Способ вживления оптоволоконного зонда в мозг животного с контролируемой обратной связью

Изобретение относится к области оптогенетики. Оптоволоконный зонд содержит оптическое волокно и фиксируемый наконечник. Рассчитывают длину оптического волокна, необходимую для достижения заданной области мозга. Закрепляют оптическое волокно в наконечнике так, чтобы из наконечника выступало оптическое волокно рассчитанной длины. Животное наркотизируют, снимают скальп с части черепа, формируют отверстие в черепе по стереотаксическим координатам и вводят волокно оптоволоконного зонда в отверстие. Одновременно с введением зонда в режиме обратной связи генерируют лазерное излучение с мощностью и длиной волны, достаточными для активации оптического сигнала в клетках мозга животного. Передают лазерное излучение по оптическому волокну зонда к его дистальному концу и регистрируют оптический сигнал от клеток мозга. При получении заданной амплитуды оптического сигнала или заданного изображения клеток мозга наконечник фиксируют непосредственно на черепе или на предварительно закрепленном на черепе внешнем относительно наконечника держателе. Способ обеспечивает точное позиционирование дистального конца оптического волокна внутри мозга животного, надежность крепления и возможность проводить наблюдения в течение длительного времени, что достигается вышеуказанными приемами способа. 8 з.п. ф-лы, 7 ил.

 

Область техники

Предлагаемое техническое решение относится к области оптогенетики, а именно к способам вживления оптического зонда в мозг лабораторного животного.

Уровень техники

Современные оптические методы и волоконно-оптические технологии играют все более заметную роль в исследованиях нейрофизиологических и когнитивных функций, что связано с их малой инвазивностью, эффективностью, высоким пространственным (вплоть до субклеточного) разрешением. Использование волоконных зондов (часто также употребляется термин волоконные нейроинтерфейсы) является одним из магистральных направлений в задачах нейрофотоники и оптогенетики: A.M. Aravanis, et al., J. Neural Eng. 4, S143 (2007); D.R. Sparta, et al., Nature Protocols 7, 12 (2012); G D. Stuber, et al., Nature 475, 377 (2011); L.V. Doronina-Amitonova, Scientific Reports 3, 3265 (2013). Волоконно-оптические нейроинтерфейсы обеспечивают уникальные возможности для оптогенетического нейростимулирования на различные фармакологические и физиологические стимулы, а также долговременной регистрации процессов в глубоких слоях мозга свободнодвижущихся животных. Важной задачей, решаемой с помощью волоконных нейроинтерфейсов, является оптическая регистрация функциональной активности отдельных групп или отдельных прицельно выбранных нейронов головного мозга, что требует точного адресного позиционирования волоконного зонда в нужную область мозга с точностью порядка размера одного нейрона (5-10 мкм).

Для реализации задачи точного позиционирования волоконного зонда необходимо зафиксировать голову животного и надежно закрепить зонд (нейроинтерфейс) на черепе животного, при этом необходимо обеспечить условие, чтобы дистальный конец оптического волокна был расположен в выбранной части мозга. Основной проблемой является точность позиционирования, поскольку, несмотря на известные анатомические особенности структуры мозга, вживление осуществляется с ошибками, в частности, определяемыми индивидуальными особенностями животных, что в результате не позволяет гарантированно вживлять зонд к определенному нейрону.

Способы установки оптического зонда описаны, например, в патенте US 9238150 (абз. 0065). Вживление зонда включает анестезию животного, удаление шерсти, сверление отверстий с помощью стереотаксических приспособлений, введение зонда заранее выбранной длины и закрепление зонда. Точность установки дистального конца волокна играет ключевую роль в правильном выборе исследуемого участка мозга. Однако из-за индивидуальных особенностей строения и развития животных дистальные концы зондов одинаковой длины могут оказаться в различных слоях мозга.

Известен способ установки оптоволоконного зонда с помощью специального крепления, патент US 9107575. При таком способе на череп животного крепят специальное приспособление, через отверстие в котором вводят оптическое волокно. Приспособление позволяет направить волокно под углом, выбранным с помощью стереотаксической методики. Однако глубина размещения дистального конца волокна может варьироваться. Кроме того, при проведении экспериментов через длительный промежуток времени оптическое волокно необходимо будет вставлять в приспособление на ту же глубину, что трудно осуществить. Кроме того, возможна ошибка эксперимента, связанная с повреждениями мозга при повторной установке оптического волокна.

Раскрытие изобретения

Задачей изобретения является разработка способа вживления оптоволоконного зонда в мозг животного для реализации долговременных экспериментов по оптической регистрации функциональной активности выбранной группы нейронов (или одного нейрона). Способ должен обеспечить точное адресное и малоинвазивное позиционирование дистального конца оптического волокна внутри мозга животного.

Для решения поставленной задачи предложен способ вживления в мозг генно-модифицированного животного с встроенными светочувствительными белками оптоволоконного зонда, содержащего оптическое волокно и фиксируемый наконечник, при котором рассчитывают длину оптического волокна, необходимую для достижения заданной области мозга, закрепляют оптическое волокно в наконечнике так, чтобы из наконечника выступало оптическое волокно рассчитанной длины, животное наркотизируют, снимают скальп с части черепа животного, достаточной для закрепления оптоволоконного зонда, формируют отверстие в черепе по стереотаксическим координатам, вводят волокно оптоволоконного зонда в отверстие, одновременно с введением зонда в режиме обратной связи генерируют лазерное излучение с мощностью и длиной волны, достаточными для активации оптического сигнала в клетках мозга животного, передают лазерное излучение по оптическому волокну зонда к его дистальному концу и регистрируют оптический сигнал от клеток мозга животного, наконечник фиксируют непосредственно на черепе животного или на предварительно закрепленном на черепе внешнем относительно наконечника держателе при получении заданной амплитуды оптического сигнала или заданного изображения клеток мозга. Фиксация наконечника с помощью клея может происходить как непосредственно на черепе животного (Фиг 1а), так и во внешнем держателе, заранее прикрепленном на череп животного (Фиг. 1б). При креплении наконечника (ферулы) непосредственно на череп животного возможна лишь небольшая корректировка по глубине вживления - порядка 200-300 мкм - за счет формирования тонкого слоя клея между наконечником и черепом (ограничение по толщине в данном случае диктуется требованием надежности фиксации ферулы с волокном на черепе животного, а также избеганием попадания клея внутрь отверстия). При фиксации наконечника в предварительно закрепленном внешнем держателе возможна значительно большая корректировка по глубине вживления. В этом случае предварительно приклеивают внешний держатель к черепу животного, при этом ось отверстия внешнего держателя и ось отверстия в черепе должны совпадать. Подобная схема может обеспечить гораздо большую амплитуду корректировки положения дистального конца волокна - до двух миллиметров. При достижении необходимого уровня измеряемого сигнала наконечник фиксируют и приклеивают непосредственно к внешнему держателю. Предлагаемый способ вживления зонда в заданную область мозга обеспечивает точное позиционирование зонда, которое достигается за счет обратной связи, позволяющей контролировать положение дистального конца волокна относительно нейронных клеток, и прецизионной корректировкой глубины проникновения зонда. Этот способ позволяет исключить влияние индивидуальных фенотипических особенностей животного, а также дает возможность получить дополнительную информацию, например, о распределении в головном мозге животного с измененным геномом светочувствительных нейронов уже в процессе установки зонда. Но самое важное то, что способ позволяет позиционировать дистальный конец волокна именно в заданную область с точностью до размеров одного отдельного нейрона с заранее известными характеристиками оптического отклика.

Необходимым условием проведения подобных исследований является использование генно-модифицированных животных, обладающих встроенными светочувствительными флуоресцирующими белками. Современная генная инженерия обеспечивает широкий спектр возможностей для генетического маркирования функционально значимых нейронных клеток не только для оптической регистрации активности клеток, но также и для оптического управления функциональной активностью животных, в частности, при использовании оптических волоконных зондов.

Сигнал от клеток мозга животного наблюдают посредством системы оптической регистрации и контроля на основе компьютера, которая может содержать элементы оптической фильтрации (пассивные фильтры или спектрометр), одноканальные (фотоэлектронные умножители, фотодиоды) или многоканальные (ПЗС камеры) детекторы, компьютер для анализа сигнала или изображений. Способ позволяет наблюдать оптический отклик флуоресценции клеток головного мозга животного непосредственно в процессе установки зонда (нейроинтерфейса), что обеспечивает высокую точность (до нескольких микрометров) позиционирования дистального конца оптического волокна.

Волокно оптоволоконного зонда (нейроинтерфейса) вводят с помощью автоматизированного препаратоводителя стереотаксиса, соединенного с компьютером, что позволяет автоматически позиционировать дистальный конец волокна. Так как система оптической регистрации и контроля и автоматизированный препаратоводитель стереотаксиса соединены с компьютером, в процессе введения оптоволоконного зонда реализуется обратная связь за счет получения информации о распределении светочувствительных клеток в головном мозге животного вблизи дистального конца волокна и соответствующей прецизионной корректировки его положения.

Наконечник фиксируют в два этапа, на первом этапе закрепляют наконечник быстросохнущим клеем, на втором этапе через промежуток от 2 до 8 минут фиксируют наконечник смесью быстросохнущего клея и зубного цемента. В качестве быстросохнущего клея может быть использован цианоакрилатный клей. При креплении наконечника непосредственно на черепе животного приготовленную смесь цемента с клеем наносят таким образом, чтобы как минимум 1/3 наружной части ферулы была покрыта клеем. На черепе цемент должен покрывать всю область оголенной кости, но не заходить на края кожных лоскутов вокруг операционного поля. Клей позволяет быстро закрепить наконечник (ферулу) на черепе животного в выбранном положении, что обеспечивает точность фиксации зонда, смесь клея с цементом обеспечивает надежность крепления в течение длительного времени и длительность проводимых экспериментов. В случае использования внешнего держателя вначале процедуры его закрепляют на черепе животного с помощью смеси цемента с клеем. Необходимая соосность отверстия в черепе и нейроинтрефеса обеспечивается за счет удержания наконечника с волокном в держателе во время процедуры приклеивания. Далее порядок крепления повторяет предыдущий случай, только вклеивание наконечника происходит не к черепу животного, а к внешнему держателю.

Оптическое волокно оптоволоконного зонда является многосердцевинным оптическим волокном с тысячами отдельных световодов микронного размера, что позволяет получать флуоресцентные изображения от дистального конца волокна непосредственно в процессе его установки, и наконечник фиксируют при получении выбранного изображения. Использование многоканального оптического волокна позволяет уже на этапе установки волокна получить подробную информацию о структуре выбранной области.

Оптическое волокно является односердцевинным волокном с внешним диаметром не более 250 мкм, наконечник фиксируют при получении выбранной интенсивности оптического сигнала от клеток мозга животного. В случае использования односердцевинного волокна измеряется интегральный сигнал флуоресценции от одной или группы клеток мозга животного, и наконечник фиксируют при получении заданной интенсивности оптического сигнала флуоресценции или функции интенсивности при сканировании зондом сигнала от клеток мозга животного. Для уменьшения области мозга, облучаемой излучением накачки, и соответственно более точной адресации к одному нейрону диаметр сердцевины волокна должен быть сравним (или меньше) с размером области локализации одного нейрона порядка 5-30 микрометров. Современные оптические технологии позволяют изготавливать волокна с подобными параметрами, при этом структура волокна может изменяться в широких пределах для обеспечения оптимальных значений параметров возбуждения и сбора сигнала флуоресценции от нейронов мозга животного. В случае использования волокон с малой сердцевиной с большой долей вероятности будет наблюдаться сигнал от одного нейрона, тогда при перемещении дистального конца оптоволоконного зонда в глубину мозга интенсивность оптического отклика будет аналогична функции, представленной на Фиг. 3. В случае использования волокон с большой сердцевиной увеличивается общий уровень получаемого сигнала флуоресценции, но в данном случае высока вероятность регистрации сигнала от нескольких нейронов, и зависимость интенсивности флуоресценции от положения дистального конца волокна может быть более сложной.

В зависимости от задачи исследований фиксируют оптоволоконный зонд на черепе животного при получении максимального оптического сигнала (или определенной функции при сканировании волокна «вверх-вниз») от клеток мозга, или фиксируют оптоволоконный зонд при возникновении оптического сигнала от клеток мозга животного, или фиксируют оптоволоконный зонд при уменьшении оптического сигнала от клеток мозга животного. Поскольку нейроны головного мозга расположены слоями, предлагаемый способ позволяет установить зонд на внешней границе слоя (при возникновении сигнала), в области с максимальным количеством светочувствительных клеток (при получении максимального сигнала), на внутренней границе слоя (при уменьшении сигнала).

Техническим результатом предлагаемого технического решения является обеспечение высокой точности позиционирования порядка нескольких микрометров дистального конца оптоволоконного зонда за счет обеспечения обратной связи, заключающейся в непрерывной регистрации оптического сигнала флуоресценции от исследуемого нейрона (группы нейронов) или получении изображения исследуемой части мозга во время процедуры вживления, возможность получения дополнительной информации в процессе установки зонда, надежность крепления зонда.

Краткое описание чертежей

Фиг. 1. Способы фиксации нейроинтерфейса: непосредственно на черепе животного (а), с использованием внешнего направляющего держателя (б).

Фиг. 2. Схема установки, позволяющая осуществить предлагаемый способ.

Фиг. 3. Изображение трансгенной мыши (а) с вживленными волокнами с диаметром сердцевины 50 мкм (б) и 300 мкм (с).

Фиг. 4. Пример локализации одного нейрона вблизи дистального конца односердцевинного оптического волокна (слева) и оптический отклик в случае различного положения нейрона относительно дистального конца волокна.

Фиг. 5. Изображение нейрона на глубине 600 мкм, полученное с помощью многоканального волокна.

Фиг. 6. Изображения, полученные с помощью многоканального волокна, нейронов на глубине около 800 мкм до фиксации наконечника (а) и после нанесения клея (б).

Фиг. 7. Фотографии, иллюстрирующие проверку надежности и работоспособности зонда и способа его вживления в серии нейрофизиологических тестов: общий вид с размещением животного в тесте «открытое поле» (а); тест «приподнятый крестообразный лабиринт» для исследования поведения мышей с вживленным зондом (б); тест «ротарод» с исследуемым и контрольным животными (в).

Осуществление изобретения

Для проведения экспериментов был осуществлен подбор координат ряда анатомических структур мозга трансгенных мышей, у которых искусственно экспрессируются маркерные флуоресцентные белки, в частности EGFP (enhanced green fluorescence protein). При проведении операции проводили стереотаксическое позиционирование зонда. После подготовки поверхности черепа определяли место на черепе, где должно располагаться трепанационное отверстие для вживления оптоволокна зонда. Для этого использовали атлас мозга мыши в стереотаксических координатах. С помощью атласа определяли положение интересующей анатомической структуры в трехмерной системе декартовых координат, нулевой точкой отсчета которой является точка Брегма - место схождения сагиттального и коронарного швов. Координаты определяли в рострокаудальном направлении (в направлении к носу - «+», в направлении затылка - «-»), в медиолатеральном (в направлении правого уха - «+», в направлении левого уха - «-»), и в дорсовентральном (глубина залегания структуры относительно поверхности мозга на уровне Брегмы). Для соответствия вживляемого нейроинтерфейса выбранной структуре мозга в дорсовентральном направлении выбиралось оптическое волокно необходимой длины.

В соответствии с заявляемым решением возможно использование двух схем крепления волоконно-оптического зонда (нейроинтерфеса) непосредственно на черепе животного. Первая схема представлена на Фиг. 1а и заключается в креплении наконечника/ферулы (1) с оптоволокном (2) непосредственно на черепе (4) животного с помощью смеси цианоакрилатного клея и цемента (3). Вторая схема представлена на Фиг. 1б и заключается в первоначальном креплении внешнего держателя (5) посредством смеси цианоакрилатного клея и зубного цемента (3) на череп (4) животного при соблюдении соосности отверстия в черепе и внешнего держателя и последующей фиксации наконечника (2)) с оптоволокном (1) на внешний держатель (5) с помощью смеси (3).

В работе были использованы размыкаемые оптоволоконные зонды, содержащие первую часть, закрепляемую на черепе животного, с оптоволокном и керамическим цилиндрическим наконечником/ферулой, вторую часть зонда (6) с длинным отрезком аналогичного оптоволокна, содержащую ответную керамическую ферулу и коннектор, обеспечивающий плотное прилегание и надежное крепление первой и второй частей оптоволоконного зонда. Длина дистального конца оптического волокна первой части, выступающего из наконечника, определялась как сумма толщины черепной кости животного 250 мкм и глубины необходимого проникновения в мозг животного относительно внутренней поверхности кости черепа. Следуя этому определению, длина оптического волокна для зоны бочонковых полей первичной соматосенсорной коры должна составлять 1000 мкм; для области СА1 гиппокампа - 1750 мкм; для миндалины, базального ядра - 4000 мкм. Выбор данных структур головного мозга был обусловлен их локализацией и необходимостью оценки в дальнейшем эффективности функционирования оптоволоконного зонда на различной глубине вживления оптоволокна. Оптическое волокно зачищали от внешней пластиковой оплетки на некоторую длину, затем на нужном расстоянии от конца на оптоволокне делалась засечка с помощью специального резака. После этого оптоволокно аккуратно скалывали на месте засечки. С помощью микроскопа дополнительно измеряли длину полученного дистального конца волокна и визуально определяли качество торцов (отсутствие сколов и загрязнений). Оптоволокно первой части зонда заданной длины фиксировали в керамическом наконечнике так, чтобы с лицевой стороны наконечника торец волокна находился в плоскости наконечника, а с обратной выступал на необходимую длину, соответствующую глубине залегания выбранной структуры мозга и толщине кости черепа. Вторая часть зонда содержит длинный отрезок оптоволокна, обеспечивающий соединение с лазерной системой возбуждения, системой измерения и контроля, а также обеспечивает свободное перемещение животного во время экспериментов. Вторая часть зонда прикрепляется к первой только в процессе установки зонда и далее во время проведения экспериментов с животными.

С помощью затупленной иглы, закрепленной в препаратоводителе стереотаксиса, на поверхности черепа отмечали расположение целевой анатомической структуры. С помощью высокоскоростной дрели и сверла с головкой диаметром 0,6 мм высверливали округлое трепанационное отверстие в черепе. Оптоволокно нейроинтерфейса закрепляли в препаратоводителе стереотаксиса и опускали в трепанационное отверстие.

На Фиг. 2 представлена схема эксперимента. Система оптоволоконного зонда должна содержать несколько обязательных элементов: лазерную систему возбуждения (7), обладающую необходимой мощностью и длиной волны для возбуждения оптического сигнала флуоресценции; системы оптического разделения возбуждающего лазерного излучения и полезного оптического сигнала (8), что обычно достигается использованием дихроичного фильтра; системы заведения/сканирования (9) и фокусировки (10) излучения в волокно; волоконный зонд, который крепится на черепе животного и состоит из двух основных элементов - оптического волокна (2) и наконечника (1), который может соединяться со второй ответной частью зонда (6) в случае наличия в конструкции функции размыкаемости. Непосредственно само оптическое волокно (2) может иметь разное строение оболочки и сердцевины: быть одномодовым или многомодовым, обладать одной сердцевиной или являться многоканальным и др. Голову анестезированного животного фиксируют в стереотаксисе (11), волокно оптоволоконного зонда вводят с помощью автоматизированного препаратоводителя (12), соединенного с компьютером. Сигнал от клеток мозга животного наблюдают посредством системы оптической регистрации (13) и контроля на основе компьютера (14), что позволяет позиционировать дистальный конец нейроинтерфейса в выбранной области мозга с высокой точностью за счет обратной связи уже на этапе установки волокна, а также получать подробную информацию от выбранной области мозга. В предлагаемой схеме препаратоводитель стереотаксиса (12) автоматически размещает дистальный конец оптического волокна зонда в позиции, соответствующей заданной области мозга. В силу индивидуальных особенностей животного возможны ошибки в его точном позиционировании, но за счет наличия обратной связи оператор или автоматизированное программное обеспечение имеют возможность остановить процесс введения волокна при получении заданных изображений (в случае многоканального волокна) или зависимостей интенсивности оптического отклика от нейронов мозга животного. Возможна корректировка точного положения дистального конца волокна за счет сканирования волокна «вверх-вниз». В силу реальной необходимости сканирования зонда лишь в малых пределах 300-400 мкм и малым количеством (вплоть до одного) циклов сканирования, подобная процедура является малоинвазивной для тканей мозга животного. После определения точного заданного положения дистального конца оптоволокна (2), закрепленного в наконечнике (1), наконечник фиксируют на черепе животного.

В представленных работах фиксация наконечника (1) проходила непосредственно на черепе животного (Фиг. 1а) в два этапа. На первом этапе каплей цианоакрилатного клея фиксировали наконечник (1) с закрепленным в нем волокном (2) в выбранном положении. Затем отсоединяли вторую размыкаемую часть зонда (6) и готовили смесь из цианоакрилатного клея и порошка зубного цемента (Stoelting, США) в соотношении 1:1. Далее закрепляли наконечник на черепе с помощью приготовленной смеси цемента с клеем, при этом смесь наносили таким образом, чтобы как минимум 1/3 наружной части наконечника была покрыта. На череп цемент наносили так, чтобы он покрывал всю область оголенной кости, но не заходил на края кожных лоскутов вокруг операционного поля.

В работе использовались генно-модифицированные мыши линии Thyl-EGFP, и на Фиг. 3а представлена фотография мыши с вживленными волокнами, при этом на Фиг. 3 показано изображение участков мозга с вживленными односердцевинным волокном с диаметром сердцевины 50 мкм (б) и многосердцевинным волокном с диаметром сердцевины 300 мкм (в). В качестве источника излучения использовался непрерывный лазер на длине волны 473 нм с мощностью до 10 мВт. Регистрация сигнала осуществлялась фотоэлектронным умножителем и анализировалась с помощью персонального компьютера. При этом система возбуждения и регистрации были размещены на единой компактной базе, что обеспечивает мобильность и удобство использования всей системы в целом. На Фиг. 4 представлена схема локализации одного нейрона вблизи дистального конца односердцевинного оптического волокна (слева) и функция регистрируемого оптического отклика в случае различного положения нейрона вблизи дистального конца волокна (справа). Таким образом, предварительный анализ позволяет фиксировать положение наконечника с закрепленным одноканальным оптоволокном при достижении заданного уровня оптического сигнала. Для уменьшения влияния индивидуальных особенностей на уровень сигнала флуоресценции и соответственно более точного определения позиции дистального конца оптоволокна необходимо провести сканирование, чтобы получить функцию, аналогичную представленной на Фиг. 4, проанализировать и выбрать положение дистального конца оптоволокна с высокой точностью (вплоть до нескольких микрометров).

В экспериментах также были использованы многоканальные оптические волокна с микронным размером отдельных световодов, позволяющие получить изображения нейронов и соответственно детальную информацию о процессах, происходящих в нейронах головного мозга свободноживущих животных, и обеспечить адресное воздействие на отдельные клетки. Выбор такого волокна также позволяет повысить точность позиционирования зонда за счет получения изображений распределения нейронов от дистального конца волокна. Нами использовалось многоканальное волокно с внешним диаметром 600 мкм, содержащее шесть тысяч индивидуальных световодных каналов с диаметром сердцевин около 2.4 мкм, расположенных на расстоянии порядка 3 мкм друг относительно друга. На Фиг. 5 представлено изображение первого нейрона, обнаруженного на глубине около 500 мкм в коре мозга мыши Thyl-EGFP при опускании зонда в мозг животного. Шкала линейки 50 мкм, представлены две фотографии с различным увеличением. На Фиг. 6 показаны изображения нейронов, полученные на глубине около 800 мкм, до фиксации наконечника (а) и после его фиксации клеем (б) согласно описанной выше процедуре. Изображения до и после нанесения клея идентичны, что свидетельствует о том, что фиксация с помощью быстросохнущего клея не вносит возмущения и обеспечивает необходимую точность позиционирования.

Качество фиксации оптического волокна нейроинтерфейса, вживленного экспериментальным животным, проверяли визуально ежедневно в течение 60 дней. Количество экспериментальных животных с отпавшим нейроинтерфейсом составило 14% через 50 дней. Причем потеря нейроинтерфейса впервые наблюдалась на 50 день. Предлагаемый способ фиксации позволяет надежно закрепить нейроинтерфейс на черепе животного и проводить наблюдения в течение длительного времени. Животные с вживленными зондами проходили различные нейрофизиологические тесты в специальных сертифицированных устройствах «ротарод», «открытое поле», «крестообразный лабиринт». Поведение животных в процессе тестирования автоматически фиксировалось камерой. На Фиг. 7 представлены примеры использования подобных нейрофизиологических тестов. В целом проведенные долговременные эксперименты продемонстрировали высокую точность позиционирования зонда в выбранном участке мозга и качество фиксации.

Таким образом, в результате экспериментального применения указанного способа продемонстрировано, что дистальный конец оптического волокна можно разместить в выбранной области мозга животного с высокой точностью (вплоть до нескольких микрометров), оптоволоконный зонд надежно закрепляется на черепе животного, отсутствует смещение дистального конца оптоволоконного зонда относительно структур и клеток мозга. Указанные особенности позволяют регистрировать оптический отклик из выбранной области мозга животного в течение длительного времени, что в целом обеспечивает возможность долговременной регистрации нейрофизиологических процессов в глубоких слоях мозга свободнодвижущихся животных.

1. Способ вживления в мозг генно-модифицированного животного с встроенными светочувствительными белками оптоволоконного зонда, содержащего оптическое волокно и фиксируемый наконечник, при котором рассчитывают длину оптического волокна, необходимую для достижения заданной области мозга, закрепляют оптическое волокно в наконечнике так, чтобы из наконечника выступало оптическое волокно рассчитанной длины, животное наркотизируют, снимают скальп с части черепа животного, достаточной для закрепления оптоволоконного зонда, формируют отверстие в черепе по стереотаксическим координатам, вводят волокно оптоволоконного зонда в отверстие, отличающийся тем, что одновременно с введением зонда в режиме обратной связи генерируют лазерное излучение с мощностью и длиной волны, достаточными для активации оптического сигнала в клетках мозга животного, передают лазерное излучение по оптическому волокну зонда к его дистальному концу и регистрируют оптический сигнал от клеток мозга животного, наконечник фиксируют непосредственно на черепе животного или на предварительно закрепленном на черепе внешнем относительно наконечника держателе при получении заданной амплитуды оптического сигнала или заданного изображения клеток мозга.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что сигнал от клеток мозга животного наблюдают посредством системы оптической регистрации и контроля на основе компьютера.

3. Способ по п. 2, отличающийся тем, что волокно оптоволоконного зонда вводят с помощью автоматизированного препаратоводителя стереотаксиса, соединенного с компьютером.

4. Способ по. 1, отличающийся тем, что наконечник фиксируют в два этапа, на первом этапе закрепляют наконечник быстросохнущим клеем, на втором этапе через промежуток от 2 до 8 мин окончательно фиксируют наконечник смесью быстросохнущего клея и зубного цемента.

5. Способ по п. 3, отличающийся тем, что оптическое волокно оптоволоконного зонда является многосердцевинным оптическим волокном с тысячами отдельных световодов микронного размера, наконечник фиксируют при получении выбранного изображения от дистального конца волокна.

6. Способ по п. 3, отличающийся тем, что оптическое волокно является односердцевинным волокном с внешним диаметром не более 250 мкм, наконечник фиксируют при получении выбранной интенсивности оптического сигнала от клеток мозга животного.

7. Способ по п. 6, отличающийся тем, что фиксируют оптоволоконный зонд на черепе животного при получении максимального оптического сигнала от клеток мозга.

8. Способ по п. 6, отличающийся тем, что фиксируют оптоволоконный зонд при возникновении оптического сигнала от клеток мозга животного.

9. Способ по п. 6, отличающийся тем, что фиксируют оптоволоконный зонд при уменьшении оптического сигнала от клеток мозга животного.