопуляционного состава клеток кожи. Способ определения субпопуляционного состава клеток кожи и получения цитоиммунограммы кожи включает забор биоптата кожи на глубину 2 мм, гомогенизацию ткани в 0,9%-ном водном растворе хлорида натрия при температуре +23…+25°С, извлечение гомогената, фильтрование гомогената через инертную фильтровальную перегородку с диаметром пор 20 мкм, центрифугирование гомогената при 400 g в течение 5 минут при температуре +23…+25°С.
Изобретение относится к медицине, а именно к дерматологии, педиатрии и аллергологии, и может использоваться для прогнозирования степени тяжести атопического дерматита у детей.
Изобретение относится к медицине, а именно к дерматологии и клинической иммунологии. У больных определяют клинико-анамнестические и лабораторно-инструментальные критерии диагностики псориатического артрита и присваивают им баллы.

Изобретение относится к медицине и представляет собой способ диагностики параимплантарного воспаления после эндопротезирования крупных суставов, характеризующийся тем, что производят забор крови, готовят образцы сыворотки крови, осуществляют исследование сыворотки крови с помощью иммуноферментного анализа, определяя количественные значения показателей: фактора, ингибирующего миграцию макрофагов (MIF), и белка, стимулирующего макрофаги (MSP), а также интерлейкинов 1, 4, 8, 10 (IL1, IL4, IL8, IL10), рассчитывают коэффициент выраженности макрофагальной реакции и коэффициент выраженности гуморального ответа , определяют показатель развития параимплантарного воспаления К, равный (К1+К2)-2.7, и при его отрицательных значениях констатируют регресс патологического процесса, при положительных значениях - прогресс патологического процесса.

Изобретение относится к медицине, а именно к иммунологии, и может быть использовано для оценки влияния алюминия на иммунный статус. Для этого в пробе крови пациента определяют содержание алюминия, и в тех пробах крови пациентов, где содержание алюминия выше референтного значения, извлекают иммунокомпетентные клетки.

Изобретение относится к области биомедицины и касается способа диагностирования острого повреждения почек и применения in vitro набора, содержащего праймеры, необходимые для выполнения способа.

Изобретение относится к медицине, а именно к вирусологии, и может быть использовано для диагностики периода инфекционного процесса, вызванного вирусом ветряной оспы.

Группа изобретений относится к способу калибровки составного анализа, включающему: добавление калибровочного реагента, включающего по меньшей мере две различные связывающие молекулы, где каждая молекула обладает способностью специфичного связывания с агентом захвата и способностью связываться с детектирующей молекулой и где по меньшей мере две из связывающих молекул имеют различные специфичности и присутствуют в различных концентрациях, добавление детектирующей молекулы, детектирование связанной детектирующей молекулы, создание калибровочной кривой, включающей ряд калибровочных точек/интервалов.

Настоящая группа объектов изобретения относится к области биотехнологии. Предложен рекомбинантный мультимерный скаффолд на основе 3 домена FnIII тенасцина (Tn3), который специфически связывается с рецептором 2 TRAIL (TRAIL R2).

Настоящее изобретение относится к вирусологии и медицине. Предложен штамм вируса гриппа птиц A/black-headed gull/Kamchatka/123/2013 H11N8-субтипа, выделенный от озерной чайки (Larus ridibundus) и депонированный в Государственной коллекции вирусов на базе Института вирусологии им.

Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии и биотехнологии и касается штамма вируса геморрагической болезни кроликов, семейства Caliciviridae, род Lagovirus. Представленный штамм депонирован под номером 55 в Автономной некоммерческой организации «Научно-исследовательский институт диагностики и профилактики болезней человека и животных».

Предложены композиция вакцины для предотвращения репродуктивно-респираторного синдрома свиней корейского типа, содержащая вирус репродуктивно-респираторного синдрома свиней (РРСС) корейского типа (номер доступа в КСТС 12096 ВР) в количестве от 2×105 до 2×107 БОЕ/мл в качестве эффективного ингредиента, способ предотвращения РРСС корейского типа, использующий такую вакцину, набор для диагностики вируса РРСС корейского типа и способ обнаружения вируса РРСС корейского типа.

Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии. Получен штамм Эшли вируса калицивироза кошек, депонированный в ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» под номером V-697, обладающий стабильной инфекционной активностью, адаптированный к перевиваемым культурам клеток.

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к клинической лабораторной диагностики вирусных инфекций, и может быть использовано для генотипирования вируса герпеса 6-го типа (ВГЧ-6).

Предлагаемое изобретение относится к области медицинской вирусологии. Представленный штамм A/17/Южная Африка/2013/01 (H1N1)pdm09 - реассортант, полученный путем скрещивания «дикого» вируса А/Южная Африка/3626/2013 (H1N1)pdm09 с вирусом А/Ленинград/134/17/57 (H2N2) - донором аттенуации, безвредным для людей.

Изобретение относится к области биотехнологии, вирусологии и медицины. Диагностический штамм вируса гриппа RN2/66-human A(H7N2) получен путем скрещивания вируса гриппа лошади А/лошадь/Прага/1/1956(Н7N7) с холодоадаптированным вакцинным штаммом А/17/Калифорния/66/395(Н2N2) на основе донора аттенуации А/Ленинград/134/17/57(Н2N2).

Изобретение относится к биотехнологии. Предложен рекомбинантный штамм VACΔ6 вируса осповакцины с нарушенными генами C3L, N1L, J2R, A35R, A56R, B8R на основе клонированного вируса осповакцины (штамм Л-ИВП).

Изобретение относится к медицине, а именно к биотехнологии и иммунологии, и может быть использовано для получения микрокапсулированной формы живой гриппозной культуральной вакцины против гриппа для интраназального применения.

Группа изобретений относится к медицине, а именно к биотехнологии и иммунологии, и может быть использована для получения вакцины против ящура. Вакцина включает вирусный антиген ящура, гидроокись алюминия, сапонин и в качестве адъюванта дополнительно используют натриевую соль сукцината хитозана при следующем соотношении компонентов, мас.%: сапонин 0,25-0,75, натриевая соль сукцината хитозана 05,-1,5, гидроокись алюминия в гликолевом буфере с рН 7,-8,6 15,0-25,0 и вирусный антиген ящура – остальное.

Предложен способ получения полипептида, включающий культивирование клетки Escherichia coli, содержащей нуклеиновую кислоту, кодирующую полипептид, регулирование значения рН во время культивирования с помощью щелочного раствора, содержащего аминокислоту, выделение полипептида из клеток или культуральной среды и, таким образом, получение полипептида.
Наверх