Композиция для предотвращения или лечения ревматоидного артрита, содержащая в качестве активного ингредиента моноацетилдиглицерид

Изобретение относится к медицине, в частности к фармацевтической композиции для лечения ревматоидного артрита и способу лечения ревматоидного артрита. Фармацевтическая композиция содержит в качестве активного ингредиента эффективное количество моноацетилдиацилглицерина и фармацевтически приемлемый носитель. Моноацетилдиацилглицерины по изобретению эффективно подавляют фосфорилирование STAT-3, считающегося терапевтической мишенью в случае ревматоидного артрита. Будучи эффективными терапевтическими агентами и не обладая токсичностью, моноацетилдиацилглицерины по изобретению не имеют побочных эффектов, свойственных используемым в настоящее время лекарствам для лечения ревматоидного артрита. 2 н. и 5 з.п. ф-лы, 5 пр., 8 ил.

 

Область техники, к которой относится изобретение

Данное изобретение относится к фармацевтическим композициям, а также к композициям функциональных продуктов лечебного питания и квази-медикаментов для предотвращения или лечения ревматоидного артрита или для улучшения состояния индивидов с этим заболеванием, содержащим в качестве активного ингредиента моноацетилдиацилглицерин.

Уровень техники

Ревматоидный артрит - это хроническое аутоиммунное заболевание, сопровождающееся воспалительным процессом, поражающим суставы и другие органы. При ревматоидном артрите наблюдается болезненное опухание пальцев, кистей рук, стоп, запястий, лодыжек, коленей и других областей суставов; иногда поражаются другие органы, например мышцы, кожа, легкие и глаза. Причины ревматоидного артрита остаются неизвестными, хотя интенсивно изучаются. Существующие на сегодняшний день методы лечения или предотвращения ревматоидного артрита не эффективны, и имеется настоятельная нужда в более действенном лечении. Для лечения артрита широко использовались гормональные лекарственные препараты, например стероидные. Однако применение гормональных лекарств ограничено, так как они не ликвидируют основу заболевания и притом могут вызывать ряд побочных эффектов. При всяком артрите, в частности ревматоидном, больной страдает от сильной боли и вынужден принимать противовоспалительные агенты. Для облегчения болевого синдрома давно и широко применяется аспирин. Однако из-за вредного влияния аспирина на желудок затруднительно принимать его постоянно в достаточном количестве, необходимом для лечения артрита.

Применение имеющихся в настоящее время лекарственных препаратов для лечения артрита ограничено в числе прочего побочными эффектами этих препаратов, не позволяющими использовать их длительно, отсутствием противовоспалительного эффекта и неэффективностью лечения уже наличествующего артрита. Для решения указанных проблем насущно необходимо разработать эффективные терапевтические агенты против артрита. Большинство лекарственных препаратов, используемых в последнее время для лечения артрита, обладают в той или иной степени побочными эффектами, которые могут быть различными у разных препаратов и разных индивидов. В частности, поскольку для лечения ревматоидного артрита нужно принимать лекарства продолжительное время, очень важно и актуально создать новый фармацевтический агент с незначительными побочными эффектами.

Из оленьих рогов выделены вещества, обозначаемые ЕС-18, которые представляют собой моноацетилдиглицеридные соединения. Сообщалось, что ЕС-18 повышает выживаемость подопытных животных с экспериментальным сепсисом при перевязке и проколе слепой кишки и не обладает токсичностью при проверке по стандарту надлежащей лабораторной практики (GLP). Однако действие моноацетилдиацилглицеринов, включая ЕС-18, при ревматоидном артрите не известно и не описано. Поэтому авторы изобретения поставили своей целью найти вещество для лечения ревматоидного артрита на основе природного материала или нового соединения и обнаружили, что моноацетилдиацилглицерины ингибируют STAT-3, являющийся терапевтической мишенью в случае ревматоидного артрита, и могут быть использованы для предотвращения или лечения этого заболевания.

Раскрытие изобретения

Задачи изобретения

Цель изобретения - предложить фармацевтические композиции, композиции функциональных продуктов лечебного питания и квази-медикаментов для предотвращения или лечения ревматоидного артрита или улучшения состояния индивида, страдающего ревматоидным артритом, содержащие в качестве активного ингредиента моноацетилдиацилглицерин, представленный формулой 1,

где R1 и R2 независимо друг от друга представляют остаток жирной кислоты из 14-20 атомов углерода.

Другая цель изобретения - предложить способ предотвращения или лечения ревматоидного артрита, включающий введение соединения, описываемого формулой 1, индивиду, больному ревматоидным артритом или подверженному риску его развития.

Техническое решение поставленных задач

Для достижения указанных выше целей в некоторых воплощениях изобретения предлагаются фармацевтические композиции для предотвращения или лечения ревматоидного артрита, содержащие в качестве активного ингредиента моноацетилдиацилглицерин, представленный формулой 1,

где R1 и R2 независимо друг от друга представляют остаток жирной кислоты из 14-20 атомов углерода. В настоящем документе термин «остаток жирной кислоты» означает ацильную группу, образовавшуюся в результате возникновения эфирной связи при взаимодействии жирной кислоты и спирта.

Говоря конкретно, фармацевтическая композиция для предотвращения или лечения ревматоидного артрита по изобретению включает моноацетилдиацилглицерин, представленный формулой 1. По изобретению термин «моноацетилдиацилглицерин» означает производное глицерина, в котором имеются одна ацетильная группа и две ацильных группы; в настоящем документе такое соединение также обозначается MADG.

В моноацетилдиацилглицеринах, описываемых формулой 1, R1 и R2 независимо друг от друга представляют остаток жирной кислоты из 14-20 атомов углерода. Предпочтительно примеры R1 и R2, не имеющие ограничительного характера, включают пальмитоил, олеоил, линолеоил, линоленоил, стеароил, миристоил, арахидоноил и др. Предпочтительные комбинации R1 и R2 (R1/R2) включают олеоил/пальмитоил, пальмитоил/олеоил, пальмитоил/линолеоил, пальмитоил/линоленоил, пальмитоил/арахидоноил, пальмитоил/стеароил, пальмитоил/пальмитоил, олеоил/стеароил, линолеоил/пальмитоил, линолеоил/стеароил, стеароил/линолеоил, стеароил/олеоил, миристоил/линолеоил, миристоил/олеоил и др. В отношении оптической активности моноацетилдиацилглицерины, описываемые формулой 1, могут быть в (R)-форме, (S)-форме или в виде рацемической смеси и могут включать свои стереоизомеры.

В одном из воплощений изобретения моноацетилдиацилглицерин является соединением, представленным формулой 2.

Соединение, представленное формулой 2, - это 1-пальмитоил-2-линолеоил-3-ацетилглицерин, который в настоящем документе иногда называется "ЕС-18". В соединении, описываемом формулой 2, R1 и R2 представляют пальмитоил и линолеоил соответственно.

Моноацетилдиацилглицерины можно выделить из природного источника - рогов оленей или же их можно получить синтетическими методами, известными в органической химии (см. зарегистрированные патенты Кореи №10-0789323). Конкретно, проделывается следующее. Материал оленьих рогов экстрагируют гексаном, затем остаток экстрагируют хлороформом и хлороформ удаляют, получая экстракт. Объем растворителей для экстракции берется таким, чтобы экстрагируемый материал был полностью погружен в растворитель, но не более. Как правило, на 1 кг оленьих рогов берут около 4-5 литров гексана и/или хлороформа (сказанное здесь не имеет ограничительного характера). Полученные этим способом экстракты далее фракционируют и очищают путем хроматографии на колонках с силикагелем и тонкослойной хроматографии, в результате чего выделяют моноацетилдиацилглицерин по изобретению. Растворитель для экстракции выбирают (не ограничиваясь перечисленным здесь) из хлороформа/метилового спирта, гексана/этилацетата/уксусной кислоты.

Способ химического синтеза для получения моноацетилдиацилглицеринов описан в зарегистрированных патентах Кореи №10-0789323. В частности, этот способ включает (a) этап получения соединения вида 1-R1-3-защитная группа-глицерин путем присоединения защитной группы в положении 3 1-R1-глицерина; (b) этап получения соединения вида 1-R1-2-R2-3-защитная группа-глицерин путем введения R2 в положение 2 соединения 1-R1-3-защитная группа-глицерин; и (c) этап получения желаемого соединения - моноацетилдиацилглицерина - путем проведения реакции депротекции и одновременно реакции ацетилирования соединения 1-R1-3-защитная группа-глицерин. При необходимости полученный моноацетилдиацилглицерин можно далее очистить. Или же моноацетилдиацилглицерины можно получить путем кислотного разложения (ацетолиза) фосфатидилхолина; сказанное здесь не имеет ограничительного характера. В объем изобретения входят также стереоизомеры соединений, описываемых формулой (I).

В изобретении показано, что моноацетилдиацилглицерины ингибируют фосфорилирование STAT-3, и тем самым эффективны для предотвращения или лечения ревматоидного артрита.

В настоящем документе термин «ревматоидный артрит» означает хроническое воспалительное заболевание неизвестной этиологии, характеризующееся полиартритом. Первоначально воспаление выражено в синовиальной оболочке, окружающей сустав, но затем оно постепенно распространяется к периферии хряща и костей, что ведет к повреждению и деформации сустава. Помимо суставов при ревматоидном артрите могут поражаться другие участки организма. В число симптомов ревматоидного артрита входят анемия, офтальмопатия (в частности, сухость глаз), специфические ревматоидные узелки (небольшие плотные подкожные образования), легочный фиброз, васкулит и изъязвления кожи. Лекарственные препараты, применяемые для лечения ревматоидного артирта, включают нестероидные противовоспалительные средства, стероидные препараты, лекарства против ревматизма и агенты, блокирующие фактор некроза опухолей (TNF); однако известно, что с применением этих средств сопряжен риск различных побочных эффектов. В настоящем документе термин «предотвращение/профилактика» относится к мероприятиям, подавляющим или задерживающим возникновение ревматоидного артрита путем введения композиции по изобретению. Термин «лечение» включает профилактику, смягчение отрицательных последствий, ослабление симптомов, задержку развития или купирование проявлений, а также частичную или полную ликвидацию или предотвращение симптомов ревматоидного артрита путем введения композиции по изобретению.

Обнаружено, что в патогенезе ревматоидного артрита ведущую роль играют клетки Th17, которые производят интерлейкин-17 (IL-17). В частности, клетки Th17 непосредственно участвуют в возникновении воспалительного процесса в суставах и в разрушении костей. Что касается STAT-3, о котором известно, что этот белок - фактор транскрипции является ключевым для дифференцировки и активности клеток Th17, то он регулирует локус L-17 и играет существенную роль в экспрессии многих транскрипционных факторов, участвующих в дифференцировке клеток ТН17. STAT-3 активируется путем фосфорилирования. Известно, что на клетки Th17 можно влиять путем подавления в них активации STAT-3, что также повышает активность иммунорегуляторных Т-клеток, тем самым предотвращая ревматоидный артрит или оказывая лечебное действие. Таким образом, STAT-3 стал терапевтической мишенью в случае ревматоидного артрита.

В примерах изобретения показано, что (i) в клетках линий U937 и NK-92 при активации STAT-3 путем обработки соответственно интерлейкином-6 (IL-6) и форбол-12-миристат-13-ацетатом (РМА) ЕС-18 подавляет фосфорилирование STAT-3 зависимым от своей концентрации образом (см. эксперименты 1 и 2, фиг. 1 и 2); и (ii) в клетках линий А549 и HepG2 при активации STAT-3 путем обработки интерлейкином-10 (IL-10) ЕС-18 подавляет фосфорилирование STAT (см. пример 3, фиг. 3). Эти результаты свидетельствуют, что моноацетилдиацилглицерины эффективны при лечении ревматоидного артрита. В примере, в котором использовалась животная модель артрита, индуцированного коллагеном, индекс активности заболевания, определяемый путем осмотра невооруженным глазом (см. пример 4, фиг. 5), и концентрация IL-6 в сыворотке крови (см. пример 4, фиг. 4) были значительно ниже, чем в группе «отрицательный контроль». Окрашивание ткани также продемонстрировало, что ЕС-18 в концентрациях 125, 500 и 2000 мг/кг массы тела эффективно ослабляет симптомы артрита, индуцированного коллагеном (см. пример 4, фиг. 6 и 7).

В состав фармацевтической композиции по изобретению, содержащей моноацетилдиацилглицерины, могут также входить обычно используемые фармацевтически приемлемые носители, разбавители или иные эксципиенты. Количество моноацетилдиацилглицеринов в фармацевтической композиции по изобретению может варьировать в широких пределах без каких-либо специфических ограничений; конкретно говоря, содержание моноацетилдиацилглицеринов в фармацевтической композиции по изобретению составляет от 0,0001% до 100,0% (масса/масса), предпочтительно от 0,001% до 50% (масса/масса), более предпочтительно от 0,01% до 20% (масса/масса) относительно общего количества композиции.

Фармацевтическая композиция по изобретению может быть представлена различными лекарственными формами для перорального и не перорального введения - твердыми, жидкими, гелеобразными или суспензиями, например таблетками, болюсами, порошками, гранулами, капсулами (например, мягкими или жесткими желатиновыми капсулами), эмульсиями, суспензиями, сиропами, эмульгируемыми концентратами, стерилизованными водными растворами, неводными растворами, лиофилизованными препаратами, суппозиториями и др. При составлении композиции по изобретению могут использоваться обычно применяемые разбавители или иные эксципиенты, например наполнители, объемообразующие агенты, связующие вещества, увлажняющие агенты, дезинтегрирующие агенты и поверхностно-активные вещества. Твердые препараты для перорального применения по изобретению включают таблетки, болюсы, порошки, гранулы, капсулы и проч.; эти твердые препараты могут быть получены путем смешивания одного или более активных компонентов и по меньшей мере одного из таких эксципиентов, как крахмал, карбонат кальция, сахароза, лактоза, желатин и др. Помимо указанных эксципиентов, можно использовать агенты, улучшающие скольжение, например стеарат магния и тальк. Жидкие препараты по изобретению для перорального применения включают эмульсии, суспензии, сиропы и проч.; они могут также содержать обычно используемые разбавители, например воду или жидкий парафин, или различные агенты - увлажняющие, подслащивающие, ароматизирующие и консервирующие. Препараты для не перорального применения включают стерилизованные водные растворы, неводные растворы, лиофилизованные препараты, суппозитории и проч.; растворители для таких растворов включают пропиленгликоль, полиэтиленгликоль, растительные масла (например, оливковое масло) и эфиры для инъекций с помощью шприца, например этилолеат. Материалы для основы суппозиториев включают витепсол, макрогол, твин (Tween-61), масло какао, лаурин и глицериножелатин.

Моноацетилдиацилглицерин по изобретению вводится в организм в фармацевтически эффективном количестве. Термин «фармацевтически эффективное количество» в настоящем документе употребляется применительно к такому количеству вещества, которое достаточно для достижения желаемого результата при лечебных мероприятиях. Фармацевтически эффективное количество определяется соответственно типу, возрасту и полу индивида, характеру заболевания и степени его тяжести, активности взятого препарата, чувствительности к нему индивида, времени, продолжительности и пути введения препарата пациенту, скорости его выведения из организма и другим критериям, известным в области медицины. Композиция по изобретению может вводиться в организм в отдельности или же одновременно либо последовательно с другими лекарственными средствами; введение может быть однократным или многократным. Предпочтительное количество композиции по изобретению может варьировать соответственно состоянию индивида, его массе тела, степени тяжести заболевания, характеру препарата, пути и продолжительности введения. Нужное суммарное количество композиции, вводимое за сутки, определяет врач; обычно оно составляет от 0,001 мг/кг массы тела до 1000 мг/кг, предпочтительно от 0,05 мг/кг до 200 мг/кг, более предпочтительно от 0,1 мг/кг до 100 мг/кг; это количество вводится в один прием или в несколько приемов на протяжении суток. Композицию по изобретению можно вводить любому индивиду, которому требуется предотвращение или лечение ревматоидного артрита. Например, композицию по изобретению можно вводить не только людям, но и животным (в частности, млекопитающим), например обезьянам, собакам, кошкам, кроликам, морским свинкам, крысам, мышам, коровам, овцам, свиньям, козам и др. Композицию по изобретению можно вводить в организм различными обычно применяемыми для введения лекарственных средств способами, например перорально или ректально, внутривенно, внутримышечно, подкожно, внутриматочно, интрадурально или интрацеребрально.

В некоторых воплощениях изобретения предлагаются композиции функциональных продуктов лечебного питания для предотвращения ревматоидного артрита или улучшения состояния больного, включающие в качестве активного ингредиента моноацетилдиацилглицерин, описываемый формулой 1,

где R1 и R2 независимо друг от друга представляют (не ограничиваясь указанным здесь) остаток жирной кислоты из 14-20 атомов углерода.

В частности, моноацетилдиацилглицерины по изобретению можно включать в композиции функциональных продуктов лечебного питания для предотвращения ревматоидного артрита или улучшения состояния больного. Эти соединения и ревматоидный артрит описаны ранее. Термин «улучшение» включает любые действия, ослабляющее симптомы ревматоидного артрита или положительным для состояния индивида образом влияющее на его проявления путем введения этому индивиду композиции по изобретению.

Композиция функционального продукта лечебного питания композиция для предотвращения ревматоидного артрита или улучшения состояния больного по изобретению может состоять только или в основном из моноацетилдиацилглицеринов в чистом виде или может включать моноацетилдиацилглицерин и другие ингредиенты, обычно используемые в функциональных продуктах лечебного питания. Количество моноацетилдиацилглицерина в составе функционального продукта лечебного питания определяют соответственно предполагаемому применению этого продукта. Как правило, при изготовлении функционального продукта (в том числе напитка) лечебного питания моноацетилдитацилглицерин включается в его состав в количестве менее чем 15 массовых долей, предпочтительно менее 10 массовых долей. Однако количество моноацетилдиацилглицерина можно уменьшать или увеличивать. В случае продолжительного использования функционального продукта лечебного питания с целью влияния на здоровье индивида и с целью гигиены количество композиции в нем может быть меньше, чем указанные выше значения. Поскольку моноацетилдиацилглицерины не создают проблем в смысле безопасности продукта, их можно использовать в количествах больше указанных выше.

Пищевые продукты, в которые можно добавлять соединения по изобретению, не ограничены и включают различные варианты, например мясные продукты, колбасные изделия, хлеб, шоколад, конфеты, чипсы и подобные продукты, пиццу, макаронные изделия, жевательную резинку, молочные продукты (например, мороженое), супы, прохладительные безалкогольные напитки, чай, алкогольные напитки, витаминные комплексные препараты и любые функциональные продукты лечебного питания. В том случае, когда функциональный продукт лечебного питания является напитком, он может включать обычно используемые в напитках подсластители, ароматизирующие агенты или углеводы. Примеры углеводов, которые могут входить в состав функциональных продуктов лечебного питания по изобретению, включают моносахариды, например глюкозу и фруктозу; дисахариды, например мальтозу и сахарозу; полисахариды, например декстрин и цикл о декстрин; сахарные спирты, например ксилит, сорбит и эритрит. Количество углеводов в составе напитка по изобретению может широко варьировать без особых ограничений; обычно оно составляет от 0,01 г до 0, 04 г, более предпочтительно от 0,02 до 0,03 г на 100 мл. Примеры подсластителей включают природные агенты, например тауматин и экстракт стевии, и искусственные вещества, например сахарин и аспартам. Помимо указанных выше компонентов функциональный продукт лечебного питания по изобретению может также включать различные питательные добавки, витамины, электролиты, ароматизирующие агенты, красители, пектиновые кислоты и их соли, альгиновую кислоту и ее соли, органические кислоты, защитные коллоиды, загустители, агенты для подведения pH, стабилизирующие агенты, консерванты, глицерин, спирт, карбонизирующие агенты, используемые для изготовления газированных напитков, и др. Также функциональный продукт лечебного питания по изобретению может включать фрукты, как при изготовлении натуральных фруктовых соков и сокосодержащих напитков (фруктовых и овощных).

В некоторых воплощениях изобретения предлагаются композиции квазимедикаментов для предотвращения ревматоидного артрита или улучшения состояния страдающего им больного, которые содержат моноацетилдиацилгдицерин, описываемый формулой 1, в качестве активного ингредиента,

где R1 и R2 независимо друг от друга представляют (не ограничиваясь указанным здесь) остаток жирной кислоты из 14-20 атомов углерода.

В частности, моноацетилдиацилглицерины по изобретению можно включать в состав квази-медикаментов для предотвращения ревматоидного артрита или улучшения состояния больного.

Термин «квази-медикамент» означает продукт из следующих категорий: (a) волокна, резиновые и подобные им продукты, используемые с целью лечения, облегчения или предотвращения заболеваний человека или животных; (b) продукты, не являющиеся механизмами или предметами оборудования, оказывающие незначительное или непрямое воздействие на человеческий организм; и (c) препараты, используемые для стерилизации, уничтожения насекомых-вредителей и сходных целей, чтобы предотвратить передачу заразных заболеваний между индивидами. Однако термин «квази-медикамент» не включает (a) продукты, используемые для целей диагностики, медицинского ухода, облегчения состояния больного, лечения или предотвращения заболеваний людей или животных, исключая устройства, механизмы и предметы оборудования; или (b) продукты, не являющиеся устройствами, механизмами или предметами оборудования, используемые для целей достижения фармакологического эффекта в отношении структур или функций организма человека или животных. Квази-медикаменты включают препараты наружного применения для кожи и продукты для личной гигиены.

Композиция квази-медикамента по изобретению для предотвращения ревматоидного артрита или улучшения состояния больного может состоять только или в основном из моноацетилдиацилглицеринов в чистом виде или может включать моноацетилдиацилглицерин и другие ингредиенты, обычно используемые в квази-медикаментах. Количество моноацетилдиацилглицерина в квази-медикаменте определяется соответственно предполагаемому применению продукта. Препараты наружного применения для кожи, в состав которых могут входить соединения по изобретению, включают, например, мази, лосьоны, разбрызгиваемые препараты, наклейки/пластыри, кремы, порошки/присыпки, суспензии и гели, не ограничиваясь перечисленным здесь.

В некоторых воплощениях изобретения предлагаются способы для предотвращения или лечения ревматоидного артрита, включающие введение эффективного количества композиции, содержащей соединение, описываемое формулой 1, нуждающемуся в том индивиду. Выражение «нуждающийся в том индивид» включает любое животное или человека, которые больны ревматоидным артритом или подвержены риску его развития. Ревматоидный артрит можно лечить или предотвращать путем введения эффективного количества соединения, описываемого формулой 1, нуждающемуся в том индивиду. Термин «введение» означает, что фармацевтическая композиция по изобретению каким-либо подходящим способом попадает в организм нуждающегося в том индивида. Композиция по изобретению может вводиться в организм индивида различными способами, обычно применяемыми для введения лекарственных препаратов, например пероральным или не пероральным путем.

В некоторых воплощениях изобретения предлагаются способы для предотвращения или лечения ревматоидного артрита, включающие введение эффективного количества композиции, содержащей соединение, описываемое формулой 1, нуждающемуся в том индивиду. Сколько нужно вводить препарата суммарно за сутки, определяет врач; обычно суточная доза составляет от около 0,001 мг/кг массы тела пациента до около 1000 мг/кг, предпочтительно от около 0,05 мг/кг до около 200 мг/кг, более предпочтительно от около 0,1 мг/кг до около 100 мг/кг. Суточная доза может быть введена в один прием (раз в день) или в несколько приемов на протяжении суток. Впрочем, конкретное терапевтически эффективное количество

моноацетилдиацилглицеринов для индивида варьирует в зависимости от характера и выраженности желаемой реакции организма в ходе лечения, состава композиции, в том числе от присутствия в ней другого активного агента, возраста, массы тела, общего состояния здоровья, пола и питания индивида, времени и пути введения препарата, соотношения компонентов в композиции, продолжительности курса лечения, других препаратов, используемых параллельно с данным в ходе лечения, и различных других факторов, известных в области медицины.

Полезный эффект изобретения

Моноацетилдиацилглицерины по изобретению эффективно подавляют фосфорилирование STAT-3, служащего терапевтической мишенью в случае ревматоидного артрита. Поскольку моноацетилдиацилглицерины, будучи эффективными терапевтическими агентами, не токсичны, они не обладают побочными эффектами, свойственными существующим на сегодняшний день препаратам для лечения ревматоидного артрита. Таким образом, эти соединения можно использовать для предотвращения или лечения ревматоидного артрита или облегчения состояния больного.

Краткое описание чертежей

Фигура 1 представляет результаты исследования методом вестерн-блоттинга подавления фосфорилирования STAT-3, индуцированного IL-6, в клетках U937 под действием ЕС-18 в различных концентрациях. На фиг. (А) обработка клеток ЕС-18 продолжалась в течение 15 минут. На фиг. (В) обработка клеток ЕС-18 продолжалась в течение 60 минут.

Фигура 2 представляет результаты исследования методом вестерн-блоттинга подавления фосфорилирования STAT-3 (А) и STAT-1 (В), индуцированного форбол-12-миристат-13-ацетатом (РМА), в клетках NK-92 под действием ЕС-18 в различных концентрациях.

Фигура 3 представляет данные об активности STAT-3 в клетках А549 (А) и HepG2 (В), полученные путем определения интенсивности флуоресценции с помощью люциферазного репортера.

Фигура 4 представляет результаты определения концентрации интерлейкина-6 в сыворотке крови в день иссечения ткани у мышей интактных (группа «норма»), с экспериментально вызванным артритом (группа «отрицательный контроль»), получавших ЕС-18 (G3, G4, G5), ремикейд или метотрексат (группы G6 и G7).

Фигура 5 представляет результаты определения индекса активности артрита путем осмотра невооруженным глазом у мышей интактных (группа «норма»), с экспериментально вызванным артритом (группа «отрицательный контроль»), получавших ЕС-18 (группы G3, G4, G5), ремикейд или метотрексат (группы G6 и G7).

Фигура 6 представляет результаты определения индекса активности артрита по гистологической картине коленного сустава у мышей интактных (группа «норма»), с экспериментально вызванным артритом (группа «отрицательный контроль»), получавших ЕС-18 (группы G3, G4, G5), ремикейд или метотрексат (группы G6 и G7).

Фигуры 7 и 8 представляет микрофотографии окрашенной пораженной артритом ткани у мышей интактных (группа «норма»), с экспериментально вызванным артритом (группа «отрицательный контроль»), получавших ЕС-18 (группы G3, G4, G5), ремикейд или метотрексат (группы G6 и G7).

Примеры

Представленные ниже примеры, предлагаются для лучшего понимания изобретения. Однако изобретение этими примерами не ограничивается.

Пример. Культуры клеток

Человеческие клетки линий NK-92, U937, А549 и HepG2 из Американской коллекции клеточных культур (АТСС, Роквилл, шт. Мэриленд, США) культивировали при температуре 37°С во влажной атмосфере, содержавшей 5% СО₂. Клетки линии NK-92 культивировали в среде альфа-MEM (Life Technologies, Карлсруэ, Германия), содержавшей 10% фетальной телячьей сыворотки (FCS, HyClone, Логан, шт. Юта, США), 2 мМ L-глутамата, 100 мкг/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина (Life Technologies). Клетки линий U937, А549 и HepG2 культивировали в среде RPMI, содержавшей 10% фетальной телячьей сыворотки.

Экспериментальный пример 1. Подавление фосфорилирования STAT-3 в клетках U937 под действием ЕС-18

Клетки, обработанные ЕС-18 и цитокином IL-6, подвергали лизису холодным лизирующим буферным раствором, содержавшим SDS [(50 мМ HEPES; 150 мМ NaCl; 0,2 мМ EDTA; 0,5% NP-40; 0,1% SDS; 1 мМ Na₃VO₄; 10 мМ NaF и полный протеазный ингибирующий коктейль (Roche)] в течение 30 минут на льду. После разрушения клеток отделяли водный раствор от нерастворимого осадка путем центрифугирования лизата клеток в течение 30 минут при 13000 об/мин на высокоскоростной центрифуге. Определяли количество белка в полученном водном растворе и проводили его разделение путем электрофореза в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия (10-12% SDS-PAGE). Белки, разделившиеся в геле, переносили на поливинилиденфторидную (PVDF) мембрану (Millipore, Биллерика, шт. Массачусетс, США) в течение 2 часов при напряжении 100 В.

Для определения количества фосфорилированного STAT-3 нагруженную мембрану инкубировали с поликлональными кроличьими антителами против STAT1, STAT3 или с поликлональными кроличьими антителами против фосфорилированных STAT1, STAT3 (Cell signaling Technology, США) (1:1000), служившими первичными антителами, при комнатной температуре в течение 60 минут. Затем мембрану инкубировали с козьими антителами против кроличьего IgG, конъюгированными с пероксидазой хрена (Santa Cruz Biotechnology, США) (1:3000), служившими вторичными антителами, при комнатной температуре в течение 60 минут. Такое же количество клеточных белков подтверждалось с поликлональными кроличьими антителами против STAT1, STAT3. После инкубации с антителами мембрану инкубировали с раствором для усиления хемилюминесценции (ECL, Millipore, Биллерика, шт. Массачусетс, США) и экспонировали на рентгеновскую пленку. По полосе на пленке определяли количество фосфорилированного STAT-3.

Полученные результаты показывают, что STAT-3 фосфорилируется в результате обработки IL-6, причем количество фосфорилированного STAT-3 снижается в случае предварительной обработки ЕС-18 зависимым от концентрации последнего образом (см. фиг. 1А). Фиг. 1В демонстрирует, что подавление фосфорилирования STAT-3 под действием ЕС-18 сохраняется спустя 1 час.

Экспериментальный пример 2. Подавление фосфорилирования STAT-3 в клетках NK-92 под действием ЕС-18

Клетки, обработанные ЕС-18 и форбол-12-миристат-13-ацетатом (РМА), подвергали лизису холодным лизирующим буферным раствором, содержавшим SDS [(50 мМ HEPES; 150 мМ NaCl; 0,2 мМ EDTA; 0,5% NP-40; 0,1% SDS; 1 мМ Na₃VO₄; 10 мМ NaF и полный протеазный ингибирующий коктейль (Roche)] в течение 30 минут на льду. После разрушения клеток отделяли водный раствор от нерастворимого осадка путем центрифугирования лизата клеток в течение 30 минут при 13000 об/мин на высокоскоростной центрифуге. Определяли количество белка в полученном водном растворе и проводили его разделение путем электрофореза в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия (10-12% SDS-PAGE). Белки, разделившиеся в геле, переносили на поливинилиденфторидную (PVDF) мембрану (Millipore, Биллерика, шт. Массачусетс, США) в течение 2 часов при напряжении 100 В.

Для определения количества фосфорилированных STAT-3 и STAT-1 нагруженную мембрану инкубировали с поликлональными кроличьими антителами против STAT3, поликлональными кроличьими антителами против STAT1 или с поликлональными кроличьими антителами против фосфорилированного STAT3 (Cell Signaling Technology, США) (1:1000), служившими первичными антителами, при комнатной температуре в течение 60 минут. Затем мембрану инкубировали с козьими антителами против кроличьего IgG, конъюгированными с пероксидазой хрена (Santa Cruz Biotechnology, США) (1:3000), служившими вторичными антителами, при комнатной температуре в течение 60 минут. Такое же количество клеточных белков подтверждалось с поликлональными кроличьими антителами против STAT3. После инкубации с антителами мембрану инкубировали с раствором для усиления хемилюминесценции (ECL, Millipore, Биллерика, шт. Массачусетс, США) и экспонировали на рентгеновскую пленку. По полосе на пленке определяли количество фосфорилированного STAT.

Полученные результаты показывают, что в клетках NK-92 STAT-3 фосфорилируется в результате обработки IL-6, причем количество фосфорилированного STAT-3 снижается в случае предварительной обработки ЕС-18 зависимым от концентрации последнего образом (см. фиг. 2А). Но подавления фосфорилирования STAT-1 под действием ЕС-18 не происходит (см. фиг. 2В).

Экспериментальный пример 3. Определение подавления фосфорилирования STAT-3 под действием ЕС-18 с помощью люциферазного репортера

В клетки линий HepG2 и А549 ввели вектор pGL4.47[luc2P/SIE/Hygro] (Promega), содержащий sis-индуцируемый элемент (SIE), с которым связывается STAT-3. Для определения подавления активации STAT-3 под действием ЕС-18 клетки предварительно обрабатывали ЕС-18 и затем IL-10.

Клетки HepG2 и А549 диссоциировали путем обработки трипсином-EDTA, после чего наносили на культуральный планшет. С помощью реагента для трансфекции Attractene (Qiagen) клетки трансфицировали вектором pGL4.47[luc2P/SIE/Hygro] и инкубировали при температуре 37°С в атмосфере, содержавшей 5% СО₂, в течение суток. На следующий день клетки собирали с планшета и в количестве 0,1 мл наносили на 96-луночный планшет по 5×10⁴ клеток на лунку; инкубировали при температуре 37°С в атмосфере, содержавшей 5% СО₂, в течение суток. На следующий день клетки обрабатывали ЕС-18 в различных концентрациях в течение 1 часа, после чего обрабатывали IL-10 (10 нг/мл). Инкубировали при температуре 37°С в атмосфере, содержавшей 5% СО₂, в течение 6 часов, после чего определяли активность люциферазы, используя реагент ONE-Glo Luciferase Assay System (Promega). А именно, в каждую лунку вносили 0,1 мл смеси (1:1) реагента ONE-Glo Luciferase Assay System и субстрата. Через 3 минуты измеряли интенсивность флуоресценции с помощью многофункционального планшетного анализатора VICTOR X Multilabel Plate Reader (PerkinElmer) в течение 0,5 секунды.

В клетках, подвергавшихся предварительной обработке ЕС-18 в различных концентрациях, по сравнению с клетками, на которые воздействовали только IL-10, люциферазная флуоресценция была слабее, что указывало на пониженную активность STAT-3 в клетках, обработанных ЕС-18 (см. фиг. 3А и 3В). Полученные результаты свидетельствуют, что в клетках HepG2 и А549 активация STAT-3, индуцированная IL-10, под действием ЕС-18 подавляется.

Экспериментальный пример 4. Эффективность ЕС-18 для лечения артрита на животной модели

Для создания животной модели ревматоидного артрита это заболевание вызывали у самцов мышей линии DBA/1J путем введения коровьего коллагена типа II. Для оценки эффективности ЕС-18 для лечения (или облегчения) артрита его вводили подопытным животным перорально многократно. Для сравнения в группе особей, обозначенной «положительный контроль 1», мышам вводили внутрибрюшинно препарат ремикейд (Remicade), а в группе, обозначенной «положительный контроль 2» вводили перорально метотрексат. В этом эксперименте было семь групп по 10 особей в каждой: группа «норма» (G1); группа «отрицательный контроль» (G2); группы G3, G4 и G5, в которых животные получали ЕС-18 в дозах 125 мг/кг массы тела, 500 мг/кг массы тела и 2000 мг/кг массы тела соответственно; группа «положительный контроль 1» (G6), в которой животные получали ремикейд в дозе 20 мг/кг массы тела; группа «положительный контроль 2» (G7), в которой мыши получали метотрексат в дозе 2,5 мг/кг массы тела. В группах «норма» (G1) и «отрицательный контроль» (G2) животные получали оливковое масло. Во всех группах соответствующий агент вводили один раз в сутки на протяжении пяти недель (всего 35 введений). Ремикейд (G6) вводили внутрибрюшинно, а ЕС-18, метотрексат и оливковое масло перорально (принудительно). Во всех группах, кроме группы «норма» (G1), у мышей вызывали артрит путем двукратной иммунизации коровьим коллагеном типа II и полным или неполным адъювантом Фрейнда в виде эмульсии. В период наблюдения животных осматривали раз в сутки, отмечая типичные симптомы артрита; один раз в неделю измеряли массу тела; два раза в неделю определяли индекс активности заболевания путем осмотра невооруженным глазом; два раза в неделю измеряли толщину стопы.

На фиг. 4 представлены данные о концентрации интерлейкина-6 в сыворотке крови, собранной в день иссечения ткани. Как можно видеть на этой иллюстрации, в группе G2 («отрицательный контроль»), в которой у мышей коллагеном индуцировали артрит, уровень IL-6 значительно повышен, тогда как в группах, в которых животные получали ЕС-18 (G3, G4 и G5), уровень IL-6 был гораздо ниже, будучи сходным с таковым в группах «положительный контроль», в которых животные получали ремикейд или метотрексат (G6 и G7). На фиг. 5 представлены результаты определения индекса активности заболевания путем осмотра невооруженным глазом. Как видно на этой иллюстрации, индекс активности артрита в группах мышей, получавших ЕС-18 (G3, G4 и G5) значительно ниже, чем в группе «отрицательный контроль» (G2). На фиг. 6 представлены результаты оценки активности заболевания по гистологической картине (исследование коленного сустава обеих задних конечностей). Как можно видеть на этой иллюстрации, индекс активности артрита по гистологическим проявлениям в группе «отрицательный контроль» (G2), в которой у мышей был артрит, индуцированный коллагеном, индекс активности заболевания высокий, тогда как в группах, в которых животные получали ЕС-18 (G3, G4 и G5), он значительно ниже и сходен с таковым в группах «положительный контроль», в которых мышам вводили ремикейд или метотрексат (G6 и G7 соответственно). На фиг. 7 и 8 представлены микрофотографии окрашенных тканей, пораженных артритом, у мышей из групп «норма» (G1), «отрицательный контроль» (G2), группы, в которой животные получали ЕС-18 в дозе 500 мкг массы тела (G4), и группы, в которой животные получали ремикейд (G6) (на фиг. 7 увеличение 40×; на фиг. 8 увеличение ×100). Как можно видеть на фиг. 7 и 8, разрушение хряща и нарастание паннуса слабее в группах, в которых мыши получали ЕС-18 (G4) и ремикейд (G6), чем в группе «отрицательный контроль» (G2). Таким образом, в этом примере у животных с экспериментально вызванным артритом, степень развития которого определяли путем оценки невооруженным глазом, по толщине стопы, по уровню интерлейкина-6 (IL-6) в сыворотке крови, по концентрации иммуноглобулинов G, направленных против коллагена типа II (анти-CII)IgG, и по гистологической картине, индекс активности заболевания был высоким в группе «отрицательный контроль» по сравнению с группой «норма». Также полученные результаты свидетельствуют, что ЕС-18 эффективен для лечения артрита.

Из приведенного выше описания специалистам в данной области техники понятно, что изобретение может быть воплощено и в других конкретных вариантах без отклонения от технической сущности или существенных признаков изобретения. Поэтому описанные выше примеры следует рассматривать как во всех отношениях иллюстративные и не имеющие ограничительного характера. Имеется в виду, что объем изобретения включает все варианты в диапазоне, определяемым приведенным выше описанием и прилагаемой формулой изобретения, а не набор конкретных примеров; также в объем изобретения входят все модификации, проистекающие из эквивалентных вариантов.

1. Фармацевтическая композиция для лечения ревматоидного артрита, содержащая в качестве активного ингредиента эффективное количество моноацетилдиацилглицерина формулы 1

где R1 и R2 независимо друг от друга представляют остаток жирной кислоты из 14-20 атомов углерода и фармацевтически приемлемый носитель, в которой моноацетилдиацилглицерин подавляет фосфорилирование STAT-3.

2. Фармацевтическая композиция по п. 1, в которой R1 и R2 независимо друг от друга выбирают из группы, состоящей из пальмитоила, олеоила, линолеоила, линоленоила, стеароила, миристоила и арахидоноила.

3. Фармацевтическая композиция по п. 1, в которой R1 и R2 (R1/R2) выбирают из группы, состоящей из олеоила/пальмитоила, пальмитоила/олеоила, пальмитоила/линолеоила, пальмитоила/линоленоила, пальмитоила/арахидоноила, пальмитоила/стеароила, пальмитоила/пальмитоила, олеоила/стеароила, линолеоила/пальмитоила, линолеоила/стеароила, стеароила/линолеоила, стеароила/олеоила, миристоила/линолеоила, миристоила/олеоила.

4. Фармацевтическая композиция по п. 1, в которой соединение, описываемое формулой 1, является соединением формулы 2

5. Фармацевтическая композиция по п. 1, в которой моноацетилдиацилглицерин, описываемый формулой 1, является природным веществом, выделенным из оленьих рогов.

6. Фармацевтическая композиция по п. 1, которая содержит моноацетилдиацилглицерин, описываемый формулой 1, в количестве от 0,001 до 50% от общей массы композиции.

7. Способ лечения ревматоидного артрита, включающий введение пациенту, не являющемуся человеком, композиции по любому из пп. 1-6.