Гуманизированные не относящиеся к человеку животные с ограниченными локусами тяжелой цепи иммуноглобулина

Изобретение относится к области биохимии, в частности к мыши, содержащей в своей зародышевой линии нереаранжированную геномную последовательность человека, содержащую единственный генный сегмент VH человека, который представляет собой VH1-2, VH1-69, один или несколько генных сегментов DH человека и один или несколько генных сегментов JH человека, и вставленную последовательность, которая кодирует белок ADAM6a мыши и белок ADAM6b мыши, к клетке, полученной из нее, а также к способу получения реаранжированной последовательности вариабельной области тяжелой цепи иммуноглобулина человека, способу получения антитела и способу получения антигенсвязывающего белка человека с использованием вышеуказанной мыши. Также раскрыт способ модификации локуса тяжелой цепи иммуноглобулина мыши, предусматривающий вставку одной или нескольких нереаранжированных генных последовательностей иммуноглобулина человека в локус тяжелой цепи иммуноглобулина мыши, а также модификацию, которая восстанавливает активность ADAM6 у мыши. Изобретение позволяет эффективно получать последовательности вариабельной области иммуноглобулина человека. 6 н. и 22 з.п. ф-лы, 10 ил., 3 табл., 2 пр.

 

Область техники, к которой относится настоящее изобретение

Предусмотрены генетически сконструированные не относящиеся к человеку животные, которые характеризуются пониженной сложностью вариабельных генов тяжелой цепи иммуноглобулина, причем не относящиеся к человеку животные способны экспрессировать белок ADAM6 или его функциональный фрагмент. Описаны генетически сконструированные не относящиеся к человеку животные, которые экспрессируют антитела из ограниченного числа вариабельных генных сегментов тяжелой цепи иммуноглобулина и/или их вариантов, причем не относящиеся к человеку животные не содержат функциональный эндогенный ген ADAM6, но сохраняют функцию ADAM6, включая в себя мышей, которые содержат модификацию эндогенного локуса вариабельной области тяжелой цепи (VH) иммуноглобулина, который делает мышь неспособной вырабатывать функциональный белок ADAM6 и приводит к потере фертильности. Описаны генетически модифицированные мыши, содержащие локус VH иммуноглобулина, характеризующийся ограниченным числом генных сегментов VH, например, единственным сегментом VH иммуноглобулина, например, генным сегментом VH1-69 человека или генным сегментом VH1-2 человека, и которые дополнительно содержат функцию ADAM6, включая в себя мышей, которые содержат эктопическую последовательность нуклеиновой кислоты, которая восстанавливает фертильность у самца мыши.

Описаны генетически модифицированные мыши, клетки, эмбрионы и ткани, которые содержат последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую функциональный локус ADAM6, причем мыши, клетки, эмбрионы и ткани экспрессируют тяжелую цепь иммуноглобулина, происходящую из единственного генного сегмента VH человека. Кроме того, мыши, клетки, эмбрионы и ткани не содержат функциональный эндогенный ген ADAM6, но сохраняют функцию ADAM6, характеризующуюся присутствием эктопической последовательности нуклеиновой кислоты, которая кодирует белок ADAM6. Предусмотрены способы получения последовательностей антитела у фертильных не относящихся к человеку животных, которые применимы для связывания патогенов, включая в себя патогены человека.

Предшествующий уровень техники настоящего изобретения

Не относящиеся к человеку животные, например мыши, были генетически модифицированы, чтобы быть применимыми инструментами в способах получения последовательностей антител для использования в терапевтических средствах для людей на основе антител. В настоящей области техники известны мыши, которые производят полностью человеческие антитела с когнатными тяжелыми и легкими цепями. Для создания таких мышей, было необходимо инактивировать эндогенные гены иммуноглобулина мыши так, чтобы случайным образом интегрированные полностью человеческие трансгены могли бы функционировать в качестве экспрессированного репертуара иммуноглобулинов в организме мыши. Такие мыши могут производить антитела человека, подходящие для применения в качестве терапевтических средств для людей, но эти мыши демонстрируют существенные проблемы в отношении своих иммунных систем. Эти проблемы приводят к некоторым экспериментальным препятствиям, например, мыши становятся неспособными производить в достаточной степени разнообразные репертуары антител, требуют применения решений для широкомасштабного реконструирования, обеспечивают субоптимальный процесс клональной селекции, вероятно, вследствие несовместимости между элементами человека и мыши, и представляют собой ненадежный источник больших и разнообразных популяций вариабельных последовательностей человека, которые должны были быть действительно применимыми для получения терапевтических средств для людей.

Терапевтические средства для людей на основе антител разрабатывают на основе требуемых характеристик в отношении выбранных антигенов. Гуманизированных мышей иммунизируют выбранными антигенам и иммунизированных мышей используют для получения популяций антител, из которых идентифицируют высокоаффинные когнатные тяжелые и легкие вариабельные домены с требуемыми характеристиками связывания. Некоторые гуманизированные мыши, такие как мыши, у которых гуманизированы только вариабельные области в эндогенных локусах мыши, производят популяции В-клеток, которые схожи по характеру и количеству с популяциями В-клеток мыши дикого типа. В результате этого чрезвычайно большая и разнородная популяция В-клеток доступна у тех мышей, у которых антитела подвергаются скринингу, что отражает большое количество различных реаранжировок иммуноглобулина для идентификации тяжелых и легких вариабельных доменов с наиболее необходимыми характеристиками.

Тем не менее, не все антигены вызывают иммунный ответ, который проявляет очень большое количество реаранжировок из широкого выбора вариабельных сегментов (V). Другими словами, гуморальный иммунный ответ человека на определенные антигены практически ограничен. Ограничение отражается в клональной селекции В-клеток, которые экспрессируют только определенные сегменты V, связывающие определенный антиген с достаточно высокой аффинностью и специфичностью. Некоторые такие антигены являются клинически значимыми, т.е. некоторые из них представляют собой хорошо известные патогены человека. Возникает предположение, что сегмент V, экспрессированный при иммунном ответе человека, представляет собой сегмент V, который в сочетании с сегментом D и J человека более вероятно производит применимое высокоаффинное антитело, чем случайно выбранный сегмент V, который не наблюдался в ответе антитела человека на указанный антиген.

Предполагают, что естественный отбор за тысячелетия истории взаимодействия между людьми и патогенами выбрал наиболее эффективный фундамент или основание для разработки наиболее эффективного оружия для нейтрализации патогена -выбранный генный сегмент V. В настоящей области техники существует потребность в высококачественных антителах, которые связывают и/или нейтрализуют антигены, подобные обсуждаемым выше патогенам. Существует потребность в более быстром создании применимых последовательностей из выбранных генных сегментов V, включая в себя полиморфные и/или соматически мутированные выбранные генные сегменты V, и в более быстром получении применимых популяций В-клеток с реаранжировками генных сегментов V с различными генными сегментами D и J, включая в себя их соматически мутированные варианты, и, в частности, с реаранжировками с уникальными и применимыми областями CDR3. Существует потребность в улучшенных биологических системах, например, не относящихся к человеку животных (таких как, например, мыши, крысы, кролики и т.д.), которые могут создавать терапевтически применимые последовательности вариабельной области антитела из выбранных генных сегментов V в повышенном количестве и с увеличенным разнообразием, что, например, может быть достигнуто у существующих модифицированных животных, при одновременном снижении или устранении неблагоприятных изменений, которые могут быть результатом генетических модификаций. Существует потребность в улучшенных биологических системах, сконструированных так, чтобы они характеризовались коммитированной гуморальной иммунной системой для клональной селекции вариабельных последовательностей антитела, происходящих из ограниченных, выбранных генных сегментов V, включая в себя без ограничения когнатные вариабельные домены тяжелой и легкой цепей человека, применимые для получения терапевтических средств для людей на основе антител против выбранных антигенов, включая в себя определенные патогены человека. В настоящей области техники остается потребность в получении улучшенных генетически модифицированных мышей, которые применимы в создании последовательностей иммуноглобулина, включая в себя последовательности антител человека, направленных на устранения патогенов, которые обременяют человеческую популяцию.

В настоящей области техники существует потребность в терапевтических антителах, которые способны нейтрализовать вирусные антигены, например, ВИЧ и ВГС, включая в себя антигенспецифические антитела, содержащие тяжелые цепи, происходящие из единственного вариабельного генного сегмента человека. Также существует потребность в дополнительных способах и не относящихся к человеку животных для получения применимых антител, включая в себя антитела, которые содержат репертуар тяжелых цепей, происходящих из единственного сегмента VH человека, и содержащих разнообразный набор последовательностей CDR, включая в себя тяжелые цепи, которые экспрессируются с когнатными легкими цепями человека, и включая в себя исправление неблагоприятных эффектов вследствие вставки геномных последовательностей человека в геном не относящихся к человеку животных. Требуются способы для отбора CDR для связывающих белков на основе иммуноглобулинов, которые предусматривают повышенное разнообразие связывающих белков, из которых производят выбор, и повышенное разнообразие вариабельных доменов иммуноглобулинов, включая композиции и способы для создания соматически мутированных и подвергнутых клональной селекции вариабельных доменов иммуноглобулинов, для использования, например, в получении терапевтических средств для людей.

Краткое раскрытие настоящего изобретения

Предусмотрены генетически модифицированные локусы иммуноглобулина, которые содержат некоторое ограниченное количество различных генных сегментов вариабельной области тяжелой цепи (т.е. генов V, генов VH, генных сегментов VH или генных сегментов V), например, не более одного, двух или трех различных генов V; или не более одного представителя семейства генных сегментов V, присутствующего, например, в единственной копии или во множественных копиях и/или содержащего один или несколько полиморфизмов, и согласно различным вариантам осуществления локусы не содержат последовательность, которая кодирует эндогенный функциональный белок ADAM6.

Предусмотрены локусы, которые способны к реаранжировке и образованию гена, кодирующего вариабельный домен тяжелой цепи, который происходит из генного репертуара V тяжелой цепи, который является ограниченным, например, который представляет собой единственный генный сегмент VH или выбран из множества полиморфных вариантов единственного генного сегмента VH, причем согласно различным вариантам осуществления локусы не содержат эндогенный функциональный ген ADAM6 или его функциональный фрагмент.

Предусмотрены модифицированные локусы иммуноглобулина, включая в себя локусы, которые не содержат эндогенный функциональный ген ADAM6 и содержат последовательности иммуноглобулина человека, например, сегмент V человека, функционально связанный с относящейся к человеку или (или относящейся к человеку/не относящейся к человеку химерной) не относящейся к человеку константной последовательностью иммуноглобулина (и в функциональной связи, например, с сегментом D и/или J). Предусмотрены модифицированные локусы, которые содержат множественные копии единственного генного сегмента VH, причем одна или несколько копий содержат полиморфный вариант, и эктопическую нуклеотидную последовательность, которая кодирует белок ADAM6 или его фрагмент, который является функциональным у не относящегося к человеку животного. Предусмотрены модифицированные локусы, которые содержат множественные копии единственного сегмента VH, функционально связанного с одним или несколькими сегментами D и одним или несколькими сегментами J, функционально связанными с не относящейся к человеку константной последовательностью иммуноглобулина, например, последовательностью мыши или крысы или человека. Также предусмотрены не относящиеся к человеку животные, содержащие такие гуманизированные локусы, причем не относящиеся к человеку животные характеризуются фертильностью дикого типа.

Предусмотрены не относящиеся к человеку животные, которые содержат вариабельный локус тяжелой цепи иммуноглобулина (например, на трансгене или в качестве вставки или замещения на эндогенном вариабельном локусе тяжелой цепи не относящегося к человеку животного), который содержит единственный сегмент VH, функционально связанный с генным сегментом D и/или J. Согласно различным вариантам осуществления единственный генный сегмент VH функционально связан с одним или несколькими генными сегментами D и/или одним или несколькими генными сегментами J на эндогенном вариабельном генном локусе тяжелой цепи иммуноглобулина не относящегося к человеку животного. Согласно различным вариантам осуществления не относящиеся к человеку животные дополнительно содержат эктопическую нуклеотидную последовательность, которая кодирует белок ADAM6 или его гомолог или ортолог, который является функциональным у самца не относящегося к человеку животного, который содержит модифицированный локус тяжелой цепи. Согласно различным вариантам осуществления эктопическая нуклеотидная последовательность является смежной с единственным сегментом VH, генным сегментом D или генным сегментом J. Согласно различным вариантам осуществления эктопическая нуклеотидная последовательность является смежной с не относящейся к иммуноглобулину последовательностью в геноме не относящегося к человеку животного. Согласно одному варианту осуществления эктопическая нуклеотидная последовательность находится на той же хромосоме, что и модифицированный локус тяжелой цепи. Согласно одному варианту осуществления эктопическая нуклеотидная последовательность на другой хромосоме, чем модифицированный локус тяжелой цепи.

Предусмотрены не относящиеся к человеку животные, которые модифицированы на их локусах вариабельной области тяжелой цепи иммуноглобулина для делеции всех или по существу всех (например, всех функциональных сегментов или почти всех функциональных сегментов) эндогенных сегментов VH иммуноглобулина и которые содержат сегмент VH1-69 человека (или сегмент VH1-2 человека), функционально связанный с сегментом D и J или сегментом J на эндогенном локусе вариабельной области тяжелой цепи иммуноглобулина не относящегося к человеку животного. Также предусмотрены не относящиеся к человеку животные, содержащие такие локусы и которые не содержат эндогенный(е) ген(ы) ADAM6.

Предусмотрены способы получения последовательностей иммуноглобулина человека у не относящихся к человеку животных. Согласно различным вариантам осуществления последовательности иммуноглобулина человека происходят из репертуара последовательностей V иммуноглобулина, которые состоят по сути из единственного сегмента V человека, например, VH1-69 или VH1-2, и одного или нескольких сегментов D и J или одного или нескольких сегментов J. Предусмотрены способы получения последовательности иммуноглобулина человека в относящихся к человеку животных, тканях и клетках, причем последовательности иммуноглобулина человека связывают антиген.

Согласно одному аспекту предусмотрены конструкты нуклеиновых кислот, клетки, зародыши, мыши и способы для получения мышей, которые содержат модификацию, которая дает в результате нефункциональный эндогенный белок ADAM6 или ген ADAM6 мыши (например, нокаут или делецию в эндогенном гене ADAM6), причем мыши содержат последовательность нуклеиновой кислоты, которая кодирует белок ADAM6 или его ортолог или гомолог или фрагмент, который является функциональным у самца мыши. Согласно одному варианту осуществления мыши содержат эктопическую нуклеотидную последовательность, кодирующую белок ADAM6 грызуна или его ортолог или гомолог или функциональный фрагмент; согласно конкретному варианту осуществления белок ADAM6 грызуна представляет собой белок ADAM6 мыши.

Согласно одному аспекту предусмотрены конструкты нуклеиновой кислоты, клетки, зародыши, мыши и способы получения мышей, которые содержат модификацию эндогенного локуса иммуноглобулина мыши, причем мыши содержат белок ADAM6 или его ортолог или гомолог или фрагмент, который является функциональным у самца мыши. Согласно одному варианту осуществления эндогенный локус иммуноглобулина мыши представляет собой локус тяжелой цепи иммуноглобулина, и модификация снижает или устраняет активность ADAM6 клетки или ткани самца мыши. Согласно одному варианту осуществления эндогенный локус иммуноглобулина мыши представляет собой локус тяжелой цепи иммуноглобулина, и модификация поддерживает или обеспечивает активность ADAM6 клетки или ткани самца мыши.

Согласно одному аспекту предусмотрен модифицированный локус тяжелой цепи иммуноглобулина, который содержит репертуар сегментов V тяжелой цепи, который ограничен в отношении идентичности сегмента V, и который содержит один или несколько сегментов D и один или несколько сегментов J, или один или несколько сегментов J. Согласно одному варианту осуществления сегмент V тяжелой цепи представляет собой сегмент человека. Согласно одному варианту осуществления модифицированный локус тяжелой цепи иммуноглобулина не содержит эндогенный ген ADAM6. Согласно одному варианту осуществления модифицированный локус тяжелой цепи дополнительно содержит нуклеотидную последовательность, которая кодирует белок ADAM6. Согласно конкретному варианту осуществления нуклеотидная последовательность является смежной с генным сегментом V, D и/или J на модифицированном локусе тяжелой цепи иммуноглобулина.

Согласно одному варианту осуществления модифицированный локус представляет собой не относящийся к человеку локус. Согласно одному варианту осуществления не относящийся к человеку локус модифицирован с помощью по меньшей мере одной последовательности иммуноглобулина человека. Согласно одному варианту осуществления не относящийся к человеку локус модифицирован с помощью по меньшей мере одной последовательности иммуноглобулина человека и последовательности, которая кодирует белок ADAM6.

Согласно одному варианту осуществления ограничение касается одного представителя семейства сегментов V. Согласно одному варианту осуществления один представитель семейства сегментов V присутствует в двух или более копиях. Согласно одному варианту осуществления один представитель семейства сегментов V присутствует в виде двух или более вариантов (например, в двух или более полиморфных формах представителя семейства сегментов V). Согласно одному варианту осуществления один сегмент V представляет собой представителя семейства сегментов V человека. Согласно одному варианту осуществления один представитель семейства сегментов V присутствует в нескольких вариантах, как это наблюдается в человеческой популяции, по отношению к этому варианту. Согласно одному варианту осуществления представителя семейства сегментов V выбирают из таблицы 1. Согласно одному варианту осуществления представитель семейства сегментов V присутствует в нескольких вариантах, как показано для каждого сегмента V, в нескольких аллелях от одного аллеля до нескольких аллелей, показанных в правой колонке таблицы 1.

Согласно одному аспекту предусмотрены мыши, которые содержат эктопическую нуклеотидную последовательность, кодирующую ADAM6 мыши или его ортолог или гомолог или функциональный фрагмент; также предусмотрены мыши, которые содержат эндогенную нуклеотидную последовательность, кодирующую ADAM6 мыши или его ортолог или гомолог или фрагмент, и по меньшей мере одну генетическую модификацию локуса тяжелой цепи иммуноглобулина. Согласно одному варианту осуществления эндогенная нуклеотидная последовательность, кодирующая ADAM6 мыши или его ортолог или гомолог или фрагмент, расположена в эктопическом положении по сравнению с эндогенным геном ADAM6 мыши дикого типа.

Согласно одному аспекту предусмотрены способы получения мышей, которые содержат модификацию эндогенного локуса иммуноглобулина мыши, причем мыши содержат белок ADAM6 или его ортолог или гомолог или фрагмент, который является функциональным у самца мыши.

Согласно одному аспекту предусмотрены способы получения мышей, которые содержат генетическую модификацию локуса тяжелой цепи иммуноглобулина, причем применение способов дает в результате самцов мышей, которые содержат модифицированный локус тяжелой цепи иммуноглобулина (или его делецию), и самцы мышей способны производить потомство путем спаривания. Согласно одному варианту осуществления самцы мышей способны производить сперму, которая может проходить от матки мыши через яйцевод мыши для оплодотворения яйцеклетки мыши.

Согласно одному аспекту предусмотрены способы получения мышей, которые содержат генетическую модификацию локуса тяжелой цепи иммуноглобулина, причем применение способов дает в результате самцов мышей, которые содержат модифицированный локус тяжелой цепи иммуноглобулина (или его делецию), и самцы мышей проявляют снижение фертильности, и мыши содержат генетическую модификацию, которая полностью или частично восстанавливает снижение фертильности. Согласно различным вариантам осуществления снижение фертильности характеризуется неспособностью спермы самцов мышей мигрировать от матки мыши через яйцевод мыши для оплодотворения яйцеклетки мыши. Согласно различным вариантам осуществления снижение фертильности характеризуется наличием спермы, которая проявляет in vivo нарушение миграции. Согласно различным вариантам осуществления генетическая модификация, которая полностью или частично восстанавливает снижение фертильности, представляет собой последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую ген ADAM6 мыши или его ортолог или гомолог или фрагмент, который является функциональным у самца мыши.

Согласно одному варианту осуществления генетическая модификация предусматривает замещение эндогенных вариабельных локусов тяжелой цепи иммуноглобулина ограниченным числом, например, не более чем одним, двумя или тремя различными вариабельными генными сегментами тяжелой цепи (VH), одним или несколькими дополнительными генными сегментами тяжелой цепи (DH) и одним или несколькими соединительными генными сегментами тяжелой цепи (JH) другого вида (например, не относящегося к мыши вида). Согласно одному варианту осуществления генетическая модификация предусматривает вставку единственного ортологичного генного сегмента иммуноглобулина VH, по меньшей мере одного генного сегмента DH и по меньшей мере одного генного сегмента JH в эндогенные вариабельные локусы тяжелой цепи иммуноглобулина. Согласно конкретному варианту осуществления вид представляет собой человека. Согласно одному варианту осуществления генетическая модификация предусматривает делецию эндогенного вариабельного локуса тяжелой цепи иммуноглобулина полностью или частично, причем делеция приводит к потере эндогенной функции ADAM6. Согласно конкретному варианту осуществления потеря эндогенной функции ADAM6 ассоциирована со снижением фертильности у самцов мышей. Согласно одному варианту осуществления генетическая модификация предусматривает инактивацию эндогенного вариабельного локуса тяжелой цепи иммуноглобулина полностью или частично, причем инактивация не приводит к потере эндогенной функции ADAM6. Инактивация может включать в себя замещение или делецию одного или нескольких эндогенных генных сегментов, которые дают в результате эндогенный локус тяжелой цепи иммуноглобулина, который по существу является неспособным к реаранжировке для кодирования тяжелой цепи антитела, которое содержит эндогенные генные сегменты. Инактивация может включать в себя другие модификации, которые делают эндогенный локус тяжелой цепи иммуноглобулина неспособным к реаранжировке для кодирования тяжелой цепи антитела, причем модификация не включает в себя замещение или делецию эндогенных генных сегментов. Иллюстративные модификации включают в себя хромосомные вставки и/или транслокации, опосредованные молекулярными техниками, например, с использованием точного размещения сайтов сайт-специфической рекомбинации (например, технологии Cre-lox).

Согласно одному варианту осуществления генетическая модификация предусматривает вставку в геном мыши фрагмента ДНК, содержащего ограниченное число, например, не более чем один, два или три различных вариабельных генных сегмента тяжелой цепи (VH), один или несколько дополнительных генных сегментов тяжелой цепи (DH) и один или несколько соединительных генных сегментов тяжелой цепи (JH) другого вида (например, не относящегося к мыши вида), функционально связанных с одной или несколькими последовательностями константной области (например, геном IgM и/или IgG). Согласно одному варианту осуществления фрагмент ДНК способен подвергаться реаранжировке для образования последовательности, которая кодирует тяжелую цепь антитела. Согласно одному варианту осуществления генетическая модификация предусматривает вставку единственного ортологичного генного сегмента иммуноглобулина VH, по меньшей мере одного генного сегмента DH и по меньшей мере одного генного сегмента JH в геном мыши. Согласно конкретному варианту осуществления вид представляет собой человека. Согласно одному варианту осуществления генетическая модификация предусматривает делецию эндогенного вариабельного локуса тяжелой цепи иммуноглобулина полностью или частично, чтобы сделать эндогенный локус тяжелой цепи иммуноглобулина нефункциональным, причем делеция дополнительно приводит к потере эндогенной функции ADAM6. Согласно конкретному варианту осуществления потеря эндогенной функции ADAM6 ассоциирована со снижением фертильности у самцов мышей.

Согласно одному аспекту предусмотрены мыши, которые содержат модификацию, которая снижает или устраняет экспрессию ADAM6 мыши из эндогенного аллеля ADAM6 так, что самец мыши с модификацией проявляет сниженную фертильность (например, сильно сниженную способность производить потомство путем спаривания), или является по существу стерильным вследствие снижения или устранения эндогенной функции ADAM6, причем мыши дополнительно содержат эктопическую последовательность ADAM6 или ее гомолог или ортолог или функциональный фрагмент. Согласно одному аспекту модификация, которая снижает или устраняет экспрессию ADAM6 мыши, представляет собой модификацию (например, вставку, делецию, замещение и т.д.) в локусе иммуноглобулина мыши. Согласно одному варианту осуществления локус иммуноглобулина представляет собой локус тяжелой цепи иммуноглобулина.

Согласно одному варианту осуществления снижение или потеря функции ADAM6 предусматривает неспособность или существенную неспособность мыши производить сперму, которая может проходить от матки мыши через яйцевод мыши для оплодотворения яйцеклетки мыши. Согласно конкретному варианту осуществления по меньшей мере приблизительно 95%, 96%, 97%, 98% или 99% сперматозоидов, произведенных в объеме эякулята мыши, являются неспособными пройти через яйцевод in vivo после копуляции и оплодотворить яйцеклетку мыши.

Согласно одному варианту осуществления снижение или потеря функции ADAM6 предусматривает неспособность образования или существенную неспособность образования комплекса ADAM2 и/или ADAM3 и/или ADAM6 на поверхности сперматозоида мыши. Согласно одному варианту осуществления потеря функции ADAM6 предусматривает существенную неспособность оплодотворить яйцеклетку мыши путем копуляции с самкой мыши.

Согласно одному аспекту предусмотрена мышь, которая не содержит функциональный эндогенный ген ADAM6, и содержит белок (или эктопическую нуклеотидную последовательность, которая кодирует белок), который предоставляет мыши функциональность ADAM6. Согласно одному варианту осуществления мышь представляет собой самца мыши, и функциональность предусматривает усиленную фертильность по сравнению с мышью, которая не содержит функциональный эндогенный ген ADAM6.

Согласно одному варианту осуществления белок кодируется геномной последовательностью, расположенной в пределах локуса иммуноглобулина в зародышевой линии мыши. Согласно конкретному варианту осуществления локус иммуноглобулина представляет собой локус тяжелой цепи. Согласно другому конкретному варианту осуществления локус тяжелой цепи содержит единственный генный сегмент VH человека, по меньшей мере один генный сегмент DH человека и по меньшей мере один генный сегмент JH человека. Согласно другому конкретному варианту осуществления локус тяжелой цепи содержит один генный сегмент VH человека, 27 генных сегментов DH человека и шесть генных сегментов JH человека. Согласно одному варианту осуществления эктопический белок кодируется геномной последовательностью, расположенной в пределах не относящегося к иммуноглобулину локуса в зародышевой линии мыши. Согласно одному варианту осуществления не относящийся к иммуноглобулину локус представляет собой транскрипционно активный локус. Согласно конкретному варианту осуществления транскрипционно активный локус представляет собой локус ROSA26. Согласно конкретному варианту осуществления транскрипционно активный локус ассоциирован с тканеспецифической экспрессией. Согласно одному варианту осуществления тканеспецифическая экспрессия присутствует в репродуктивных тканях. Согласно одному варианту осуществления белок кодируется геномной последовательностью, случайным образом вставленной в зародышевую линию мыши.

Согласно одному варианту осуществления мышь содержит относящуюся к человеку или химерную относящуюся к человеку/мыши или химерную относящуюся к человеку/крысе (например, относящуюся к человеку вариабельную, относящуюся к мыши или крысе константную) легкую цепь и химерную относящуюся к человеку вариабельную/относящуюся к мыши или крысе константную тяжелую цепь. Согласно конкретному варианту осуществления мышь содержит трансген, который содержит химерный ген относящейся к человеку вариабельной/относящейся к крысе или мыши константной легкой цепи, функционально связанный с транскрипционно активным промотором, например, промотором ROSA26. Согласно дополнительному конкретному варианту осуществления химерный трансген относящейся к человеку/мыши или крысы легкой цепи содержит реаранжированную последовательность вариабельной области легкой цепи человека в зародышевой линии мыши.

Согласно одному варианту осуществления эктопическая нуклеотидная последовательность расположена в пределах локуса иммуноглобулина в зародышевой линии мыши. Согласно конкретному варианту осуществления локус иммуноглобулина представляет собой локус тяжелой цепи. Согласно одному варианту осуществления локус тяжелой цепи содержит единственный генный сегмент VH человека, по меньшей мере один генный сегмент DH человека и по меньшей мере один генный сегмент JH человека. Согласно конкретному варианту осуществления локус тяжелой цепи содержит единственный генный сегмент VH человека, 27 генных сегментов DH человека и шесть генных сегментов JH человека. Согласно одному варианту осуществления эктопическая нуклеотидная последовательность расположена в пределах не относящегося к иммуноглобулину локуса в зародышевой линии мыши. Согласно одному варианту осуществления не относящийся к иммуноглобулину локус представляет собой транскрипционно активный локус. Согласно конкретному варианту осуществления транскрипционно активный локус представляет собой локус ROSA26. Согласно одному варианту осуществления эктопическая нуклеотидная последовательность размещена в виде вставленной случайным образом в зародышевую линию мыши.

Согласно одному аспекту предусмотрена мышь, которая не содержит функциональный эндогенный ген ADAM6, причем мышь содержит эктопическую нуклеотидную последовательность, которая восполняет потерю функции ADAM6 мыши. Согласно одному варианту осуществления эктопическая нуклеотидная последовательность предоставляет мыши способность производить потомство, которое является сопоставимым с таковым у соответствующей мыши дикого типа, которая содержит функциональный эндогенный ген ADAM6. Согласно одному варианту осуществления последовательность предоставляет мыши способность образовывать комплекс ADAM2 и/или ADAM3 и/или ADAM6 на поверхности сперматозоида мыши. Согласно одному варианту осуществления последовательность предоставляет сперматозоиду мыши способность проходить от матки мыши через яйцевод мыши к яйцеклетке мыши для оплодотворения яйцеклетки.

Согласно одному варианту осуществления мышь, не содержащая функциональный эндогенный ген ADAM6 и содержащая эктопическую нуклеотидную последовательность, производит по меньшей мере приблизительно 50%, 60%, 70%, 80% или 90% от числа пометов, которые производит мышь дикого типа мышь того же возраста и линии за шестимесячный период времени.

Согласно одному варианту осуществления мышь, не содержащая функциональный эндогенный ген ADAM6 и содержащая эктопическую нуклеотидную последовательность, производит больше по меньшей мере приблизительно в 1,5 раза, приблизительно в 2 раза, приблизительно в 2,5 раза, приблизительно в 3 раза, приблизительно в 4 раза, приблизительно в 6 раз, приблизительно в 7 раз, приблизительно в 8 раз или приблизительно в 10 раз или более потомства при разведении в течение шестимесячного периода времени, чем мышь такого же возраста и такой же или аналогичной линии, которая не содержит функциональный эндогенный ген ADAM6 и которая не содержит эктопическую нуклеотидную последовательность, которую разводят в течение по существу такого же периода времени и по существу при таких же условиях.

Согласно одному варианту осуществления мышь, не содержащая функциональный эндогенный ген ADAM6 и содержащая эктопическую нуклеотидную последовательность, производит в среднем по меньшей мере приблизительно в 2 раза, в 3 раза или в 4 раза большее число детенышей на помет за 4- или 6-месячный период разведения, чем мышь, которые не содержит функциональный эндогенный ген ADAM6 и которая не содержит эктопическую нуклеотидную последовательность, и которую разводят в течение такого же периода времени.

Согласно одному варианту осуществления мышь, не содержащая функциональный эндогенный ген ADAM6 и содержащая эктопическую нуклеотидную последовательность, представляет собой самца мыши, и самец мыши производит сперму, которая будучи извлеченной из яйцеводов приблизительно через 5-6 часов после копуляции, отражает миграцию в яйцеводе, которая больше по меньшей мере в 10 раз, по меньшей мере в 20 раз, по меньшей мере в 30 раз, по меньшей мере в 40 раз, по меньшей мере в 50 раз, по меньшей мере в 60 раз, по меньшей мере в 70 раз, по меньшей мере в 80 раз, по меньшей мере в 90 раз, в 100 раз, в 110 раз или в 120 раз или выше, чем у мыши, которая не содержит функциональный эндогенный ген ADAM6 и которая не содержит эктопическую нуклеотидную последовательность.

Согласно одному варианту осуществления мышь, не содержащая функциональный эндогенный ген ADAM6 и содержащая эктопическую нуклеотидную последовательность, при копуляции с самкой мыши образует сперму, которая способна к прохождению матки и попаданию и прохождению яйцевода в течение приблизительно 6 часов при результативности, которая приблизительно равна сперме мыши дикого типа.

Согласно одному варианту осуществления мышь, не содержащая функциональный эндогенный ген ADAM6 и содержащая эктопическую нуклеотидную последовательность, производит больше приблизительно в 1,5 раза, приблизительно в 2 раза, приблизительно в 3 раза или приблизительно в 4 раза или более пометов в сопоставимый период времени, чем мышь, которая не содержит функциональный ген ADAM6 и которая не содержит эктопическую нуклеотидную последовательность.

Согласно одному аспекту предусмотрена мышь, содержащая в своей зародышевой линии не относящуюся к мыши последовательность нуклеиновой кислоты, которая кодирует белок иммуноглобулина, причем не относящаяся к мыши последовательность иммуноглобулина содержит вставку гена ADAM6 мыши или его гомолога или ортолога или функционального фрагмента. Согласно одному варианту осуществления не относящаяся к мыши последовательность иммуноглобулина содержит последовательность иммуноглобулина человека. Согласно одному варианту осуществления последовательность содержит последовательность тяжелой цепи иммуноглобулина человека. Согласно одному варианту осуществления последовательность содержит последовательность легкой цепи иммуноглобулина человека. Согласно одному варианту осуществления последовательность содержит единственный генный сегмент VH, один или несколько генных сегментов DH и один или несколько генных сегментов JH; согласно одному варианту осуществления последовательность содержит один или несколько генных сегментов VL и один или несколько генных сегментов JL. Согласно одному варианту осуществления единственный генный сегмент VH, один или несколько генных сегментов DH и один или несколько генных сегментов JH, или один или несколько генных сегментов VL и JL не реаранжированы. Согласно одному варианту осуществления единственный генный сегмент VH, один или несколько генных сегментов DH и один или несколько генных сегментов JH или один или несколько генных сегментов VL и JL являются реаранжированными. Согласно одному варианту осуществления после реаранжировки единственного генного сегмента VH, одного или нескольких генных сегментов DH и одного или нескольких генных сегментов JH или одного или нескольких генных сегментов VL и JL, мышь содержит в своем геноме по меньшей мере одну последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую ген ADAM6 мыши или его гомолог или ортолог или функциональный фрагмент. Согласно одному варианту осуществления после реаранжировки мышь содержит в своем геноме по меньшей мере две последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующие ген ADAM6 мыши или его гомолог или ортолог или функциональный фрагмент. Согласно одному варианту осуществления после реаранжировки мышь содержит в своем геноме по меньшей мере одну последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую ген ADAM6 мыши или его гомолог или ортолог или функциональный фрагмент. Согласно одному варианту осуществления мышь содержит ген ADAM6 или его гомолог или ортолог или функциональный фрагмент в В-клетке. Согласно одному варианту осуществления мышь содержит ген ADAM6 или его гомолог или ортолог или функциональный фрагмент в клетке, не относящейся к В-клетке.

Согласно одному аспекту предусмотрены мыши, которые экспрессируют вариабельную область тяжелой цепи иммуноглобулина человека или ее функциональный фрагмент из эндогенного локуса тяжелой цепи иммуноглобулина мыши, причем мыши содержат активность ADAM6, которая является функциональной у самца мыши. Согласно одному варианту осуществления вариабельная область тяжелой цепи иммуноглобулина человека содержит полиморфный генный сегмент VH человека. Согласно одному варианту осуществления вариабельная область тяжелой цепи иммуноглобулина человека содержит генный сегмент VH1-69 человека. Согласно одному варианту осуществления вариабельная область тяжелой цепи иммуноглобулина человека содержит генный сегмент VH1-2 человека.

Согласно одному варианту осуществления самцы мышей содержат один немодифицированный эндогенный аллель ADAM6 или его ортолог или гомолог или функциональный фрагмент на эндогенном локусе ADAM6.

Согласно одному варианту осуществления самцы мышей содержат эктопическую последовательность ADAM6 мыши или ее гомолог или ортолог или функциональный фрагмент, который кодирует белок, которые предоставляет функцию ADAM6.

Согласно одному варианту осуществления самцы мышей содержат последовательность ADAM6 или ее гомолог или ортолог или функциональный фрагмент в положении в геноме мыши, которое приблизительно соответствует положению эндогенного аллеля ADAM6 мыши, например, 3' по отношению к последовательности генного сегмента V и 5' по отношению к первому генному сегменту D. Согласно конкретному варианту осуществления самцы мышей содержат последовательность ADAM6 или ее гомолог или ортолог или функциональный фрагмент 3' относительно генного сегмента VH человека и 5' относительно генного сегмента DH человека. Согласно другому конкретному варианту осуществления самцы мышей содержат последовательность ADAM6 или ее гомолог или ортолог или функциональный фрагмент 5' относительно генного сегмента VH человека. Согласно другому конкретному варианту осуществления самцы мышей содержат последовательность ADAM6 или ее гомолог или ортолог или функциональный фрагмент 5' относительно химерного локуса тяжелой цепи, содержащего единственный генный сегмент VH человека, один или несколько генных сегментов DH человека и один или несколько генных сегментов JH человека. Согласно одному варианту осуществления химерный локус тяжелой цепи содержит генный сегмент VH1-69 человека, 27 генных сегментов DH человека и шесть генных сегментов JH человека. Согласно одному варианту осуществления химерный локус тяжелой цепи содержит генный сегмент VH1-2 человека, 27 генных сегментов DH человека и шесть генных сегментов JH человека.

Согласно одному варианту осуществления самцы мышей содержат последовательность ADAM6 или ее гомолог или ортолог или функциональный фрагмент, фланкированный выше, ниже или выше и ниже (относительно направления транскрипции последовательности ADAM6) последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей вариабельный генный сегмент иммуноглобулина или дополнительный генный сегмент иммуноглобулина. Согласно конкретному варианту осуществления вариабельный генный сегмент иммуноглобулина представляет собой генный сегмент человека. Согласно одному варианту осуществления вариабельный генный сегмент иммуноглобулина представляет собой генный сегмент человека, и последовательность, кодирующая ADAM6 мыши или его ортолог или гомолог или фрагмент, функциональный у мыши, находится между генными сегментами VH человека; согласно одному варианту осуществления мышь содержит один генный сегмент VH человека, и последовательность находится в положении 5' относительно генного сегмента VH; согласно одному варианту осуществления последовательность находится в положении 3' относительно генного сегмента VH; согласно одному варианту осуществления последовательность находится в положении между генным сегментом VH и первым генным сегментом DH. Согласно конкретному варианту осуществления генный сегмент DH представляет собой первый генный сегмент DH. Согласно одному варианту осуществления мышь содержит два генных сегмента VH, и последовательность находится в положении между двумя генными сегментами VH; согласно одному варианту осуществления последовательность находится в положении между генным сегментом VH и генным сегментом DH. Согласно конкретному варианту осуществления генный сегмент DH представляет собой первый генный сегмент DH.

Согласно одному варианту осуществления самцы мышей содержат последовательность ADAM6 или ее гомолог или ортолог или функциональный фрагмент, который расположен в положении в эндогенном локусе иммуноглобулина, которое является таким же или по существу таким же, как и у самца мыши дикого типа. Согласно конкретному варианту осуществления эндогенный локус не способен кодировать тяжелую цепь антитела. Согласно конкретному варианту осуществления эндогенный локус расположен в положении в геноме самца мыши, которое делает его неспособным кодировать тяжелую цепь антитела. Согласно различным вариантам осуществления самцы мышей содержат последовательность ADAM6, расположенную на той же хромосоме, что и генные сегменты иммуноглобулина человека, и последовательность ADAM6 кодирует функциональный белок ADAM6.

Согласно одному аспекту предусмотрен самец мыши, который содержит нефункциональный эндогенный ген ADAM6 или делецию эндогенного гена ADAM6, в своей зародышевой линии; причем сперматозоиды мыши способны проходить яйцевод самки мыши и оплодотворять яйцеклетку. Согласно одному варианту осуществления мыши содержат внехромосомную копию гена ADAM6 мыши или его ортолога или гомолога или функционального фрагмента, который является функциональным у самца мышь. Согласно одному варианту осуществления мыши содержат эктопический ген ADAM6 мыши или его ортолог или гомолог или функциональный фрагмент, который является функциональным у самца мыши.

Согласно одному аспекту предусмотрены мыши, которые содержат генетическую модификацию, которая снижает эндогенную функцию ADAM6 мыши, причем мышь содержит по меньшей мере некоторую функциональность ADAM6, обеспеченную либо эндогенным немодифицированным аллелем, который является функциональным полностью или частично (например, гетерозигота), либо экспрессией из эктопической последовательности, которая кодирует ADAM6 или его ортолог или гомолог или функциональный фрагмент, который является функциональным у самца мыши.

Согласно одному варианту осуществления мыши содержат функцию ADAM6, достаточную для предоставления самцам мышей способности производить потомство путем спаривания, по сравнению с самцами мышей, у которых отсутствует функциональный ADAM6. Согласно одному варианту осуществления функция ADAM6 обеспечивается путем присутствия эктопической нуклеотидной последовательности, которая кодирует ADAM6 мыши или его гомолог или ортолог или функциональный фрагмент. Согласно одному варианту осуществления функция ADAM6 обеспечивается эндогенным геном ADAM6, присутствующим в эндогенном локусе иммуноглобулина, причем эндогенный локус иммуноглобулина является неспособным кодировать тяжелую цепь антитела. Гомологи или ортологи ADAM6 или его фрагменты, которые являются функциональными у самца мыши, включают в себя те, которые восстанавливают, полностью или частично, потерю способности производить потомство, наблюдаемую у самца мыши, у которого отсутствует достаточная эндогенная активность ADAM6 мыши, например, потерю способности, наблюдаемую у нокаутной в отношении ADAM6 мыши. В этом смысле нокаутные в отношении ADAM6 мыши включают в себя мышей, которые содержат эндогенный локус или его фрагмент, но который не является функциональным, т.е. который вообще не экспрессирует ADAM6 (ADAM6a и/или ADAM6b) или который экспрессирует ADAM6 (ADAM6a и/или ADAM6b) на уровне, недостаточном для поддержания по существу нормальной способности самца мыши дикого типа производить потомство. Потеря функции может быть обусловлена, например, модификацией в структурном гене локуса (т.е. в кодирующей области ADAM6a или ADAM6b) или в регуляторной области локуса (например, в последовательности 5' по отношению к гену ADAM6a или 3' по отношению к кодирующей области ADAM6a или ADAM6b, причем последовательность контролирует, полностью или частично, транскрипцию гена ADAM6, экспрессию РНК ADAM6 или экспрессию белка ADAM6). Согласно различным вариантам осуществления его ортологи или гомологи или фрагменты, которые являются функциональными у самца мыши, являются такими, которые позволяют сперме самца мыши (или большинству сперматозоидов в эякуляте самца мыши) проходить яйцевод мыши и оплодотворять яйцеклетку мыши.

Согласно одному варианту осуществления самцы мышей, которые экспрессируют вариабельную область иммуноглобулина человека или ее функциональный фрагмент, содержат достаточную активность ADAM6 для предоставления самцам мышей способности производить потомство путем спаривания с самками мышей, и согласно одному варианту осуществления самцы мышей проявляют способность производить потомство при спаривании с самками мышей, которое согласно одному варианту осуществления составляет по меньшей мере 25%, согласно одному варианту осуществления по меньшей мере 30%, согласно одному варианту осуществления по меньшей мере 40%, согласно одному варианту осуществления по меньшей мере 50%, согласно одному варианту осуществления по меньшей мере 60%, согласно одному варианту осуществления по меньшей мере 70%, согласно одному варианту осуществления по меньшей мере 80%, согласно одному варианту осуществления по меньшей мере 90% и согласно одному варианту осуществления является приблизительно одинаковым по сравнению с потомством мышей с одним или двумя эндогенными немодифицированными аллелями ADAM6.

Согласно одному варианту осуществления самцы мышей экспрессируют достаточный ADAM6 (или его ортолог или гомолог или функциональный фрагмент) для предоставления сперматозоиду от самцов мышей возможности проходить яйцевод самки мыши и оплодотворять яйцеклетку мыши.

Согласно одному варианту осуществления функциональность ADAM6 обеспечивается последовательностью нуклеиновой кислоты, которая является смежной с хромосомной последовательностью мыши (например, нуклеиновая кислота случайным образом интегрирована в хромосому мыши; или помещена в конкретное положение, например, путем нацеливания нуклеиновой кислоты в конкретное положение, например, с помощью опосредованной сайт-специфической рекомбиназой (например, Cre-опосредованной) вставки или гомологичной рекомбинации). Согласно одному варианту осуществления последовательность ADAM6 присутствует на нуклеиновой кислоте, которая расположена отдельно от хромосомы мыши (например, последовательность ADAM6 присутствует на эписоме, т.е. внехромосомно, например, в конструкте экспрессии, векторе, YAC, трансхромосоме и т.д.).

Согласно одному аспекту предусмотрены генетически модифицированные мыши и клетки, которые содержат модификацию эндогенного локуса тяжелой цепи иммуноглобулина, причем мыши экспрессируют по меньшей мере часть последовательности тяжелой цепи иммуноглобулина, например, по меньшей мере часть последовательности человека, причем мыши содержат активность ADAM6, которая является функциональной у самца мыши. Согласно одному варианту осуществления модификация снижает или устраняет активность ADAM6 мыши. Согласно одному варианту осуществления мышь модифицирована так, что оба аллеля, которые кодируют активность ADAM6, либо отсутствуют, либо экспрессируют ADAM6, который по существу не функционирует для поддержания нормального спаривания у самца мыши. Согласно одному варианту осуществления мышь дополнительно содержит эктопическую последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую ADAM6 мыши или его ортолог или гомолог или функциональный фрагмент. Согласно одному варианту осуществления модификация поддерживает активность ADAM6 мыши и делает эндогенный локус тяжелой цепи иммуноглобулина неспособным кодировать тяжелую цепь антитела.

Согласно одному аспекту предусмотрены генетически модифицированные мыши и клетки, которые содержат модификацию эндогенного локуса тяжелой цепи иммуноглобулина, причем модификация снижает или устраняет активность ADAM6, экспрессированную из последовательности ADAM6 локуса, и причем мыши содержат белок ADAM6 или его ортолог или гомолог или функциональный фрагмент. Согласно различным вариантам осуществления белок ADAM6 или его фрагмент кодируется эктопической последовательностью ADAM6. Согласно различным вариантам осуществления белок ADAM6 или его фрагмент экспрессируется из эндогенного аллеля ADAM6. Согласно различным вариантам осуществления мышь содержит первый аллель тяжелой цепи иммуноглобулина, который содержит первую модификацию, которая снижает или устраняет экспрессию функционального ADAM6 из первого аллеля тяжелой цепи иммуноглобулина, и мышь содержит второй аллель тяжелой цепи иммуноглобулина, который содержит вторую модификацию, которая по существу не снижает или не устраняет экспрессию функционального ADAM6 из второго аллеля тяжелой цепи иммуноглобулина.

Согласно одному варианту осуществления вторая модификация расположена 3' (по отношению к направлению транскрипции генного сегмента V мыши) последнего генного сегмента V мыши и расположена 5' (по отношению к направлению транскрипции константной последовательности) относящегося к мыши (или химерного относящегося к человеку/мыши) константного гена тяжелой цепи иммуноглобулина или его фрагмента (например, последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей относящийся к человеку и/или относящийся к мыши: CH1 и/или шарнир и/или CH2 и/или CH3).

Согласно одному варианту осуществления модификация находится на первом аллеле тяжелой цепи иммуноглобулина на первом локусе, который кодирует первый аллель ADAM6, и функция ADAM6 является результатом экспрессии эндогенного ADAM6 на втором аллеле тяжелой цепи иммуноглобулина на втором локусе, который кодирует функциональный ADAM6, причем второй аллель тяжелой цепи иммуноглобулина содержит по меньшей мере одну модификацию генного сегмента V, D и/или J. Согласно конкретному варианту осуществления по меньшей мере одна модификация генного сегмента V, D и/или J представляет собой делецию, замещение единственным генным сегментом VH человека, одним или несколькими генными сегментами DH и/или одним или несколькими генными сегментами JH, замещение генным сегментом VH (или VHH), DH и/или JH верблюда, замещение гуманизированным или камелизированным генным сегментом VH (или VHH), DH и/или JH, замещение последовательности тяжелой цепи последовательностью легкой цепи, и их комбинацию. Согласно одному варианту осуществления по меньшей мере одна модификация представляет собой делецию одного или нескольких VH, DH и/или JH генных сегментов и замещение одним или несколькими генными сегментами (VL и/или JL например, генным сегментом VL человека и/или генным сегментом JL человека) на локусе тяжелой цепи.

Согласно одному варианту осуществления модификация находится на первом аллеле тяжелой цепи иммуноглобулина на первом локусе и втором аллеле тяжелой цепи иммуноглобулина на втором локусе, и функция ADAM6 является результатом экспрессии эктопического ADAM6 на не относящемся к иммуноглобулину локусе в зародышевой линии мыши. Согласно конкретному варианту осуществления не относящийся к иммуноглобулину локус представляет собой локус ROSA26. Согласно конкретному варианту осуществления не относящийся к иммуноглобулину локус является транскрипционно активным в репродуктивной ткани.

Согласно одному варианту осуществления модификация находится на первом аллеле тяжелой цепи иммуноглобулина на первом локусе и втором аллеле тяжелой цепи иммуноглобулина на втором локусе, и функция ADAM6 является результатом экспрессии эктопического ADAM6 на первом аллеле тяжелой цепи иммуноглобулина. Согласно одному варианту осуществления модификация находится на первом аллеле тяжелой цепи иммуноглобулина на первом локусе и на втором аллеле тяжелой цепи иммуноглобулина на втором локусе, и функция ADAM6 является результатом экспрессии эктопического ADAM6 на втором аллеле тяжелой цепи иммуноглобулина.

Согласно одному аспекту предусмотрена мышь, содержащая гетерозиготный или гомозиготный нокаут ADAM6. Согласно одному варианту осуществления мышь дополнительно содержит модифицированную последовательность иммуноглобулина, которая представляет собой относящуюся к человеку или гуманизированную последовательность иммуноглобулина, или относящуюся к верблюду или камелизированную последовательность иммуноглобулина человека или мыши. Согласно одному варианту осуществления модифицированная последовательность иммуноглобулина присутствует на эндогенном локусе тяжелой цепи иммуноглобулина мыши. Согласно одному варианту осуществления модифицированная последовательность иммуноглобулина содержит последовательность вариабельного гена тяжелой цепи человека на эндогенном локусе тяжелой цепи иммуноглобулина мыши. Согласно одному варианту осуществления последовательность вариабельного гена тяжелой цепи человека замещает эндогенную последовательность вариабельного гена тяжелой цепи мыши на эндогенном локусе тяжелой цепи иммуноглобулина мыши.

Согласно одному аспекту предусмотрена мышь, неспособная к экспрессии функционального эндогенного ADAM6 мыши из эндогенного локуса ADAM6 мыши. Согласно одному варианту осуществления мышь содержит эктопическую последовательность нуклеиновой кислоты, которая кодирует ADAM6 или его функциональный фрагмент, который является функциональным у мыши. Согласно конкретному варианту осуществления эктопическая последовательность нуклеиновой кислоты кодирует белок, который восстанавливает потерю способности производить потомство, проявляемую самцом мыши, который является гомозиготным в отношении нокаута ADAM6. Согласно конкретному варианту осуществления эктопическая последовательность нуклеиновой кислоты кодирует белок ADAM6 мыши.

Согласно одному аспекту предусмотрена мышь, которая не содержит функциональный эндогенный локус ADAM6, и которая содержит эктопическую последовательность нуклеиновой кислоты, которая предоставляет мыши функцию ADAM6. Согласно одному варианту осуществления последовательность нуклеиновой кислоты содержит эндогенную последовательность ADAM6 мыши или ее функциональный фрагмент. Согласно одному варианту осуществления эндогенная последовательность ADAM6 мыши содержит кодирующую ADAM6a и ADAM6b последовательность, расположенную у мыши дикого типа между наиболее 3' генным сегментом V тяжелой цепи (VH) иммуноглобулина мыши и наиболее 5' генным сегментом D тяжелой цепи (DH) иммуноглобулина мыши.

Согласно одному варианту осуществления последовательность нуклеиновой кислоты содержит последовательность, кодирующую ADAM6a мыши или ее функциональный фрагмент, и/или последовательность, кодирующую ADAM6b мыши или ее функциональный фрагмент, причем ADAM6a и/или ADAM6b или их функциональный(е) фрагмент(ы) является(ются) функционально связанным(и) с промотором. Согласно одному варианту осуществления промотор представляет собой промотор человека. Согласно одному варианту осуществления промотор представляет собой промотор ADAM6 мыши. Согласно конкретному варианту осуществления промотор ADAM6 содержит последовательность, расположенную между первым кодоном первого гена ADAM6, ближайшего к наиболее 5' генному сегменту DH мыши и сигнальной последовательностью рекомбинации наиболее 5' генного сегмента DH, причем направление 5' указано по отношению к направлению транскрипции генов иммуноглобулина мыши. Согласно одному варианту осуществления промотор представляет собой вирусный промотор. Согласно конкретному варианту осуществления вирусный промотор представляет собой промотор цитомегаловируса (CMV). Согласно одному варианту осуществления промотор представляет собой промотор убиквитина.

Согласно одному варианту осуществления промотор представляет собой индуцируемый промотор. Согласно одному варианту осуществления индуцируемый промотор регулирует экспрессию в нерепродуктивных тканях. Согласно одному варианту осуществления индуцируемый промотор регулирует экспрессию в репродуктивных тканях. Согласно конкретному варианту осуществления экспрессия последовательностей ADAM6a мыши и/или ADAM6b или их функционального(ых) фрагмента(ов) регулируется в зависимости от стадии развития индуцируемым промотором в репродуктивных тканях.

Согласно одному варианту осуществления ADAM6a мыши и/или ADAM6b выбраны из ADAM6a согласно SEQ ID NO: 1 и/или ADAM6b последовательности SEQ ID NO: 2.

Согласно одному варианту осуществления промотор ADAM6 мыши представляет собой промотор согласно SEQ ID NO: 3. Согласно конкретному варианту осуществления промотор ADAM6 мыши содержит последовательность нуклеиновой кислоты согласно SEQ ID NO: 3 сразу выше (относительно направления транскрипции ADAM6a) первого ко дона ADAM6a и продолжаясь до конца SEQ ID NO: 3 выше кодирующей области ADAM6. Согласно другому конкретному варианту осуществления промотор ADAM6 представляет собой фрагмент, продолжающийся от в пределах приблизительно 5 - приблизительно 20 нуклеотидов выше старт-кодона ADAM6a до приблизительно 0,5 т.п.н., 1 т.п.н., 2 т.п.н. или 3 т.п.н. или более выше старт-кодона ADAM6a.

Согласно одному варианту осуществления промотор ADAM6 мыши представляет собой промотор согласно SEQ ID NO: 73. Согласно конкретному варианту осуществления промотор ADAM6 мыши содержит последовательность нуклеиновой кислоты согласно SEQ ID NO: 73 сразу выше (относительно направления транскрипции ADAM6a) первого кодона ADAM6a и продолжаясь до конца SEQ ID NO: 73 выше кодирующей области ADAM6. Согласно другому конкретному варианту осуществления промотор ADAM6 представляет собой фрагмент, продолжающийся от в пределах приблизительно 5 - приблизительно 20 нуклеотидов выше старт-кодона ADAM6a до приблизительно 0,5 т.п.н., 1 т.п.н., 2 т.п.н. или 3 т.п.н. или более выше старт-кодона ADAM6a.

Согласно одному варианту осуществления промотор ADAM6 мыши представляет собой промотор согласно SEQ ID NO: 77. Согласно конкретному варианту осуществления промотор ADAM6 мыши содержит последовательность нуклеиновой кислоты согласно SEQ ID NO: 77 сразу выше (относительно направления транскрипции ADAM6a) первого кодона ADAM6a и продолжаясь до конца SEQ ID NO: 77 выше кодирующей области ADAM6. Согласно другому конкретному варианту осуществления промотор ADAM6 представляет собой фрагмент, продолжающийся от в пределах приблизительно 5 - приблизительно 20 нуклеотидов выше старт-кодона ADAM6a до приблизительно 0,5 т.п.н., 1 т.п.н., 2 т.п.н. или 3 т.п.н. или более выше старт-кодона ADAM6a.

Согласно одному варианту осуществления последовательность нуклеиновой кислоты содержит SEQ ID NO: 3 или ее фрагмент, который, будучи помещенным в мышь, которая является стерильной или которая характеризуется низкой фертильностью вследствие отсутствия ADAM6, улучшает фертильность или восстанавливает фертильность приблизительно до фертильности дикого типа. Согласно одному варианту осуществления SEQ ID NO: 3 или ее фрагмент предоставляет самцу мыши способность производить сперматозоид, который способен проходить яйцевод самки мыши для оплодотворения яйцеклетки мыши.

Согласно одному варианту осуществления последовательность нуклеиновой кислоты содержит SEQ ID NO: 73 или ее фрагмент, который, будучи помещенным в мышь, которая является стерильной или которая характеризуется низкой фертильностью вследствие отсутствия ADAM6, улучшает фертильность или восстанавливает фертильность приблизительно до фертильности дикого типа. Согласно одному варианту осуществления SEQ ID NO: 73 или ее фрагмент предоставляет самцу мыши способность производить сперматозоид, который способен проходить яйцевод самки мыши для оплодотворения яйцеклетки мыши.

Согласно одному варианту осуществления последовательность нуклеиновой кислоты содержит SEQ ID NO: 77 или ее фрагмент, который, будучи помещенным в мышь, которая является стерильной или которая характеризуется низкой фертильностью вследствие отсутствия ADAM6, улучшает фертильность или восстанавливает фертильность приблизительно до фертильности дикого типа. Согласно одному варианту осуществления SEQ ID NO: 77 или ее фрагмент предоставляет самцу мыши способность производить сперматозоид, который способен проходить яйцевод самки мыши для оплодотворения яйцеклетки мыши.

Согласно одному аспекту предусмотрена мышь, которая содержит делецию эндогенной нуклеотидной последовательности, которая кодирует белок ADAM6, замещение эндогенного генного сегмента VH мыши генным сегментом VH человека и эктопическую нуклеотидную последовательность, которая кодирует белок ADAM6 мыши или его ортолог или гомолог или фрагмент, который является функциональным у самца мыши.

Согласно одному варианту осуществления мышь содержит локус тяжелой цепи иммуноглобулина, который содержит делецию эндогенной нуклеотидной последовательности локуса иммуноглобулина, которая содержит эндогенный ген ADAM6, содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую один или несколько генных сегментов иммуноглобулина человека, и причем эктопическая нуклеотидная последовательность, кодирующая белок ADAM6 мыши находится в пределах или непосредственно прилегает к нуклеотидной последовательности, кодирующей один или несколько генных сегментов иммуноглобулина человека.

Согласно одному варианту осуществления мышь содержит замещение всех или по существу всех эндогенных генных сегментов VH нуклеотидной последовательностью, кодирующей единственный генный сегмент VH человека, и эктопическая нуклеотидная последовательность, кодирующая белок ADAM6 мыши, находится в пределах или непосредственно прилегает к нуклеотидной последовательности, кодирующей единственный генный сегмент VH человека. Согласно одному варианту осуществления мышь дополнительно содержит замещение одного или нескольких эндогенных генных сегментов DH одним или несколькими генными сегментами DH человека на эндогенном генном локусе DH. Согласно одному варианту осуществления мышь дополнительно содержит замещение одного или нескольких эндогенных генных сегментов JH одним или несколькими генными сегментами JH человека на эндогенном генном локусе JH. Согласно одному варианту осуществления мышь содержит замещение всех или по существу всех эндогенных генных сегментов VH, DH и JH и замещение на эндогенных генных локусах VH, DH и JH единственным генным сегментом VH человека, одним или несколькими генными сегментами DH человека и одним или несколькими генными сегментами JH человека, причем мышь содержит эктопическую последовательность, кодирующую белок ADAM6 мыши. Согласно конкретному варианту осуществления эктопическая последовательность, кодирующая белок ADAM6 мыши, расположена выше или 5' относительно единственного генного сегмента VH человека. Согласно другому конкретному варианту осуществления эктопическая последовательность, кодирующая белок ADAM6 мыши, расположена ниже или 3' относительно единственного генного сегмента VH человека. Согласно другому конкретному варианту осуществления эктопическая последовательность, кодирующая белок ADAM6 мыши, расположена между единственным генным сегментом VH человека и первым присутствующим генным сегментом DH человека. Согласно другому конкретному варианту осуществления мышь содержит делецию всех или по существу всех генных сегментов VH мыши и замещение единственным генным сегментом VH человека, и эктопическая нуклеотидная последовательность, кодирующая белок ADAM6 мыши, расположена ниже генного сегмента VH1-69 человека и выше генного сегмента DH1-1 человека. Согласно другому конкретному варианту осуществления мышь содержит делецию всех или по существу всех генных сегментов VH мыши и замещение единственным генным сегментом VH человека, и эктопическая нуклеотидная последовательность, кодирующая белок ADAM6 мыши, расположена ниже генного сегмента VH1-2 человека и выше генного сегмента DH1-1 человека.

Согласно конкретному варианту осуществления мышь содержит замещение всех или по существу всех эндогенных генных сегментов VH нуклеотидной последовательностью, кодирующей единственные генные сегменты VH, и эктопическая нуклеотидная последовательность, кодирующая белок ADAM6 мыши, находится в пределах или непосредственно прилегает к нуклеотидной последовательности, кодирующей единственный генный сегмент VH человека.

Согласно одному варианту осуществления эктопическая нуклеотидная последовательность, которая кодирует мышь белок ADAM6, присутствует на трансгене в геноме мыши. Согласно одному варианту осуществления эктопическая нуклеотидная последовательность, которая кодирует белок ADAM6 мыши, присутствует внехромосомно у мыши.

Согласно одному аспекту предусмотрена мышь, которая содержит модификацию эндогенного локуса тяжелой цепи иммуноглобулина, причем мышь экспрессирует В-клетку, которая содержит реаранжированную последовательность иммуноглобулина, функционально связанную с последовательностью гена константной области тяжелой цепи, и В-клетка содержит в своем геноме (например, на хромосоме В-клетки) ген, кодирующий ADAM6 или его ортолог или гомолог или фрагмент, который является функциональным у самца мыши. Согласно одному варианту осуществления реаранжированная последовательность иммуноглобулина, функционально связанная с последовательностью гена константной области тяжелой цепи, содержит последовательность V, D и/или J тяжелой цепи человека; последовательность V, D и/или J тяжелой цепи мыши; последовательность V и/или J легкой цепи человека или мыши. Согласно одному варианту осуществления последовательность гена константной области тяжелой цепи содержит последовательность тяжелой цепи человека или мыши, выбранную из группы, состоящей из CH1, шарнира, CH2, CH3 и их комбинации.

Согласно одному аспекту предусмотрена мышь, которая содержит функционально выключенный эндогенный локус тяжелой цепи иммуноглобулина, причем у мыши сохраняется функция ADAM6, и дополнительно содержит вставку одного или нескольких генных сегментов иммуноглобулина человека, причем один или несколько генных сегментов иммуноглобулина человека включают в себя единственный генный сегмент VH человека, один или несколько генных сегментов DH человека и один или несколько генных сегментов JH человека. Согласно одному варианту осуществления один или несколько генных сегментов иммуноглобулина человека включают в себя генный сегмент VH1-69 человека, 27 генных сегментов DH человека и шесть генных сегментов JH человека. Согласно одному варианту осуществления один или несколько генных сегментов иммуноглобулина человека включают в себя генный сегмент VH1-2 человека, 27 генных сегментов DH человека и шесть генных сегментов JH человека.

Согласно одному аспекту предусмотрена генетически модифицированная мышь, причем мышь содержит функционально выключенный ген легкой цепи иммуноглобулина и дополнительно содержит замещение одного или нескольких эндогенных генных сегментов вариабельной области тяжелой цепи иммуноглобулина единственным генным сегментом вариабельной области тяжелой цепи иммуноглобулина человека, причем мышь не содержит функциональный эндогенный локус ADAM6, и причем мышь содержит эктопическую нуклеотидную последовательность, которая экспрессирует белок ADAM6 мыши или его ортолог или гомолог или фрагмент, который является функциональным у самца мыши.

Согласно одному аспекту предусмотрена мышь, которая не содержит функциональный эндогенный локус или последовательность ADAM6 мыши и которая содержит эктопическую нуклеотидную последовательность, кодирующую локус ADAM6 мыши или функциональный фрагмент локуса или последовательности ADAM6 мыши, причем мышь способна спариваться с мышью противоположного пола, чтобы производить потомство, которое содержит эктопический локус или последовательность ADAM6. Согласно одному варианту осуществления мышь представляет собой самца. Согласно одному варианту осуществления мышь представляет собой самку.

Согласно одному аспекту предусмотрена генетически модифицированная мышь, причем мышь содержит генный сегмент вариабельной области тяжелой цепи иммуноглобулина человека на эндогенном генном локусе вариабельной области тяжелой цепи иммуноглобулина мыши, мышь не содержит эндогенную функциональную последовательность ADAM6 на эндогенном генном локусе вариабельной области тяжелой цепи иммуноглобулина мыши, и причем мышь содержит эктопическую нуклеотидную последовательность, которая экспрессирует белок ADAM6 мыши или его ортолог или гомолог или фрагмент, который является функциональным у самца мыши.

Согласно одному варианту осуществления эктопическая нуклеотидная последовательность, которая экспрессирует белок ADAM6 мыши, является внехромосомной. Согласно одному варианту осуществления эктопическая нуклеотидная последовательность, которая экспрессирует белок ADAM6 мыши, интегрирована на одном или нескольких локусах в геноме мыши. Согласно конкретному варианту осуществления один или несколько локусов включают в себя локус иммуноглобулина.

Согласно одному аспекту предусмотрена мышь, которая экспрессирует последовательность тяжелой цепи иммуноглобулина из модифицированного эндогенного локуса тяжелой цепи иммуноглобулина мыши, причем тяжелая цепь происходит из генного сегмента V человека, генного сегмента D человека и генного сегмента J человека, причем мышь содержит активность ADAM6, которая является функциональной у мыши.

Согласно одному варианту осуществления мышь содержит единственный генный сегмент V человека, множество генных сегментов D и множество генных сегментов J. Согласно одному варианту осуществления генные сегменты D представляют собой генные сегменты D человека. Согласно одному варианту осуществления генные сегменты J представляют собой генные сегменты J человека. Согласно одному варианту осуществления мышь дополнительно содержит гуманизированную последовательность константной области тяжелой цепи, причем гуманизация предусматривает замещение последовательности, выбранной из CH1, шарнира, CH2, CH3 и их комбинации. Согласно конкретному варианту осуществления тяжелая цепь происходит из генного сегмента V человека, генного сегмента D человека, генного сегмента J человека, последовательности CH1 человека, шарнирной последовательности человека или мыши, последовательность CH2 мыши и последовательности CH3 мыши. Согласно другому конкретному варианту осуществления мышь дополнительно содержит константную последовательность легкой цепи человека.

Согласно одному варианту осуществления мышь содержит ген ADAM6, который фланкирован 5' и 3' эндогенными генными сегментами тяжелой цепи иммуноглобулина. Согласно конкретному варианту осуществления эндогенные генные сегменты тяжелой цепи иммуноглобулина являются неспособными кодировать тяжелую цепь антитела. Согласно конкретному варианту осуществления ген ADAM6 мыши находится в положении, которое является таким же, как и у мыши дикого типа, и эндогенные вариабельные генные локусы тяжелой цепи иммуноглобулина мыши являются неспособными к реаранжировке, чтобы кодировать тяжелую цепь антитела.

Согласно одному варианту осуществления генный сегмент V фланкирован 5' (относительно направления транскрипции генного сегмента V) последовательностью, кодирующей активность ADAM6, которая является функциональной у мыши.

Согласно одному варианту осуществления генный сегмент V фланкирован 3' (относительно направления транскрипции генного сегмента V) последовательностью, кодирующей активность ADAM6, которая является функциональной у мыши.

Согласно одному варианту осуществления генный сегмент D фланкирован 5' (относительно направления транскрипции генного сегмента D) последовательностью, кодирующей активность ADAM6, которая является функциональной у мыши.

Согласно одному варианту осуществления генный сегмент J фланкирован 5' (относительно направления транскрипции генного сегмента J) последовательностью, кодирующей активность ADAM6, которая является функциональной у мыши.

Согласно одному варианту осуществления активность ADAM6, которая является функциональной у мыши, является результатом экспрессии нуклеотидной последовательности, расположенной 5' относительно расположенного наиболее 5' генного сегмента D и 3' относительно единственного генного сегмента V (относительно направления транскрипции генного сегмента V) модифицированного эндогенного локуса тяжелой цепи иммуноглобулина мыши.

Согласно одному варианту осуществления активность ADAM6, которая является функциональной у мыши, является результатом экспрессии нуклеотидной последовательности, расположенной 5' относительно расположенного наиболее 5' генного сегмента J и 3' относительно расположенного наиболее 3' генного сегмента D (относительно направления транскрипции генного сегмента D) модифицированного эндогенного локуса тяжелой цепи иммуноглобулина мыши.

Согласно одному варианту осуществления активность ADAM6, которая является функциональной у мыши, является результатом экспрессии нуклеотидной последовательности, расположенной 5' относительно единственного генного сегмента V человека (относительно направления транскрипции генного сегмента V) модифицированного эндогенного локуса тяжелой цепи иммуноглобулина мыши.

Согласно одному варианту осуществления нуклеотидная последовательность содержит последовательность, выбранную из последовательности ADAM6b мыши или ее функционального фрагмента, последовательности ADAM6a мыши или ее функционального фрагмента и их комбинации.

Согласно одному варианту осуществления нуклеотидная последовательность, расположенная выше (5') или ниже (3') относительно единственного генного сегмента V человека, расположена в противоположной транскрипционной ориентации по отношению к генному сегменту V человека. Согласно конкретному варианту осуществления нуклеотидная последовательность кодирует в направлении 5'-3' относительно направления транскрипции генов ADAM6, последовательность ADAM6a, за которой следует последовательность ADAM6b.

Согласно одному варианту осуществления мышь содержит единственный генный сегмент VH человека, прилегающий или смежный с последовательностью ADAM6 мыши или ее функциональным фрагментом.

Согласно одному варианту осуществления мышь содержит генный сегмент VH1-69 человека, прилегающий или смежный с последовательностью ADAM6 мыши или ее функциональным фрагментом.

Согласно одному варианту осуществления мышь содержит генный сегмент VH1-2 человека, прилегающий или смежный с последовательностью ADAM6 мыши или ее функциональным фрагментом.

Согласно одному варианту осуществления мышь содержит единственный генный сегмент VH человека, и последовательность ADAM6 мыши или ее функциональный фрагмент прилегает или является смежным с эндогенными генными сегментами тяжелой цепи иммуноглобулина, причем эндогенные генные сегменты тяжелой цепи иммуноглобулина являются неспособными к реаранжировке для кодирования тяжелой цепи антитела.

Согласно одному варианту осуществления последовательность, кодирующая активность ADAM6, которая является функциональной у мыши, представляет собой последовательность ADAM6 мыши или ее функциональный фрагмент.

Согласно одному аспекту предусмотрена мышь, которая содержит последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую ADAM6 мыши (или его гомолог или ортолог или функциональный фрагмент) в содержащей ДНК клетке нереаранжированной В-клеточной линии, но не содержит последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую ADAM6 мыши (или его гомолог или ортолог или функциональный фрагмент) в В-клетке, которая содержат реаранжированные локусы иммуноглобулина, причем последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая ADAM6 мыши (или его гомолог или ортолог или функциональный фрагмент) находится в геноме в положении, которое отличается от положения, в котором ген ADAM6 мыши встречается у мыши дикого типа. Согласно одному варианту осуществления последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая ADAM6 мыши (или его гомолог или ортолог или функциональный фрагмент), присутствует во всех или по существу всех содержащих ДНК клетках, которые не происходят из реаранжированной В-клеточной линии; согласно одному варианту осуществления последовательность нуклеиновой кислоты присутствует в зародышевых клетках мыши, но не в хромосоме реаранжированной В-клетки.

Согласно одному аспекту предусмотрена мышь, которая содержит последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую ADAM6 мыши (или его гомолог или ортолог или функциональный фрагмент) во всех или по существу всех содержащих ДНК клетках, включая в себя В-клетки, которые содержат реаранжированные локусы иммуноглобулина, причем последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая ADAM6 мыши (или его гомолог или ортолог или функциональный фрагмент), находится в геноме в положении, которое отличается от положения, в котором ген ADAM6 мыши встречается у мыши дикого типа. Согласно одному варианту осуществления последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая ADAM6 мыши (или его гомолог или ортолог или функциональный фрагмент), находится на нуклеиновой кислоте, которая является смежной с реаранжированным локусом иммуноглобулина. Согласно одному варианту осуществления нуклеиновая кислота, которая является смежной с реаранжированным локусом иммуноглобулина, представляет собой хромосому. Согласно одному варианту осуществления хромосома представляет собой хромосому, которая встречается у мыши дикого типа, и хромосома содержит модификацию локуса иммуноглобулина мыши.

Согласно одному аспекту предусмотрена генетически модифицированная мышь, причем мышь содержит В-клетку, которая содержит в своем геноме последовательность ADAM6 или ее ортолог или гомолог. Согласно одному варианту осуществления последовательность ADAM6 или ее ортолог или гомолог находится на локусе тяжелой цепи иммуноглобулина. Согласно конкретному варианту осуществления локус тяжелой цепи содержит эндогенные генные сегменты тяжелой цепи иммуноглобулина, которые являются неспособными к реаранжировке для кодирования тяжелой цепи антитела. Согласно одному варианту осуществления последовательность ADAM6 или ее ортолог или гомолог находится на локусе, который не является локусом иммуноглобулина. Согласно одному варианту осуществления последовательность ADAM6 находится на трансгене, которым управляет гетерологичный промотор. Согласно конкретному варианту осуществления гетерологичный промотор представляет собой не относящийся к иммуноглобулину промотор. Согласно конкретному варианту осуществления В-клетка экспрессирует белок ADAM6 или его ортолог или гомолог.

Согласно одному варианту осуществления 90% или более В-клеток мыши содержат ген, кодирующий белок ADAM6 или его ортолог или его гомолог или его фрагмент, который является функциональной у мыши. Согласно конкретному варианту осуществления мышь представляет собой самца мыши.

Согласно одному варианту осуществления геном В-клетки содержит первый аллель и второй аллель, содержащий последовательность ADAM6 или ее ортолог или гомолог. Согласно одному варианту осуществления геном В-клетки содержит первый аллель, но не второй аллель, содержащий последовательность ADAM6 или ее ортолог или гомолог.

Согласно одному аспекту предусмотрена мышь, которая содержит модификацию на одном или нескольких эндогенных аллелей тяжелой цепи иммуноглобулина, причем модификация сохраняет один или несколько эндогенных аллелей ADAM6.

Согласно одному варианту осуществления модификация делает мышь неспособной экспрессировать функциональную тяжелую цепь, которая содержит реаранжированные эндогенные генные сегменты тяжелой цепи по меньшей мере из одного аллеля тяжелой цепи и сохраняет эндогенный аллель ADAM6, расположенный в пределах по меньшей мере одного эндогенного аллеля тяжелой цепи иммуноглобулина.

Согласно одному варианту осуществления мыши являются неспособными экспрессировать функциональную тяжелую цепь, которая содержит реаранжированные эндогенные генные сегменты тяжелой цепи по меньшей мере из одного из эндогенных аллелей тяжелой цепи иммуноглобулина, и мыши экспрессируют белок ADAM6 из эндогенного аллеля ADAM6. Согласно конкретному варианту осуществления мыши являются неспособными экспрессировать функциональную тяжелую цепь, которая содержит реаранжированные эндогенные генные сегменты тяжелой цепи из двух эндогенных аллелей тяжелой цепи иммуноглобулина, и мыши экспрессируют белок ADAM6 из одного или нескольких эндогенных аллелей ADAM6.

Согласно одному варианту осуществления мыши являются неспособными экспрессировать функциональную тяжелую цепь из каждого эндогенного аллеля тяжелой цепи, и мыши содержат функциональный аллель ADAM6, расположенный в пределах 1, 2, 3, 4, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110 или 120 или более миллионов пар нуклеотидов выше (относительно направления транскрипции локуса тяжелой цепи мыши) последовательности константной области тяжелой цепи иммуноглобулина мыши. Согласно конкретному варианту осуществления функциональный аллель ADAM6 находится на эндогенном локусе тяжелой цепи иммуноглобулина (например, в межгенной области V-D, между двумя генными сегментами V, между генным сегментом V и D, между генным сегментом D и J и т.д.). Согласно конкретному варианту осуществления функциональный аллель ADAM6 расположен в пределах 90-100 т.п.н. межгенной последовательности между последним генным сегментом V мыши и первым генным сегментом D мыши.

Согласно одному аспекту предусмотрена мышь, которая содержит модификацию на одном или нескольких эндогенных аллелях ADAM6.

Согласно одному варианту осуществления модификация делает мышь неспособной экспрессировать функциональный белок ADAM6 по меньшей мере из одного из одного или нескольких эндогенных аллелей ADAM6. Согласно конкретному варианту осуществления мышь является неспособной экспрессировать функциональный белок ADAM6 из каждого из эндогенных аллелей ADAM6.

Согласно одному варианту осуществления мыши являются неспособными экспрессировать функциональный белок ADAM6 из каждого эндогенного аллеля ADAM6, и мыши содержат эктопическую последовательность ADAM6.

Согласно одному варианту осуществления мыши являются неспособными экспрессировать функциональный белок ADAM6 из каждого эндогенного аллеля ADAM6, и мыши содержат эктопическую последовательность ADAM6, расположенную в пределах 1, 2, 3, 4, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110 или 120 или более т.п.н. выше (относительно направления транскрипции локуса тяжелой цепи мыши) последовательности константной области тяжелой цепи иммуноглобулина мыши. Согласно конкретному варианту осуществления эктопическая последовательность ADAM6 находится на эндогенном локусе тяжелой цепи иммуноглобулина (например, в межгенной области V-D, между двумя генными сегментами V, между генным сегментом V и D, между генным сегментом D и J и т.д.). Согласно конкретному варианту осуществления эктопическая последовательность ADAM6 расположена в пределах 90-100 т.п.н. межгенной последовательности между последним генным сегментом V мыши и первым генным сегментом D мыши. Согласно другому конкретному варианту осуществления эндогенную 90-100 т.п.н. межгенную последовательность V-D удаляют, и эктопическая последовательность ADAM6 размещают между единственным генным сегментом V человека и первым генным сегментом D человека. Согласно другому конкретному варианту осуществления эндогенную межгенную последовательность V-D размером 90-100 т.п.н. удаляют, и эктопическую последовательность ADAM6 размещают 5' или выше относительно единственного генного сегмента V человека.

Согласно одному аспекту предусмотрен стерильный самец мыши, причем мышь содержит делецию двух или более эндогенных аллелей ADAM6. Согласно одному аспекту предусмотрена самка мыши, которая представляет собой носителя признака мужской стерильности, причем самка мыши содержит в своей зародышевой линии нефункциональный аллель ADAM6 или нокаут эндогенного аллеля ADAM6.

Согласно одному аспекту предусмотрена мышь, содержащая эндогенный генный сегмент V, D и/или J тяжелой цепи иммуноглобулина, который является неспособным к реаранжировке, чтобы кодировать тяжелую цепь антитела, причем большинство В-клеток мыши содержат функциональный ген ADAM6.

Согласно одному варианту осуществления мышь содержит интактные эндогенные генные сегменты V, D и J тяжелой цепи иммуноглобулина, которые являются неспособными к реаранжировке, чтобы кодировать функциональную тяжелую цепь антитела. Согласно одному варианту осуществления мышь содержит по меньшей мере один и до 89 генных сегментов V, по меньшей мере один и до 13 генных сегментов D, по меньшей мере один и до четырех генных сегментов J и их комбинацию; причем по меньшей мере один и до 89 генных сегментов V, по меньшей мере один и до 13 генных сегментов D, по меньшей мере один и до четырех генных сегментов J являются неспособными к реаранжировке, чтобы кодировать вариабельную область тяжелой цепи антитела. Согласно конкретному варианту осуществления мышь содержит функциональный ген ADAM6, расположенный в пределах интактных эндогенных генных сегментов V, D и J тяжелой цепи иммуноглобулина. Согласно одному варианту осуществления мышь содержит эндогенный локус тяжелой цепи, который включает в себя эндогенный локус ADAM6, причем эндогенный локус тяжелой цепи содержит 89 генных сегментов V, 13 генных сегментов D и четыре генных сегмента J, причем эндогенные генные сегменты тяжелой цепи являются неспособными к реаранжировке, чтобы кодировать вариабельную область тяжелой цепи антитела, и локус ADAM6 кодирует белок ADAM6, который является функциональным у мыши.

Согласно одному аспекту предусмотрена мышь, которая не содержит эндогенный генный сегмент V, D и J тяжелой цепи иммуноглобулина, причем большинство В-клеток мыши содержат последовательность ADAM6 или ее ортолог или гомолог.

Согласно одному варианту осуществления мышь не содержит эндогенные генные сегменты тяжелой цепи иммуноглобулина, выбранные из двух или более генных сегментов V, двух или более генных сегментов D, двух или более генных сегментов J и их комбинации. Согласно одному варианту осуществления мышь не содержит генные сегменты тяжелой цепи иммуноглобулина, выбранные по меньшей мере из одного и до 89 генных сегментов V, по меньшей мере одного и до 13 генных сегментов D, по меньшей мере одного и до четырех генных сегментов J и их комбинации. Согласно одному варианту осуществления мышь не содержит геномный фрагмент ДНК из хромосомы 12, содержащей приблизительно три миллиона пар нуклеотидов эндогенного локуса тяжелой цепи иммуноглобулина. Согласно конкретному варианту осуществления мышь не содержит все функциональные эндогенные генные сегменты V, D и J тяжелой цепи. Согласно конкретному варианту осуществления мышь не содержит 89 генных сегментов VH, 13 генных сегментов DH и четыре генных сегмента JH.

Согласно одному аспекту предусмотрена мышь, причем мышь содержит геном в зародышевой линии, содержащий модификацию локуса тяжелой цепи иммуноглобулина, причем модификация локуса тяжелой цепи иммуноглобулина содержит замещение одной или нескольких последовательностей вариабельной области иммуноглобулина мыши одной не относящейся к мыши последовательностью вариабельной области иммуноглобулина, и причем мышь содержит последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую белок ADAM6 мыши. Согласно предпочтительному варианту осуществления последовательности DH и JH и по меньшей мере 3, по меньшей мере 10, по меньшей мере 20, по меньшей мере 40, по меньшей мере 60 или по меньшей мере 80 последовательностей VH эндогенного локуса тяжелой цепи иммуноглобулина замещают не относящимися к мыши последовательностями тяжелой цепи иммуноглобулина. Согласно дополнительному предпочтительному варианту осуществления последовательности DH, JH и все последовательности VH эндогенного локуса тяжелой цепи иммуноглобулина замещают последовательностями единственного не относящегося к мыши генного сегмента V иммуноглобулина, одного или нескольких генных сегментов D и одного или нескольких генных сегментов J. Не относящиеся к мыши последовательности иммуноглобулина могут являться нереаранжированными. Согласно предпочтительному варианту осуществления не относящиеся к мыши последовательности иммуноглобулина содержат полные нереаранжированные области DH и JH и единственную нереаранжированную последовательность VH не относящегося к мыши вида. Согласно дополнительному предпочтительному варианту осуществления не относящиеся к мыши последовательности иммуноглобулина способны образовывать полную вариабельную область, т.е. реаранжированную вариабельную область, содержащую сегменты VH, DH и JH, соединенные вместе для образования последовательности, которая кодирует вариабельную область тяжелой цепи, не относящегося к мыши вида. Не относящийся к мыши вид может представлять собой Homo sapiens, и не относящиеся к мыши последовательности иммуноглобулина могут представлять собой последовательности человека.

Согласно одному аспекту предусмотрен локус тяжелой цепи иммуноглобулина, который содержит единственный функциональный сегмент V человека. Согласно одному варианту осуществления единственный функциональный сегмент V человека выбран из сегментов VH1-2, VH1-3, VH1-8, VH1-18, VH1-24, VH1-45, VH1-46, VH1-58, VH1-69, VH2-5, VH2-26, VH2-70, VH3-7, VH3-9, VH3-11, VH3-13, VH3-15, VH3-16, VH3-20, VH3-21, VH3-23, VH3-30, VH3-30-3, VH3-30-5, VH3-33, VH3-35, VH3-38, VH3-43, VH3-48, VH3-49, VH3-53, VH3-64, VH3-66, VH3-72, VH3-73, VH3-74, VH4-4, VH4-28, VH4-30-1, VH4-30-2, VH4-30-4, VH4-31, VH4-34, VH4-39, VH4-59, VH4-61, VH5-51, VH6-1, VH7-4-1 и VH7-81. Согласно одному варианту осуществления единственный функциональный сегмент V человека представляет собой сегмент VH1-69; согласно конкретному варианту осуществления единственный функциональный сегмент V человека присутствует в 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 или 13 полиморфных формах, обнаруженных в человеческой популяции. Согласно одному варианту осуществления единственный функциональный сегмент V человека представляет собой сегмент VH1-2; согласно конкретному варианту осуществления один функциональный сегмент V человека присутствует в 1, 2, 3, 4 или 5 полиморфных формах, обнаруженных в человеческой популяции.

Согласно одному варианту осуществления локус тяжелой цепи иммуноглобулина представляет собой модифицированный локус не относящегося к человеку животного. Согласно одному варианту осуществления модифицированный не относящийся к человеку локус тяжелой цепи иммуноглобулина присутствует у не относящегося к человеку животного в положении в геноме, в котором находится соответствующий немодифицированный не относящийся к человеку локус у не относящегося к человеку животного дикого типа. Согласно одному варианту осуществления модифицированный не относящийся к человеку локус тяжелой цепи иммуноглобулина присутствует на трансгене у не относящегося к человеку животного.

Согласно одному варианту осуществления один функциональный генный сегмент V человека представляет собой генный сегмент VH1-69. Согласно одному варианту осуществления генный сегмент VH1-69 содержит SEQ ID NO:37. Согласно одному варианту осуществления генный сегмент VH1-69 происходит из SEQ ID NO: 37. Согласно одному варианту осуществления генный сегмент VH1-69 по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95% или по меньшей мере на 98% идентичен SEQ ID NO: 37.

Согласно одному варианту осуществления один функциональный генный сегмент V человека кодируется нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 37.

Согласно одному варианту осуществления один функциональный генный сегмент V человека представляет собой генный сегмент VH1-2. Согласно одному варианту осуществления генный сегмент VH1-2 содержит SEQ ID NO: 63. Согласно одному варианту осуществления генный сегмент VH1-2 происходит из SEQ ID NO: 63. Согласно одному варианту осуществления генный сегмент VH1-2 по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95% или по меньшей мере на 98% идентичен SEQ ID NO: 63.

Согласно одному варианту осуществления единственный функциональный генный сегмент V человека кодируется нуклеотидной последовательностью, содержащей SEQ ID NO: 63.

Согласно одному варианту осуществления один функциональный генный сегмент V человека функционально связан с одним или несколькими сегментами D и одним или несколькими сегментами J, или одним или несколькими сегментами J. Согласно одному варианту осуществления сегмент V и один или несколько сегментов D и/или J функционально связаны с последовательностью константной области тяжелой цепи иммуноглобулина. Согласно одному варианту осуществления последовательность константной области тяжелой цепи иммуноглобулина выбрана из последовательности CH1, шарнира, CH2, CH3 и их комбинации. Согласно одному варианту осуществления каждая из CH1, шарнира, CH2, CH3 или их комбинации представляет собой не относящиеся к человеку эндогенные константные последовательности. Согласно одному варианту осуществления по меньшей мере одна из CH1, шарнира, CH2, CH3 или их комбинации представляет собой последовательность человека. Согласно конкретному варианту осуществления CH1 и/или шарнир представляют собой последовательности человека.

Согласно одному аспекту предусмотрен модифицированный эндогенный не относящийся к человеку локус тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащий замещение всех функциональных сегментов V единственным сегментом V человека, причем не относящийся к человеку локус тяжелой цепи иммуноглобулина является неспособным к реаранжировке для образования вариабельного гена тяжелой цепи, который происходит из сегмента V, отличного от единственного сегмента V человека.

Согласно одному варианту осуществления единственный сегмент V человека представляет собой VH1-69. Согласно одному варианту осуществления единственный сегмент V человека представляет собой VH1-2.

Согласно одному варианту осуществления локус содержит по меньшей мере один сегмент DH человека или не относящийся к человеку сегмент DH и один сегмент JH человека или не относящийся к человеку сегмент JH. Согласно конкретному варианту осуществления локус содержит сегмент DH человека и сегмент JH человека. Согласно конкретному варианту осуществления локус содержит сегмент JH человека. Согласно другому конкретному варианту осуществления локус содержит сегмент VH1-69 человека, все функциональные сегменты DH человека и все функциональные сегменты JH человека. Согласно одному варианту осуществления сегменты V, D и J человека (или сегменты V и J) функционально связаны с геном константной области мыши на эндогенном локусе тяжелой цепи мыши. Согласно конкретному варианту осуществления локус тяжелой цепи мыши содержит репертуар дикого типа последовательностей константной области иммуноглобулина мыши.

Согласно одному аспекту предусмотрено генетически модифицированное не относящееся к человеку животное, причем только функциональный генный сегмент V тяжелой цепи иммуноглобулина не относящегося к человеку животного выбран из сегмента VH1-2, VH1-3, VH1-8, VH1-18, VH1-24, VH1-45, VH1-46, VH1-58, VH1-69, VH2-5, VH2-26, VH2-70, VH3-7, VH3-9, VH3-11, VH3-13, VH3-15, VH3-16, VH3-20, VH3-21, VH3-23, VH3-30, VH3-30-3, VH3-30-5, VH3-33, VH3-35, VH3-38, VH3-43, VH3-48, VH3-49, VH3-53, VH3-64, VH3-66, VH3-72, VH3-73, VH3-74, VH4-4, VH4-28, VH4-30-1, VH4-30-2, VH4-30-4, VH4-31, VH4-34, VH4-39, VH4-59, VH4-61, VH5-51, VH6-1, VH7-4-1 и VH7-81 человека. Согласно одному варианту осуществления генный сегмент V тяжелой цепи представляет собой генный сегмент VH1-69 человека. Согласно одному варианту осуществления генный сегмент V тяжелой цепи представляет собой генный сегмент VH1-2 человека.

Согласно одному аспекту предусмотрено генетически модифицированное не относящееся к человеку животное, причем не относящееся к человеку животное содержит единственный функциональный сегмент VH человека, и причем не относящееся к человеку животное по существу не способно образовывать реаранжированный ген вариабельного домена тяжелой цепи иммуноглобулина, который не содержит единственный функциональный сегмент VH человека.

Согласно одному аспекту предусмотрено генетически модифицированное не относящееся к человеку животное, причем только вариабельная область тяжелой цепи иммуноглобулина, экспрессируемая у не относящегося к человеку животного, происходит от одного сегмента человека, выбранного из генных сегментов VH1-2, VH1-3, VH1-8, VH1-18, VH1-24, VH1-45, VH1-46, VH1-58, VH1-69, VH2-5, VH2-26, VH2-70, VH3-7, VH3-9, VH3-11, VH3-13, VH3-15, VH3-16, VH3-20, VH3-21, VH3-23, VH3-30, VH3-30-3, VH3-30-5, VH3-33, VH3-35, VH3-38, VH3-43, VH3-48, VH3-49, VH3-53, VH3-64, VH3-66, VH3-72, VH3-73, VH3-74, VH4-4, VH4-28, VH4-30-1, VH4-30-2, VH4-30-4, VH4-31, VH4-34, VH4-39, VH4-59, VH4-61, VH5-51, VH6-1, VH7-4-1 и VH7-81 человека. Согласно одному варианту осуществления сегмент человека представляет собой сегмент VH1-69. Согласно одному варианту осуществления сегмент человека представляет собой сегмент VH1-2. Согласно одному варианту осуществления единственный вариабельный участок тяжелой цепи иммуноглобулина, экспрессируемый мышью, происходит от единственного представителя семейства сегментов V, и согласно одному варианту осуществления только вариабельную область тяжелой цепи иммуноглобулина получают из полиморфного варианта единственного представителя семейства сегментов V.

Согласно одному аспекту предусмотрено не относящееся к человеку животное, содержащее ограниченный репертуар генных сегментов V тяжелой цепи иммуноглобулина, причем не относящееся к человеку животное дополнительно содержит один или несколько вариабельных сегментов легкой цепи κ (Vκ) иммуноглобулина человека. Согласно одному варианту осуществления один или несколько сегментов Vκ функционально связаны с одним или несколькими сегментами J человека. Согласно конкретному варианту осуществления сегменты J представляют собой сегменты J человека. Согласно другому конкретному варианту осуществления не относящееся к человеку животное не экспрессирует легкую цепь λ, иммуноглобулина. Согласно другому конкретному варианту осуществления не относящееся к человеку животное не содержит функциональный относящийся к человеку или функциональный эндогенный вариабельный локус легкой цепи λ иммуноглобулина.

Согласно одному варианту осуществления не относящееся к человеку животное представляет собой мышь.

Согласно одному варианту осуществления не относящееся к человеку животное содержит замещение на эндогенном не относящемся к человеку локусе Vκ иммуноглобулина всех или по существу всех функциональных эндогенных сегментов Vκ одним или несколькими функциональными человека сегментами Vκ. Согласно дополнительному конкретному варианту осуществления замещение осуществляется всеми или по существу всеми функциональными сегментами Vκ иммуноглобулина человека.

Согласно одному варианту осуществления не относящееся к человеку животное содержит замещение на эндогенном не относящемся к человеку локусе Jκ иммуноглобулина всех или по существу всех функциональных эндогенных не относящихся к человеку сегментов Jκ иммуноглобулин одним или несколькими функциональными сегментами Jκ иммуноглобулина человека. Согласно дополнительному конкретному варианту осуществления осуществляется всеми или по существу всеми функциональными сегментами Jκ иммуноглобулина человека.

Согласно конкретному варианту осуществления не относящееся к человеку животное содержит локус вариабельной области тяжелой цепи иммуноглобулина, который содержит репертуар сегментов V, состоящих преимущественно из единственного сегмента V и/или его полиморфных вариантов. Согласно конкретному варианту осуществления единственный сегмент V тяжелой цепи иммуноглобулина представляет собой VH1-69 сегмент человека, и не относящееся к человеку животное дополнительно содержит замещение всех не относящихся к человеку функциональных сегментов DH всеми функциональными сегментами DH человека, и дополнительно содержит замещение всех не относящихся к человеку функциональных сегментов JH всеми функциональными сегментами JH человека, и причем локус вариабельной области тяжелой цепи иммуноглобулина функционально связан с генной последовательностью константной области человека или не относящейся к человеку константной области. Согласно конкретному варианту осуществления генная последовательность константной области представляет собой эндогенную генную последовательность не относящейся к человеку константной области. Согласно конкретному варианту осуществления не относящееся к человеку животное реаранжирует сегменты в локусе тяжелой цепи не относящегося к человеку иммуноглобулина с образованием гена, кодирующего вариабельную область тяжелой цепи, содержащую последовательность VH1-69 человека, последовательность DH человека, последовательность JH человека и последовательность константной области мыши.

Согласно конкретному варианту осуществления не относящееся к человеку животное содержит локус вариабельной области тяжелой цепи иммуноглобулина, который содержит репертуар сегментов V, состоящих преимущественно из единственного сегмента V и/или его полиморфных вариантов. Согласно конкретному варианту осуществления единственный сегмент V тяжелой цепи иммуноглобулина представляет собой сегмент VH1-2 человека, и не относящееся к человеку животное дополнительно содержит замещение всех не относящихся к человеку функциональных сегментов DH всеми функциональными сегментами DH человека, и дополнительно содержит замещение всех не относящихся к человеку функциональных сегментов JH всеми функциональными сегментами JH человека, и причем локус вариабельной области тяжелой цепи иммуноглобулин функционально связан с генной последовательностью константной области человека или не относящейся к человеку константной области. Согласно конкретному варианту осуществления генная последовательность константной области представляет собой эндогенную генную последовательность не относящейся к человеку константной области. Согласно конкретному варианту осуществления не относящееся к человеку животное реаранжирует сегменты в локусе тяжелой цепи не относящегося к человеку иммуноглобулина с образованием гена, кодирующего вариабельную область тяжелой цепи, содержащую последовательность VH1-2 человека, последовательность DH человека, последовательность JH человека и последовательность константной области мыши.

Согласно одному варианту осуществления предусмотрена В-клетка, которая содержит реаранжированный ген. Согласно конкретному варианту осуществления В-клетка представляет собой В-клетку описанной в настоящем документе мыши которая была иммунизирована представляющим интерес антигеном, и В-клетка кодирует антитело, которое специфически связывается с представляющим интерес антигеном. Согласно одному варианту осуществления представляющий интерес антиген представляет собой патоген. Согласно конкретному варианту осуществления патоген выбирают из вируса гриппа, вируса гепатита (например, вируса гепатита В или гепатита С) и вируса иммунодефицита человека. Согласно конкретному варианту осуществления В-клетка кодирует соматически мутированное высокоаффинное (например, приблизительно 10-9 KD или ниже) антитело, содержащее вариабельную область легкой цепи человека (например, вариабельную область легкой цепи κ человека), которое специфически связывается с представляющим интерес антигеном.

Согласно одному аспекту предусмотрено не относящееся к человеку животное, содержащее ограниченный репертуар сегментов V тяжелой цепи иммуноглобулина, причем не относящееся к человеку животное содержит один или несколько вариабельных сегментов (Vλ) легкой цепи λ человека. Согласно одному варианту осуществления один или несколько сегментов Vλ человека функционально связаны с одним или несколькими сегментами J человека. Согласно конкретному варианту осуществления сегменты J представляют собой сегменты Jλ человека. Согласно другому конкретному варианту осуществления не относящееся к человеку животное не экспрессируют легкую цепь κ. Согласно другому конкретному варианту осуществления не относящееся к человеку животное не содержит функциональный вариабельный локус легкой цепи κ человека или не относящегося к человеку.

Согласно одному варианту осуществления не относящееся к человеку животное содержит замещение всех или по существу всех функциональных сегментов Vλ не относящегося к человеку иммуноглобулина. Согласно дополнительному конкретному варианту осуществления замещение осуществляется всеми или по существу всеми функциональными сегментами Vλ иммуноглобулина человека.

Согласно одному варианту осуществления не относящееся к человеку животное содержит замещение всех или по существу всех функциональных не относящихся к человеку сегментов Jλ иммуноглобулина одним или несколькими функциональными сегментами Jλ иммуноглобулина человека. Согласно дополнительному конкретному варианту осуществления замещение осуществляется всеми или по существу всеми функциональными сегментами Jλ иммуноглобулина человека.

Согласно конкретному варианту осуществления не относящееся к человеку животное содержит локус вариабельной области (VH) тяжелой цепи иммуноглобулина, который содержит только единственный сегмент VH, причем единственный сегмент VH представляет собой сегмент VH1-69 человека или сегмент VH1-2 человека, и дополнительно содержит замещение всех функциональных не относящихся к человеку сегментов DH всеми функциональными сегментами DH человека, и дополнительно содержит замещение всех функциональных не относящихся к человеку сегментов JH всеми функциональными сегментами JH человека, и причем локус VH области функционально связан с генной последовательностью константной области человека или не относящейся к человеку. Согласно конкретному варианту осуществления генная последовательность константной области представляет собой генную последовательность не относящейся к человеку константной области, например, эндогенную генную последовательность не относящейся к человеку константной области. Согласно конкретному варианту осуществления не относящееся к человеку животное реаранжирует сегменты в локусе тяжелой цепи не относящегося к человеку иммуноглобулина с образованием гена, кодирующего вариабельную область тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащую последовательность VH1-69 человека (или последовательность VH1-2 человека), последовательность DH человека, последовательность JH человека и эндогенную последовательность не относящейся к человеку константной области.

Согласно одному варианту осуществления предусмотрена В-клетка, которая содержит реаранжированный ген. Согласно конкретному варианту осуществления В-клетка представляет собой клетку описанного в настоящем документе не относящегося к человеку животного, которое иммунизировали представляющим интерес антигеном, и В-клетка кодирует антитело, которое специфически связывается с представляющим интерес антигеном. Согласно одному варианту осуществления антиген представляет собой белок человека, выбранный из лиганда, рецептора клеточной поверхности и внутриклеточного белка. Согласно одному варианту осуществления представляющий интерес антиген представляет собой патоген. Согласно конкретному варианту осуществления патоген выбирают из вируса гриппа, вирус гепатита (например, вируса гепатита В или гепатита С) и вируса иммунодефицита человека. Согласно конкретному варианту осуществления В-клетка кодирует соматически мутированное высокоаффинное (например, приблизительно 10-9 KD или ниже) антитело, содержащее вариабельную область легкой цепи человека (например, вариабельную область легкой цепи λ человека), которое специфически связывается с представляющим интерес антигеном.

Согласно одному аспекту предусмотрено не относящееся к человеку животное, содержащее ограниченный репертуар сегментов V тяжелой цепи иммуноглобулина, причем не относящееся к человеку животное содержит сегмент VH1-69 человека (или сегмент VH1-2 человека) на трансгене, причем сегмент VH1-69 человека функционально связан на трансгене с сегментом DH человека или не относящимся к человеку сегментом DH и/или с сегментом J человека или не относящимся к человеку сегментом J, и трансген дополнительно содержит ген константной области человека или не относящейся к человеку или химерную константную область человека/не относящуюся к человеку (например, CH1, шарнир, CH2, CH3 или их комбинацию, где по меньшей мере одна последовательность представляет собой не относящуюся к человеку последовательность, например, выбранную из шарнира, CH2 и CH3 и/или шарнира). Согласно одному варианту осуществления не относящееся к человеку животное представляет собой мышь или крысу, и ген не относящегося к человеку D, J и/или константной области представляет собой ген мыши или крысы или химерный ген человека/мыши или крысы.

Согласно одному варианту осуществления не относящееся к человеку животное содержит трансген, который содержит локус вариабельной области легкой цепи иммуноглобулина, который содержит один или несколько сегментов Vλ и сегментов Jλ иммуноглобулина человека или один или несколько сегментов Vκ и сегментов Jκ иммуноглобулина человека и ген константной области легкой цепи κ или λ иммуноглобулина человека, в результате чего трансген реаранжирует у не относящегося к человеку животного для образования реаранжированного гена легкой цепи κ или λ иммуноглобулина.

Согласно конкретному варианту осуществления не относящееся к человеку животное содержит трансген, содержащий вариабельный локус тяжелой цепи иммуноглобулина, который содержит единственный сегмент V, представляющий собой сегмент VH1-69человека (или сегмент VH1-2чeлoвeкa), один или несколько сегментов D человека, один или несколько сегментов J человека и константный ген человека, функционально связанный с вариабельным локусом тяжелой цепи, в результате чего мышь экспрессирует с трансгена полное антитело человека, полученное из сегмента VH1-69 (или сегмента VH1-2). Согласно одному варианту осуществления не относящееся к человеку животное не содержит функциональный эндогенный локус вариабельной области тяжелой цепи иммуноглобулина. Согласно конкретному варианту осуществления не относящееся к человеку животное содержит нефункциональный эндогенный локус вариабельной области тяжелой цепи иммуноглобулина, который содержит делецию эндогенного не относящегося к человеку сегмента DH и/или эндогенного не относящегося к человеку сегмента JH, в результате чего не относящееся к человеку животное не способно к реаранжировке локуса вариабельной области тяжелой цепи иммуноглобулина с образованием реаранжированного гена не относящегося к человеку антитела. Согласно конкретному варианту осуществления не относящееся к человеку животное содержит делецию последовательности переключения, функционально связанную с эндогенной константной областью тяжелой цепи мыши. Согласно конкретному варианту осуществления последовательность переключения представляет собой не относящуюся к человеку (например, относящуюся к мыши) последовательность переключения μ. Согласно другому варианту осуществления не относящееся к человеку животное дополнительно не содержит функциональный эндогенный вариабельный локус легкой цепи, выбранный из локуса κ иммуноглобулина и локуса λ иммуноглобулина. Согласно конкретному варианту осуществления не относящееся к человеку животное содержит делецию последовательности Jκ и/или Jλ, так что не относящееся к человеку животное не способно к реаранжировке эндогенной вариабельной области легкой цепи κ не относящегося к человеку иммуноглобулина и/или эндогенной вариабельной области легкой цепи λ не относящегося к человеку иммуноглобулина с образованием реаранжированного эндогенного гена κ легкой цепи не относящегося к человеку иммуноглобулина и/или λ легкой цепи не относящегося к человеку иммуноглобулина.

Согласно одному варианту осуществления не относящееся к человеку животное содержит делецию эндогенной последовательности κ легкой цепи не относящегося к человеку иммуноглобулина, что приводит к функциональному нокауту эндогенной κ легкой цепи не относящегося к человеку иммуноглобулина. Согласно одному варианту осуществления не относящееся к человеку животное содержит делецию эндогенной последовательности λ легкой цепи не относящегося к человеку иммуноглобулина, что приводит к функциональному нокауту эндогенной λ легкой цепи не относящегося к человеку иммуноглобулина.

Согласно одному аспекту предусмотрен грызун, которые содержит вариабельный репертуар тяжелой цепи иммуноглобулина, происходящий не более чем из одного сегмента VH человека или его одного или нескольких полиморфов, из сегмента D, выбранного из репертуара одного или нескольких сегментов D, и из сегмента J, выбранного из репертуара одного или нескольких сегментов J; причем грызун содержит эктопическую последовательность ADAM6 или ее ортолог или гомолог или фрагмент, который является функциональным у самца грызуна.

Согласно одному варианту осуществления сегмент VH человека присутствует в 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 или больше полиморфных вариантах, причем каждый полиморфный вариант функционально связан с сегментом D и/или J так, что каждый полиморфный вариант способен к реаранжировке и образованию реаранжированного вариабельного домена тяжелой цепи с любым одним или несколькими сегментами D и любым одним или несколькими сегментами J. Согласно одному варианту осуществления грызун представляет собой мышь или крысу. Согласно одному варианту осуществления репертуар сегментов D содержит два или больше сегментов D. Согласно одному варианту осуществления репертуар сегментов J содержит два или больше сегментов J. Согласно одному варианту осуществления сегменты D и/или J представляют собой сегменты человека. Согласно одному варианту осуществления эктопическая последовательность ADAM6 представляет собой последовательность ADAM6 грызуна дикого типа того же вида. Согласно одному варианту осуществления грызун представляет собой мышь или крысу. Согласно одному варианту осуществления эктопическая последовательность ADAM6 или ее ортолог или гомолог или фрагмент, который является функциональным у самца грызуна, находится на той же хромосоме, что и модифицированный вариабельный репертуар тяжелой цепи иммуноглобулина; согласно одному варианту осуществления он находится на другой хромосоме.

Согласно одному аспекту предусмотрен нуклеотидный конструкт, который содержит последовательность, кодирующую единственный сегмент тяжелой цепи VH иммуноглобулина человека и/или его полиморфные варианты и одну или несколько последовательностей DH и одну или несколько последовательностей J, причем конструкт содержит по меньшей мере одно гомологичное плечо, гомологичное не относящемуся к человеку вариабельному локусу тяжелой цепи иммуноглобулина или сайту распознавания рекомбиназы (например, сайту lox). Согласно одному варианту осуществления сегмент V представляет собой сегмент VH1-69 или сегмент VH1-2.

Согласно одному аспекту предусмотрен нуклеотидный конструкт, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую единственный сегмент V тяжелой цепи иммуноглобулина человека, причем единственный сегмент VH представляет собой сегмент VH1-69 (или VH1-2). Согласно одному варианту осуществления конструкт содержит сайт распознавания сайт-специфической рекомбиназы. Согласно одному варианту осуществления конструкт содержит первое гомологичное плечо мыши выше относительно сегмента VH1-69 (или VH1-2) и второе гомологичное плечо мыши ниже относительно сегмента VH1-69 (или VH1-2), и причем первое гомологичное плечо мыши является гомологичным области хромосомы мыши сразу выше относительно вариабельной области тяжелой цепи иммуноглобулина мыши, но не включая в себя функциональный вариабельный сегмент тяжелой цепи иммуноглобулина мыши. Согласно одному варианту осуществления конструкт содержит SEQ ID NO: 6. Согласно одному варианту осуществления конструкт содержит SEQ ID NO: 74. Согласно одному варианту осуществления конструкт содержит SEQ ID NO: 75. Согласно одному варианту осуществления конструкт содержит SEQ ID NO: 76.

Согласно одному аспекту ограниченный единственный сегмент VH находится у не относящегося к человеку животного или ограниченный сегмент VH находится в локусе тяжелой цепи не относящегося к человеку иммуноглобулина (например, in situ или в трансгене), и не относящееся к человеку животное или локус тяжелой цепи не относящегося к человеку иммуноглобулина выбирают из локуса или животного: мыши, крысы, кролика, свиньи, крупного рогатого скота (например, коровы, быка, буйвола), оленя, овцы, козы, курицы, кошки, собаки, хорька, примата (например, мармазетки, макака-резуса). Согласно конкретному варианту осуществления не относящееся к человеку животное или локус представляет собой локус мыши или крысы.

Согласно одному аспекту предусмотрен нацеливающий вектор, содержащий (а) нуклеотидную последовательность, которая идентична или по существу идентична нуклеотидной последовательности генного сегмента вариабельной области человека; и (b) нуклеотидную последовательность, кодирующую ADAM6 мыши или его ортолог или гомолог или фрагмент, который является функциональным у мыши.

Согласно одному варианту осуществления нацеливающий вектор дополнительно содержит промотор, функционально связанный с последовательностью, кодирующей ADAM6 мыши. Согласно конкретному варианту осуществления промотор представляет собой промотор ADAM6 мыши.

Согласно одному аспекту предусмотрен нуклеотидный конструкт для модификации вариабельного локуса тяжелой цепи иммуноглобулина мыши, причем конструкт содержит по меньшей мере один сайт распознавания сайт-специфической рекомбиназы и последовательность, кодирующую белок ADAM6 или его ортолог или гомолог или фрагмент, который является функциональным у мыши.

Согласно одному аспекту предусмотрен конструкт нуклеиновой кислоты, содержащий вышележащее гомологичное плечо и нижележащее гомологичное плечо, причем вышележащее гомологичное плечо содержит последовательность, которая идентична или по существу идентична последовательности вариабельной области тяжелой цепи иммуноглобулина человека, нижележащее гомологичное плечо содержит последовательность, которая идентична или по существу идентична последовательности вариабельной области иммуноглобулина человека или мыши, и между вышележащим и нижележащим гомологичными плечами расположена последовательность, которая содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую белок ADAM6 мыши. Согласно конкретному варианту осуществления последовательность, кодирующая ген ADAM6 мыши, функционально связана с промотором мыши, с которым ADAM6 мыши связан у мыши дикого типа.

Согласно одному аспекту предусмотрен клетка, выделенная из описанной в настоящем документе генетически модифицированной мыши. Согласно одному варианту осуществления клетка представляет собой лимфоцит. Согласно одному варианту осуществления лимфоцит представляет собой В-клетку. Согласно конкретному варианту осуществления В-клетка содержит эктопическую последовательность ADAM6 или ее ортолог или гомолог или последовательность, кодирующую ее функциональный фрагмент, причем В-клетка экспрессирует вариабельный домен тяжелой цепи, происходящий из генного сегмента VH человека.

Согласно одному аспекту предусмотрена клетка или ткань, причем клетка или ткань происходит из описанного в настоящем документе не относящегося к человеку животного и содержит ограниченный репертуар сегментов VH. Согласно одному варианту осуществления репертуар сегментов VH ограничивают до единственного представителя семейства сегментов VH и/или их полиморфных вариантов. Согласно конкретному варианту осуществления единственный сегмент VH представляет собой сегмент VH1-69 человека или сегмент VH1-2 человека. Согласно одному варианту осуществления клетку или ткань получают из селезенки, лимфатического узла или костного мозга не относящегося к человеку животного.

Согласно одному варианту осуществления клетка представляет собой ES клетку. Согласно одному варианту осуществления клетка представляет собой В-клетку. Согласно одному варианту осуществления клетка представляет собой зародышевую клетку.

Согласно одному варианту осуществления ткань выбирают из соединительной, мышечной, нервной и эпителиальной ткани. Согласно конкретному варианту осуществления ткань представляет собой репродуктивную ткань.

Согласно одному варианту осуществления клетку и/или ткань, полученные из описанной в настоящем документе мыши, выделяют для использования в одном или нескольких анализах ex vivo. Согласно различным вариантам осуществления один или несколько анализов ex vivo включают измерения физических, тепловых, электрических, механических или оптических свойств, хирургическую процедуру, измерения взаимодействий различных типов тканей, развитие техник визуализации или их комбинацию.

Согласно одному варианту осуществления не относящееся к человеку животное представляет собой мышь.

Согласно одному аспекту предусмотрен не относящийся к человеку эмбрион, содержащий ограниченные описанные в настоящем документе сегменты VH тяжелой цепи. Согласно одному варианту осуществления эмбрион содержит донорную ES клетку, которая содержит ограниченный сегмент VH, и эмбриональные клетки-хозяева.

Согласно одному варианту осуществления не относящееся к человеку животное представляет собой мышь.

Согласно одному аспекту предусмотрена не относящаяся к человеку клетка, содержащая хромосому или ее фрагмент описанного в настоящем документе не относящегося к человеку животного. Согласно одному варианту осуществления не относящаяся к человеку клетка содержит ядро описанного в настоящем документе не относящегося к человеку животного. Согласно одному варианту осуществления не относящаяся к человеку клетка содержит хромосому или ее фрагмент как результат ядерной передачи.

Согласно одному аспекту предусмотрено ядро, полученное из описанного в настоящем документе не относящегося к человеку животного. Согласно одному варианту осуществления ядро представляет собой ядро из диплоидной клетки, которая представляет собой не В-клетку.

Согласно одному аспекту предусмотрена плюрипотентная, индуцированная плюрипотентная или тотипотентная клетка, полученная из описанного в настоящем документе не относящегося к человеку животного. Согласно конкретному варианту осуществления клетка представляет собой эмбриональную стволовую (ES) клетку мыши.

Согласно одному аспекту предусмотрена не относящаяся к человеку клетка индуцированная плюрипотентная клетка, содержащая ограниченный репертуар сегментов VH. Согласно одному варианту осуществления индуцированную плюрипотентную клетку получают от описанного в настоящем документе не относящегося к человеку животного.

Согласно одному аспекту предусмотрена гибридома, содержащая последовательность лимфоцита описанной в настоящем документе мыши. Согласно одному варианту осуществления лимфоцит представляет собой В-клетку.

Согласно одному аспекту предусмотрена гибридома или квадрома, полученная из клетки описанного в настоящем документе не относящегося к человеку животного. Согласно одному варианту осуществления не относящееся к человеку животное представляет собой мышь или крысу.

Согласно одному аспекту предусмотрены клетки мыши и зародыши мыши, включая в себя без ограничения ES клетки, плюрипотентные клетки и индуцированные плюрипотентные клетки, которые содержат описанные в настоящем документе генетические модификации. Предусмотрены клетки, которые представляют собой XX, и клетки, которые представляют собой XY. Также предусмотрены клетки, которые содержат ядро, содержащее описанную в настоящем документе модификацию, например, модификацию, введенную в клетку путем пронуклеарной инъекции. Также предусмотрены клетки, зародыши и мыши, которые содержат введенный с помощью вируса ген ADAM6, например, клетки, зародыши и мыши, содержащие конструкт трансдукции, содержащий ген ADAM6, который является функциональным у мыши.

Согласно одному аспекту предусмотрена генетически модифицированная клетка мыши, причем клетка не способна экспрессировать тяжелую цепь, содержащую реаранжированные эндогенные генные сегменты тяжелой цепи иммуноглобулина, и клетка содержит функциональный ген ADAM6, который кодирует белок ADAM6 мыши или его функциональный фрагмент. Согласно одному варианту осуществления клетка дополнительно содержит вставку генных сегментов иммуноглобулина человека. Согласно конкретному варианту осуществления генные сегменты иммуноглобулина человека представляют собой генные сегменты тяжелой цепи, которые функционально связаны с константными областями тяжелой цепи мыши так, чтобы при реаранжировке кодировать функциональную тяжелую цепь антитела, которое содержит вариабельную область человека.

Согласно одному аспекту предусмотрена генетически модифицированная клетка мыши; причем клетка не содержит функциональный эндогенный локус ADAM6 мыши, и клетка содержит эктопическую нуклеотидную последовательность, которая кодирует белок ADAM6 мыши или его функциональный фрагмент. Согласно одному варианту осуществления клетка дополнительно содержит модификацию эндогенной последовательности вариабельного гена тяжелой цепи иммуноглобулина. Согласно конкретному варианту осуществления модификация эндогенной последовательности вариабельного гена тяжелой цепи иммуноглобулина предусматривает делецию, выбранную из делеции генного сегмента VH мыши, делеции генного сегмента DH мыши, делеции генного сегмента JH мыши и их комбинации. Согласно конкретному варианту осуществления мышь содержит замещение одной или нескольких последовательностей VH, DH, и/или JH иммуноглобулина мыши последовательностью иммуноглобулина человека. Согласно конкретному варианту осуществления последовательность иммуноглобулина человека выбрана из VH человека, VL человека, DH человека, JH человека, JL человека и их комбинации.

Согласно одному варианту осуществления клетка представляет собой тотипотентную клетку, плюрипотентную клетку или индуцированную плюрипотентную клетку. Согласно конкретному варианту осуществления клетка представляет собой ES клетку мыши.

Согласно одному аспекту предусмотрена В-клетка мыши, причем В-клетка мыши содержит реаранжированный ген тяжелой цепи иммуноглобулина, причем В-клетка содержит на хромосоме В-клетки последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую белок ADAM6 или его ортолог или гомолог или фрагмент, который является функциональным у самца мыши. Согласно одному варианту осуществления В-клетка мыши содержит два аллеля последовательности нуклеиновой кислоты.

Согласно одному варианту осуществления последовательность нуклеиновой кислоты находится на молекуле нуклеиновой кислоты (например, хромосоме В-клетки) которая является смежной с реаранжированным локусом тяжелой цепи иммуноглобулина мыши.

Согласно одному варианту осуществления последовательность нуклеиновой кислоты находится на молекуле нуклеиновой кислоты (например, хромосоме В-клетки), которая находится на расстоянии от молекулы нуклеиновой кислоты, которая содержит реаранжированный локус тяжелой цепи иммуноглобулина мыши.

Согласно одному варианту осуществления В-клетка мыши содержит реаранжированную не относящуюся к мыши последовательность вариабельного гена иммуноглобулина, функционально связанную с геном константной области иммуноглобулина мыши или человека, причем В-клетка содержит последовательность нуклеиновой кислоты, которая кодирует белок ADAM6 или его ортолог или гомолог или фрагмент, который является функциональным у самца мыши.

Согласно одному варианту осуществления последовательность нуклеиновой кислоты находится на молекуле нуклеиновой кислоты (например, хромосоме В-клетки), которая расположена на или в пределах ближайшего генного локуса по отношению к реаранжированной не относящейся к человеку последовательности вариабельного гена иммуноглобулина.

Согласно одному варианту осуществления последовательность нуклеиновой кислоты находится на молекуле нуклеиновой кислоты (например, на молекуле нуклеиновой кислоты), которая является смежной с реаранжированной не относящейся к человеку последовательностью вариабельной области иммуноглобулина.

Согласно одному аспекту предусмотрена соматическая клетка мыши, содержащая хромосому, которая содержит модифицированный локус тяжелой цепи иммуноглобулина и последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую ADAM6 мыши или его ортолог или гомолог или фрагмент, который является функциональным у самца мыши. Согласно одному варианту осуществления последовательность нуклеиновой кислоты находится на той же хромосоме, что и модифицированный локус тяжелой цепи иммуноглобулина. Согласно одному варианту осуществления нуклеиновая кислота находится на другой хромосоме, чем модифицированный локус тяжелой цепи иммуноглобулина. Согласно одному варианту осуществления соматическая клетка содержит одну копию последовательности нуклеиновой кислоты. Согласно одному варианту осуществления соматическая клетка содержит по меньшей мере две копии последовательности нуклеиновой кислоты. Согласно конкретному варианту осуществления соматическая клетка представляет собой В-клетку. Согласно конкретному варианту осуществления клетка представляет собой половую клетку. Согласно конкретному варианту осуществления клетка представляет собой стволовую клетку.

Согласно одному аспекту предусмотрена половая клетка мыши, содержащая последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую ADAM6 мыши (или его гомолог или ортолог или функциональный фрагмент) на хромосоме половой клетки, причем последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая ADAM6 мыши (или его гомолог или ортолог или функциональный фрагмент) находится в положении в хромосоме, которое отличается от положения в хромосоме половой клетки мыши дикого типа. Согласно одному варианту осуществления последовательность нуклеиновой кислоты находится на локусе иммуноглобулина мыши. Согласно одному варианту осуществления последовательность нуклеиновой кислоты находится на той же хромосоме половой клетки, что и локус иммуноглобулина мыши. Согласно одному варианту осуществления последовательность нуклеиновой кислоты находится на другой хромосоме половой клетки, чем локус иммуноглобулина мыши. Согласно одному варианту осуществления локус иммуноглобулина мыши содержит замещение по меньшей мере одной последовательности иммуноглобулина мыши по меньшей мере одной не относящейся к мыши последовательностью иммуноглобулина. Согласно конкретному варианту осуществления по меньшей мере одна не относящаяся к мыши последовательность иммуноглобулина представляет собой последовательность иммуноглобулина человека. Согласно одному варианту осуществления последовательность иммуноглобулин человека представляет собой последовательность тяжелой цепи иммуноглобулина.

Согласно одному аспекту предусмотрена последовательность вариабельного домена антитела, производимого в описанном в настоящем документе не относящемся к человеку животном.

Согласно одному аспекту предусмотрено терапевтическое средство для людей, содержащее вариабельный домен антитела, содержащий последовательность, происходящую от описанного в настоящем документе не относящегося к человеку животного.

Согласно одному аспекту предусмотрен способ получения последовательности вариабельной области антитела от не относящегося к человеку животного, причем последовательность вариабельной области антитела происходит из сегмента VH1-69 человека или сегмента VH1-2 человека, причем способ предусматривает (а) иммунизацию не относящегося к человеку животного с помощью представляющего интерес антигена, причем не относящееся к человеку животное содержит замещение на эндогенном локусе тяжелой цепи иммуноглобулина всех или по существу всех не относящихся к человеку вариабельных сегментов единственным вариабельным сегментом человека, причем единственный вариабельный сегмент человека представляет собой сегмент VH1-69 или сегмент VH1-2, и причем не относящееся к человеку животное по существу не способно образовывать последовательность вариабельной области тяжелой цепи иммуноглобулина, которая не является происходящей из сегмент VH1-69 человека или сегмента VH1-2 человека; (b) предоставление не относящемуся к человеку животному возможности развить иммунный ответ в отношении представляющего интерес антигена; и (с) идентификацию или выделение последовательности вариабельной области тяжелой цепи иммуноглобулина не относящегося к человеку животного, причем антитело связывает представляющий интерес антиген.

Согласно одному варианту осуществления единственный вариабельный сегмент человека представляет собой сегмент VH1-69.

Согласно одному варианту осуществления последовательность вариабельной области антитела происходит из SEQ ID NO: 37. Согласно одному варианту осуществления последовательность вариабельной области антитела по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95% или по меньшей мере на 98% идентична SEQ ID NO: 37. Согласно одному варианту осуществления последовательность вариабельной области антитела содержит SEQ ID NO: 37.

Согласно одному варианту осуществления единственный вариабельный сегмент человека представляет собой сегмент VH1-2.

Согласно одному варианту осуществления последовательность вариабельной области антитела происходит из SEQ ID NO: 63. Согласно одному варианту осуществления последовательность вариабельной области антитела по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95% или по меньшей мере на 98% идентична SEQ ID NO: 63. Согласно одному варианту осуществления последовательность вариабельной области антитела содержит SEQ ID NO: 63.

Согласно одному аспекту предусмотрен способ создания репертуара вариабельных областей антител человека у не относящегося к человеку животного, причем вариабельные области тяжелой цепи человека репертуара происходят из одного и того же представителя генного семейства VH и одного из множества сегментов DH и одного из множества сегментов JH, причем репертуар характеризуется наличием последовательностей тяжелой цепи иммуноглобулина FR1 (каркасной области 1), CDR1, FR2, CDR2 и FR3 из единственного представителя генного семейства VH. Согласно одному варианту осуществления репертуар дополнительно характеризуется наличием множества различных последовательностей CDR3+FR4.

Согласно одному варианту осуществления единственное генное семейство VH выбрано из семейства VH 1, 2, 3, 4, 5, 6 и 7. Согласно конкретному варианту осуществления единственное генное семейство VH представляет собой семейство VH 1. Согласно одному варианту осуществления единственный представитель генного семейства VH выбран из VH1-2, VH1-69, VH2-26, VH2-70 и VH3-23. Согласно конкретному варианту осуществления единственный представитель генного семейства VH представляет собой VH1-69.

Согласно одному варианту осуществления репертуар содержит последовательности FR1, CDR1, FR2, CDR2 и FR3 тяжелой цепи, происходящие из сегмента VH1-69. Согласно конкретному варианту осуществления репертуар содержит последовательности FR1, CDR1, FR2, CDR2 и FR3 тяжелой цепи, происходящие из SEQ ID NO: 38. Согласно конкретному варианту осуществления репертуар содержит последовательности FR1, CDR1, FR2, CDR2 и FR3 тяжелой цепи SEQ ID NO: 38.

Согласно одному варианту осуществления репертуар содержит последовательности FR1, CDR1, FR2, CDR2 и FR3 тяжелой цепи, происходящие из сегмента VH1-2. Согласно конкретному варианту осуществления репертуар содержит последовательности FR1, CDR1, FR2, CDR2 и FR3 тяжелой цепи, происходящие из SEQ ID NO: 64. Согласно конкретному варианту осуществления репертуар содержит последовательности FR1, CDR1, FR2, CDR2 и FR3 тяжелой цепи SEQ ID NO: 64.

Согласно одному аспекту предусмотрен способ получения множества различных последовательностей CDR3 и FR4 у не относящегося к человеку животного, предусматривающий воздействие на не относящееся к человеку животное, которое содержит локус вариабельного гена тяжелой цепи иммуноглобулина с репертуаром сегментов VH, ограниченных до единственного представителя семейства сегментов VH, представляющего интерес антигена, предоставление не относящемуся к человеку животному возможности развить иммунный ответ на антиген, причем иммунный ответ производит репертуар В-клеток, чьи вариабельные домены тяжелой цепи получены из единственного представителя семейства сегментов VH и содержат множество различных последовательностей CDR3 и FR4.

Согласно одному варианту осуществления единственного представителя семейства сегментов VH получают от человека. Согласно одному варианту осуществления не относящееся к человеку животное выбирают из мыши, крысы и кролика. Согласно одному варианту осуществления представляющий интерес антиген выбирают из лиганда, рецептора, внутриклеточного белка и секретируемого белка. Согласно одному варианту осуществления представляющий интерес антиген представляет собой патоген человека.

Согласно одному аспекту предусмотрена нуклеотидная последовательность, кодирующая вариабельную область иммуноглобулина, полученную от описанного в настоящем документе не относящегося к человеку животного.

Согласно одному аспекту предусмотрена аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи или легкой цепи иммуноглобулина, полученная от описанного в настоящем документе не относящегося к человеку животного.

Согласно одному аспекту предусмотрена нуклеотидная последовательность вариабельной области тяжелой цепи или легкой цепи иммуноглобулина, кодирующая вариабельную область антитела, полученного от описанного в настоящем документе не относящегося к человеку животного.

Согласно одному аспекту предусмотрено антитело или его антигенсвязывающий фрагмент (например, Fab, F(ab)2, scFv), полученный от описанного в настоящем документе не относящегося к человеку животного.

Согласно одному аспекту предусмотрен способ получения генетически модифицированного не относящегося к человеку животного, предусматривающий замещение одного или нескольких генных сегментов тяжелой цепи иммуноглобулина выше (относительно транскрипции генных сегментов тяжелой цепи иммуноглобулина) эндогенного локуса ADAM6 не относящегося к человеку животного одним или несколькими генными сегментами тяжелой цепи иммуноглобулина человека, и замещение одного или нескольких генных сегментов иммуноглобулина ниже (относительно транскрипции генных сегментов тяжелой цепи иммуноглобулина) локуса ADAM6 не относящегося к человеку животного одним или несколькими генными сегментами тяжелой цепи или легкой цепи иммуноглобулина человека. Согласно одному варианту осуществления один или несколько генных сегментов иммуноглобулина человека, замещающих один или несколько эндогенных генных сегментов иммуноглобулина выше эндогенного локуса ADAM6 не относящегося к человеку животного, включают в себя генные сегменты V. Согласно одному варианту осуществления генные сегменты иммуноглобулина человека, замещающие один или несколько эндогенных генных сегментов иммуноглобулина выше эндогенного локуса ADAM6 не относящегося к человеку животного, включают в себя генные сегменты V и D. Согласно одному варианту осуществления один или несколько генных сегментов иммуноглобулина человека, замещающих один или несколько эндогенных генных сегментов иммуноглобулина ниже эндогенного локуса ADAM6 не относящегося к человеку животного, включают в себя генные сегменты J. Согласно одному варианту осуществления один или несколько генных сегментов иммуноглобулина человека, замещающие один или несколько эндогенных генных сегментов иммуноглобулина ниже эндогенного локуса ADAM6 не относящегося к человеку животного, включают в себя генные сегменты D и J. Согласно одному варианту осуществления один или несколько генных сегментов иммуноглобулина человека, замещающие один или несколько эндогенных генных сегментов иммуноглобулина ниже эндогенного локуса ADAM6 не относящегося к человеку животного, включают в себя генные сегменты V, D и J. Согласно конкретному варианту осуществления один или несколько генных сегментов, замещающих один или несколько эндогенных генных сегментов иммуноглобулина ниже эндогенного локуса ADAM6 не относящегося к человеку животного, включает в себя единственный генный сегмент V, один или несколько генных сегментов D и один или несколько генных сегментов J.

Согласно одному варианту осуществления один или несколько генных сегментов тяжелой цепи иммуноглобулина выше и/или ниже гена ADAM6 замещают в плюрипотентной, индуцированной плюрипотентной или тотипотентной клетке для получения генетически модифицированной клетки-предшественника; генетически модифицированную клетку-предшественник вводят хозяину; и хозяина, содержащего генетически модифицированную клетку-предшественник, вынашивают для получения мыши, содержащей геном, полученный из генетически модифицированной клетки-предшественника. Согласно одному варианту осуществления хозяин представляет собой зародыш. Согласно конкретному варианту осуществления хозяин выбран из пре-морулы мыши (например, 8- или 4-клеточная стадия), тетраплоидного зародыша, агрегата эмбриональных клеток или бластоцисты.

Согласно одному аспекту предусмотрено не относящееся к человеку животное, причем не относящееся к человеку животное содержит репертуар В-клеток, который экспрессирует вариабельные домены тяжелой цепи иммуноглобулина, полученные из единственного представителя семейства сегментов V. Согласно одному варианту осуществления по меньшей мере 10%, по меньшей мере 20%, по меньшей мере 30%, по меньшей мере 40%, по меньшей мере 50%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 90% или по меньшей мере 95% репертуара В-клеток вариабельного домена тяжелой цепи не относящегося к человеку иммуноглобулина, экспрессированного в репертуаре В-клеток, происходит от того же представителя семейства сегментов V. Согласно конкретному варианту осуществления процент составляет по меньшей мере 90%. Согласно одному варианту осуществления репертуар В-клеток состоит преимущественно из периферических В-клеток (крови). Согласно одному варианту осуществления репертуар В-клеток состоит преимущественно из В-клеток селезенки. Согласно одному варианту осуществления репертуар В-клеток состоит преимущественно из В-клеток костного мозга. Согласно одному варианту осуществления репертуар В-клеток состоит преимущественно из периферических В-клеток, В-клеток селезенки и В-клеток костного мозга.

Согласно одному аспекту предусмотрено генетически модифицированное не относящееся к человеку животное, причем более 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% или более 90% В-клеток не относящегося к человеку животного, которые экспрессируют вариабельный домен тяжелый цепи иммуноглобулина, экспрессируют вариабельный домен тяжелый цепи иммуноглобулина, происходящий из единственного представителя семейства генных сегментов VH. Согласно одному варианту осуществления по меньшей мере 75% В-клеток не относящегося к человеку животного, которые экспрессируют вариабельный домен тяжелый цепи иммуноглобулина, экспрессируют вариабельный домен тяжелый цепи иммуноглобулина, происходящий из единственного представителя семейства генных сегментов VH. Согласно конкретному варианту осуществления процент составляет по меньшей мере 90%. Согласно одному варианту осуществления все В-клетки, которые экспрессируют домен тяжелой цепи, который происходит из единственного представителя семейства гена VH.

Согласно одному аспекту предусмотрена генетически модифицированная мышь, которая производит антигенспецифическую популяцию В-клеток в ответ на иммунизацию представляющим интерес антигеном, причем по меньшей мере 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% или более 90% указанной антигенспецифической популяции В-клеток экспрессирует тяжелые цепи иммуноглобулина, все из которых получены из того же генного сегмента VH- Согласно одному варианту осуществления по меньшей мере 75% антигенспецифической популяции В-клеток экспрессирует тяжелые цепи иммуноглобулина, происходящие из того же генного сегмента VH. Согласно одному варианту осуществления все антигенспецифические В-клетки экспрессируют тяжелые цепи иммуноглобулина, происходящие из того же генного сегмента VH.

Согласно одному аспекту предусмотрено не относящееся к человеку животное, содержащее ограниченный репертуар генных сегментов VH, причем ограничение относится к генному сегменту VH1-69 человека или генному сегменту VH1-69, который по меньшей мере приблизительно на 75,5%, 76,5%, 86,7%, 87,8%, 94,9%, 96,9%, 98% или 99% идентичен генному сегменту VH1-69*01. Согласно конкретному варианту осуществления ограниченный репертуар выбран из одного или нескольких вариантов VH1-69 фиг. 7.

Согласно одному аспекту предусмотрено не относящееся к человеку животное, содержащее ограниченный репертуар генных сегментов VH, причем ограничение относится к генному сегменту VH1-2 человека или генному сегменту VH1-2, который по меньшей мере приблизительно на 94,9%, 95,9%, 96,9%, 98% или 99% идентичен генному сегменту VH1-2. Согласно конкретному варианту осуществления ограниченный репертуар выбран из одного или нескольких вариантов VH1-2 фиг. 10.

Согласно одному варианту осуществления не относящееся к человеку животное представляет собой мышь.

Согласно одному аспекту предусмотрено не относящееся к человеку животное, содержащее ограниченный репертуар сегментов VH человека, дополнительно содержащее гуманизированный локус вариабельного сегмента легкой цепи иммуноглобулина, причем соотношение легких цепей κ:λ, экспрессируемых у мыши, является приблизительно таким же, как у мыши дикого типа.

Согласно одному аспекту предусмотрено не относящееся к человеку животное, содержащее ограниченный локус тяжелой цепи иммуноглобулина, характеризующийся присутствием единственного генного сегмента VH, одного или нескольких генных сегментов DH и одного или нескольких генных сегментов JH, причем единственный генный сегмент VH представляет собой полиморфный генный сегмент VH.

Согласно одному варианту осуществления полиморфный генный сегмент VH представляет собой генный сегмент VH человека, который связан с большим числом копий в популяциях человека. Согласно одному варианту осуществления генный сегмент VH человека выбран из VH1-2, VH1-69, VH2-26, VH2-70, VH3-23 или их полиморфного варианта. Согласно конкретному варианту осуществления генный сегмент VH человека представляет собой генный сегмент VH1-69. Согласно другому конкретному варианту осуществления генный сегмент VH человека представляет собой генный сегмент VH1-2.

Согласно одному варианту осуществления единственный генный сегмент VH функционально связан с геном константной области иммуноглобулина человека, мыши или химерным относящимся к человеку/мыши геном константной области иммуноглобулина. Согласно конкретному варианту осуществления ген константной области иммуноглобулина представляет собой ген константной области мыши. Согласно одному варианту осуществления константный ген иммуноглобулина содержит последовательность человека, выбранную из CH1 человека, шарнира человека, CH2 человека, CH3 человека и их комбинации Согласно одному варианту осуществления константный ген мыши находится в эндогенном локусе тяжелой цепи иммуноглобулина.

Согласно одному варианту осуществления не относящееся к человеку животное дополнительно содержит генный сегмент VL иммуноглобулина человека, функционально связанный с генным сегментом J и константным геном легкой цепи. Согласно конкретному варианту осуществления генный сегмент VL и/или генный сегмент J выбраны из генного сегмента κ человека и генного сегмента λ человека. Согласно одному варианту осуществления генные сегменты VL и/или J представляют собой генные сегменты κ человека.

Согласно различным вариантам осуществления не относящееся к человеку животное содержит делецию всех или по существу всех эндогенных генных сегментов VH.

Согласно различным вариантам осуществления не относящееся к человеку животное содержит инактивированный эндогенный локус вариабельного гена тяжелой цепи. Согласно различным вариантам осуществления инактивированный эндогенный локус вариабельного гена тяжелой цепи не функционально связан с эндогенным геном константной области тяжелой цепи.

Согласно одному аспекту предусмотрено не относящееся к человеку животное, причем не относящееся к человеку животное характеризуется экспрессией сывороточного иммуноглобулина, причем более 80% сывороточного иммуноглобулина содержит вариабельный домен тяжелой цепи человека и когнатный вариабельный домен легкой цепи человека, причем вариабельный домен тяжелой цепи человека происходит из репертуара генных сегментов VH, состоящего преимущественно из единственного генного сегмента VH человека и/или его полиморфных вариантов.

Согласно одному варианту осуществления единственный генный сегмент VH человека представляет собой генный сегмент VH1-69 человека и/или его полиморфные варианты. Согласно одному варианту осуществления единственный генный сегмент VH человека представляет собой генный сегмент VH1-2 человека и/или его полиморфные варианты.

Согласно одному аспекту предусмотрено не относящееся к человеку животное, содержащее в своей зародышевой линии замещение на эндогенном локусе тяжелой цепи иммуноглобулина всех или по существу всех эндогенных генных сегментов VH единственным генным сегментом VH человека и/или его полиморфными вариантами.

Согласно одному варианту осуществления не относящееся к человеку животное дополнительно содержит замещение на эндогенном локусе легкой цепи иммуноглобулина всех или по существу всех эндогенных генных сегментов VL одним или несколькими генными сегментами VL человека. Согласно конкретному варианту осуществления мышь дополнительно содержит один или несколько генных сегментов JL человека, функционально связанных с генными сегментами VL человека.

Согласно одному аспекту предусмотрено не относящееся к человеку животное, которое экспрессирует антитело, которое содержит по меньшей мере один полипептид относящегося к человеку вариабельного домена/не относящегося к человеку константного домена иммуноглобулина, причем не относящееся к человеку животное экспрессирует не относящийся к человеку белок ADAM6 или его ортолог или гомолог из эндогенного локуса тяжелой цепи иммуноглобулина. Согласно одному варианту осуществления эндогенный локус тяжелой цепи иммуноглобулина является неспособным к реаранжировке для кодирования функциональной тяжелой цепи антитела.

Согласно одному аспекту предусмотрено не относящееся к человеку животное, которое экспрессирует антитело, которое содержит по меньшей мере один полипептид относящегося к человеку вариабельного домена/не относящегося к человеку константного домена иммуноглобулина, причем не относящееся к человеку животное экспрессирует не относящийся к человеку белок ADAM6 или его ортолог или гомолог из локуса, отличного от локуса иммуноглобулина.

Согласно одному варианту осуществления белок ADAM6 или его ортолог или гомолог экспрессируется в В-клетке не относящегося к человеку животного, причем В-клетка содержит реаранжированную последовательность иммуноглобулина, которая содержит вариабельную последовательность человека и не относящуюся к человеку константную последовательность.

Согласно одному варианту осуществления не относящаяся к человеку константная последовательность представляет собой последовательность грызуна. Согласно одному варианту осуществления грызун выбран из мыши, крысы и хомяка.

Согласно одному аспекту предусмотрен способ получения стерильного самца не относящегося к человеку животного, предусматривающий приведение эндогенного аллеля ADAM6 донорной ES клетки в нефункциональное состояние (или нокаут указанного аллеля), введение донорной ES клетки в зародыш-хозяин, вынашивание зародыша-хозяина в суррогатной матери и предоставление возможности суррогатной матери родить потомство, происходящее полностью или частично из донорной ES клетки. Согласно одному варианту осуществления способ дополнительно предусматривает скрещивание потомства для получения стерильного самца не относящегося к человеку животного.

Согласно одному аспекту предусмотрен способ получения не относящееся к человеку животное с представляющей интерес генетической модификацией, причем не относящееся к человеку животное является стерильным, причем способ предусматривает стадии (а) осуществления представляющей интерес генетической модификации в геноме; (b) модификации генома для нокаута эндогенного аллеля ADAM6 или приведения эндогенного аллеля ADAM6 в нефункциональное состояние; и (с) использования генома в получении не относящегося к человеку животного. Согласно различным вариантам осуществления геном происходит из ES клетки или используется в экспериментах ядерной передачи.

Согласно одному аспекту предусмотрено не относящееся к человеку животное, полученное с использованием нацеливающего вектора, нуклеотидного конструкта или клетки, описанных в настоящем документе.

Согласно одному аспекту предусмотрено потомство от скрещивания описанного в настоящем документе не относящегося к человеку животного со вторым не относящимся к человеку животным, которые представляет собой не относящееся к человеку животное дикого типа или генетически модифицированное не относящееся к человеку животное.

Согласно одному аспекту предусмотрен способ поддержания линии не относящегося к человеку животного, причем линия не относящегося к человеку животного содержит замещение не относящейся к человеку последовательности тяжелой цепи иммуноглобулина одной или несколькими гетерологичными последовательностями тяжелой цепи иммуноглобулина. Согласно одному варианту осуществления одна или несколько гетерологичных последовательностей тяжелой цепи иммуноглобулина представляют собой последовательности тяжелой цепи иммуноглобулина человека.

Согласно одному варианту осуществления линия не относящегося к человеку животного содержит делецию одного или нескольких не относящихся к человеку генных сегментов VH, DH и/или JH. Согласно одному варианту осуществления не относящееся к человеку животное дополнительно содержит единственный генный сегмент VH человека, один или несколько генных сегментов DH человека и/или один или несколько генных сегментов JH человека. Согласно одному варианту осуществления не относящееся к человеку животное содержит единственный сегмент VH человека, по меньшей мере 27 генных сегментов DH человека и по меньшей мере шесть генных сегментов JH. Согласно конкретному варианту осуществления не относящееся к человеку животное содержит единственный сегмент VH человека, 27 генных сегментов DH человека и шесть генных сегментов JH человека, причем указанный единственный генный сегмент VH человека, 27 генных сегментов DH человека и шесть генных сегментов JH человека функционально связаны с геном константной области. Согласно одному варианту осуществления ген константной области представляет собой не относящийся к человеку ген константной области. Согласно одному варианту осуществления ген константной области содержит последовательность гена константной области мыши или крысы, выбранную из CH1, шарнира, CH2, CH3 и/или CH4 или их комбинации. Согласно различным вариантам осуществления единственный генный сегмент VH человека представляет собой генный сегмент VH1-69 человека или генный сегмент VH1-2 человека.

Согласно одному варианту осуществления способ предусматривает получение самца не относящегося к человеку животного, гетерозиготного в отношении замещения не относящейся к человеку последовательности тяжелой цепи иммуноглобулина, и скрещивание гетерозиготного самца не относящегося к человеку животного с самкой не относящегося к человеку животного дикого типа или самкой не относящегося к человеку животного, которая является гомозиготной или гетерозиготной в отношении последовательности тяжелой цепи человека. Согласно одному варианту осуществления способ предусматривает поддержание линии не относящегося к человеку животного путем повторного скрещивания гетерозиготных самцов с самками, которые являются самками дикого типа или гомозиготными или гетерозиготными в отношении последовательности тяжелой цепи человека.

Согласно одному варианту осуществления способ предусматривает получение клеток от самцов или самок не относящихся к человеку животных, гомозиготных или гетерозиготных в отношении последовательности тяжелой цепи человека, и использование указанных клеток в качестве донорных клеток или ядер из них в качестве донорных ядер, и применение клеток или ядер для получения генетически модифицированных не относящихся к человеку животных с использованием клеток-хозяев и/или вынашивание клеток и/или ядер в суррогатных матерях.

Согласно одному варианту осуществления только самцов не относящихся к человеку животных, которые являются гетерозиготными в отношении замещения на локусе тяжелой цепи, скрещивают с самками не относящихся к человеку животных. Согласно конкретному варианту осуществления самки не относящихся к человеку животных являются гомозиготными, гетерозиготными или самками дикого типа в отношении замещенного локуса тяжелой цепи.

Согласно одному варианту осуществления не относящиеся к человеку животные дополнительно содержат замещение вариабельных последовательностей λ и/или κ легкой цепи на эндогенном локусе легкой цепи иммуноглобулина гетерологичными последовательностями легкой цепи иммуноглобулина. Согласно одному варианту осуществления гетерологичные последовательности легкой цепи иммуноглобулина представляют собой вариабельные последовательности λ и/или κ легкой цепи иммуноглобулина человека.

Согласно одному варианту осуществления не относящееся к человеку животное дополнительно содержит трансген на локусе, отличном от эндогенного локуса иммуноглобулина, причем трансген содержит последовательность, кодирующую реаранжированную или нереаранжированную гетерологичную последовательность λ или κ легкой цепи (например, нереаранжированную VL и нереаранжированную JL или реаранжированную VLJL), функционально связанную (для нереаранжированной) или слитую (для реаранжированной) с последовательностью константной области легкой цепи иммуноглобулина. Согласно одному варианту осуществления гетерологичная последовательность λ или κ легкой цепи относится к человеку. Согласно одному варианту осуществления последовательность константной области выбрана из грызуна, человека и не относящегося к человеку примата. Согласно одному варианту осуществления последовательность константной области выбрана из мыши, крысы и хомяка. Согласно одному варианту осуществления трансген содержит не относящийся к иммуноглобулину промотор, который управляет экспрессией последовательностей легкой цепи. Согласно конкретному варианту осуществления промотор представляет собой транскрипционально активный промотор. Согласно конкретному варианту осуществления промотор представляет собой промотор ROSA26.

Согласно одному аспекту предусмотрен способ получения генетически модифицированного не относящегося к человеку животного, предусматривающий вставку не относящейся к человеку нуклеотидной последовательности, которая содержит не относящийся к человеку генный сегмент иммуноглобулина в геноме животного, для первой модификации, причем вставка сохраняет эндогенный ген ADAM6, затем приведение эндогенного локуса тяжелой цепи иммуноглобулина не относящегося к человеку животного в нефункциональное состояние для второй модификации. Согласно одному варианту осуществления первую модификацию проводят выше эндогенного гена константной области тяжелой цепи иммуноглобулина и вторую модификацию проводят, чтобы инвертировать, транслоцировать или вывести из функциональной связи эндогенный локус тяжелой цепи иммуноглобулина так, чтобы эндогенный локус тяжелой цепи иммуноглобулина являлся неспособным к реаранжировке для кодирования функциональной вариабельной области тяжелой цепи.

Согласно одному аспекту предусмотрен способ получения генетически модифицированного не относящегося к человеку животного, предусматривающий замещение не относящейся к человеку нуклеотидной последовательности, которая содержит не относящийся к человеку генный сегмент иммуноглобулина и не относящуюся к человеку нуклеотидную последовательность ADAM6 (или ее ортолог или гомолог или фрагмент, функциональный у самца не относящегося к человеку животного) последовательностью, содержащей генный сегмент иммуноглобулина человека для образования первого химерного локуса, затем вставку последовательности, содержащей не относящуюся к человеку кодирующую ADAM6 последовательность (или последовательность, кодирующий ее ортолог или гомолог или функциональный фрагмент) в последовательность, содержащую генный сегмент иммуноглобулина человека для образования второго химерного локуса.

Согласно одному варианту осуществления второй химерный локус содержит вариабельный генный сегмент тяжелой цепи (VH) иммуноглобулина человека. Согласно одному варианту осуществления второй химерный локус содержит вариабельный генный сегмент легкой цепи (VL) иммуноглобулина человека. Согласно конкретному варианту осуществления второй химерный локус содержит генный сегмент VH человека или генный сегмент VL человека, функционально связанный с генным сегментом DH человека и генным сегментом JH человека. Согласно дополнительному конкретному варианту осуществления второй химерный локус функционально связан с третьим химерным локусом, который содержит последовательность CH1 человека или CH1 человека и шарнирную последовательность человека, слитые с последовательностью CH2+CH3 мыши.

Согласно одному аспекту предусмотрено применение мыши, которая содержит эктопическую нуклеотидную последовательность, содержащую локус или последовательность ADAM6 мыши, для получения фертильного самца мыши, причем применение предусматривает спаривание мыши, содержащей эктопическую нуклеотидную последовательность, которая содержит локус или последовательность ADAM6 мыши, с мышью, которая не содержит функциональный эндогенный локус или последовательность ADAM6 мыши, и получение потомства, которое представляет собой самку, способную производить потомство, содержащее эктопический локус или последовательность ADAM6, или которое представляет собой самца, который содержит эктопический локус или последовательность ADAM6, и самец проявляет фертильность, которая является приблизительно такой же, как и фертильность, проявляемая самцом мыши дикого типа.

Согласно одному аспекту предусмотрено применение описанной в настоящем документе мыши для получения нуклеотидной последовательности вариабельной области иммуноглобулина.

Согласно одному аспекту предусмотрено применение описанной в настоящем документе мыши для получения полностью человеческого Fab или полностью человеческого F(ab)2.

Согласно одному аспекту предусмотрено применение описанной в настоящем документе мыши для получения иммортализованной клеточной линии.

Согласно одному аспекту предусмотрено применение описанной в настоящем документе мыши для получения гибридомы или квадромы.

Согласно одному аспекту предусмотрено применение описанной в настоящем документе мыши для получения фаговой библиотеки, содержащей вариабельные области тяжелой цепи человека и вариабельные области легкой цепи человека.

Согласно одному варианту осуществления вариабельные области тяжелой цепи человека происходят из генного сегмента VH1-69 человека, который содержит последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 57 и SEQ ID NO: 59.

Согласно одному варианту осуществления вариабельные области тяжелой цепи человека происходят из генного сегмента VH1-69 человека, который содержит последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 60 и SEQ ID NO: 62.

Согласно одному варианту осуществления все вариабельные области тяжелой цепи человека происходят из генного сегмента VH1-2 человека, который содержит последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 69 и SEQ ID NO: 71.

Согласно одному варианту осуществления вариабельные области тяжелой цепи человека происходят из генного сегмента VH1-2 человека, который содержит последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 70 и SEQ ID NO: 72.

Согласно одному аспекту предусмотрено применение описанной в настоящем документе мыши для создания последовательности вариабельной области для получения антитела человека, предусматривающее (а) иммунизацию описанной в настоящем документе мыши представляющим интерес антигеном, (b) выделение лимфоцита из иммунизированной мыши согласно (а), (с) воздействие на лимфоцит одного или нескольких меченых антител, (d) идентификацию лимфоцита, который способен связываться с представляющим интерес антигеном, и (е) амплификацию одной или нескольких последовательностей нуклеиновой кислоты вариабельной области из лимфоцита, тем самым создавая последовательность вариабельной области.

Согласно одному варианту осуществления лимфоцит получен из селезенки мыши. Согласно одному варианту осуществления лимфоцит получен из лимфатического узла мыши. Согласно одному варианту осуществления лимфоцит получен из костного мозга мыши.

Согласно одному варианту осуществления меченое антитело представляет собой конъюгированное с флуорофором антитело. Согласно одному варианту осуществления одно или несколько конъюгированных с флуорофором антител выбраны из IgM, IgG и/или их комбинации.

Согласно одному варианту осуществления лимфоцит представляет собой В-клетку.

Согласно одному варианту осуществления один или несколько последовательность вариабельной области нуклеиновой кислоты содержит последовательность вариабельной области тяжелой цепи. Согласно одному варианту осуществления одна или несколько последовательностей нуклеиновой кислоты вариабельной области содержат последовательность вариабельной области легкой цепи. Согласно конкретному варианту осуществления последовательность вариабельной области легкой цепи представляет собой последовательность вариабельной области κ легкой цепи иммуноглобулина. Согласно одному варианту осуществления один или несколько последовательностей нуклеиновой кислоты вариабельной области содержит последовательность вариабельной области тяжелой цепи и κ легкой цепи.

Согласно одному варианту осуществления предусмотрено применение описанной в настоящем документе мыши для создания последовательности вариабельной области тяжелой и κ легкой цепи для получения антитела человека, предусматривающее (а) иммунизацию описанной в настоящем документе мыши представляющим интерес антигеном, (b) выделение селезенки из иммунизированной мыши согласно (а), (с) воздействие на В-лимфоциты из селезенки одного или нескольких меченых антител, (d) идентификацию В-лимфоцита согласно (с), который способен связываться с представляющим интерес антигеном, и (е) амплификацию последовательности нуклеиновой кислоты вариабельной области тяжелой цепи и последовательности нуклеиновой кислоты вариабельной области легкой цепи из В-лимфоцита, тем самым создавая последовательности вариабельной области тяжелой цепи и κ легкой цепи.

Согласно одному варианту осуществления предусмотрено применение описанной в настоящем документе мыши для создания последовательности вариабельной области тяжелая и κ легкой цепи для получения антитела человека, предусматривающее (а) иммунизацию описанной в настоящем документе мыши представляющим интерес антигеном, (b) выделение одного или нескольких лимфатических узлов из иммунизированной мыши согласно (а), (с) воздействие на В-лимфоциты из одного или нескольких лимфатических узлов одного или нескольких меченых антител, (d) идентификацию В-лимфоцита согласно (с), который способен связываться с представляющим интерес антигеном, и (е) амплификацию последовательности нуклеиновой кислоты вариабельной области тяжелой цепи и последовательности нуклеиновой кислоты вариабельной области κ легкой цепи из В-лимфоцита, тем самым создавая последовательности вариабельной области тяжелой цепи и κ легкой цепи.

Согласно одному варианту осуществления предусмотрено применение описанной в настоящем документе мыши для создания последовательности вариабельной области тяжелой и κ легкой цепи для получения антитела человека, предусматривающее (а) иммунизацию описанной в настоящем документе мыши представляющим интерес антигеном, (b) выделение костного мозга из иммунизированной мыши согласно (а), (с) воздействие на В-лимфоциты из костного мозга одного или нескольких меченых антител, (d) идентификацию В-лимфоцита согласно (с), который способен связываться с представляющим интерес антигеном, и (е) амплификацию последовательности нуклеиновой кислоты вариабельной области тяжелой цепи и последовательности нуклеиновой кислоты вариабельной области κ легкой цепи из В-лимфоцита, тем самым создавая последовательности вариабельной области тяжелой цепи и κ легкой цепи. Согласно различным вариантам осуществления одно или несколько меченых антител выбраны из IgM, IgG и/или их комбинации

Согласно различным вариантам осуществления представляющий интерес антиген представляет собой патоген, который поражает субъектов-людей, включая в себя, например, вирусный антиген. Иллюстративные вирусные патогены включают в себя, например, главным образом вирусные патогены из семейств Adenoviridae, bacteria Picornaviridae, Herpesviridae, Hepadnaviridae, Flaviviridae, Retroviridae, Orthomyxoviridae, Paramyxoviridae, Papovaviridae, Polyomavirus, Rhabdoviridae и Togaviridae. Такие иллюстративные вирусы, как правило, характеризуются длиной в диапазоне 20-300 нм. Согласно различным вариантам осуществления представляющий интерес антиген представляет собой вирусный антиген, выбранный из вируса гепатита (например, ВГС, ВГВ и т.д.), вируса иммунодефицита человека (ВИЧ) или вируса гриппа.

Согласно различным вариантам осуществления предусмотрено применение описанной в настоящем документе мыши для создания последовательности вариабельной области тяжелой и κ легкой цепи для получения антитела человека, дополнительно предусматривающее слияние амплифицированных последовательностей вариабельной области тяжелой и легкой цепи с последовательностями константной области тяжелой и легкой цепи человека, экспрессию слитых последовательностей тяжелой и легкой цепи в клетке и выделение экспрессированных последовательностей тяжелой и легкой цепи, тем самым создавая антитело человека.

Согласно различным вариантам осуществления константные области тяжелой цепи человека выбраны из IgM, IgD, IgA, IgE и IgG. Согласно различным конкретным вариантам осуществления IgG выбран из IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4. Согласно различным вариантам осуществления константная область тяжелой цепи человека содержит CH1, шарнир, CH2, CH3, CH4 или их комбинацию. Согласно различным вариантам осуществления константная область легкой цепи представляет собой к константную область иммуноглобулина. Согласно различным вариантам осуществления клетка выбрана из клетки HeLa, клетки DU145, клетки Lncap, клетки MCF-7, клетки MDA-МВ-438, клетки РС3, клетки T47D, клетки ТНР-1, клетки U87, клетки SHSY5Y (нейробластома человека), клетки Saos-2, клетки Vero, клетки СНО, клетки GH3, клетки PC12, ретинальной клетки человека (например, клетки PER.C6™) и клетки МС3Т3. Согласно конкретному варианту осуществления клетка представляет собой клетку СНО.

Согласно одному аспекту предусмотрен способ создания обратного химерного относящегося к грызуну/человеку антитела, специфического к представляющему интерес антигену, предусматривающий стадии иммунизации описанной в настоящем документе мыши антигеном, выделение по меньшей мере одной клетки из мыши, производящей обратное химерное относящееся к мыши/относящееся к человеку антитело, специфическое к антигену, культивирование по меньшей мере одной клетки, производящей обратное химерное относящееся в мыши/относящееся к человеку антитело, специфическое к антигену, и получение указанного антитела.

Согласно одному варианту осуществления обратное химерное относящееся в мыши/человеку антитело содержит вариабельный домен тяжелой цепи человека, слитый с константным геном тяжелой цепи мыши или крысы, и вариабельный домен легкой цепи человека, слитый с константным геном легкой цепи мыши или крысы или человека. Согласно конкретному варианту осуществления вариабельный домен тяжелой цепи человека содержит реаранжированный генный сегмент VH1-69 человека или генный сегмент VH1-2 человека.

Согласно одному варианту осуществления культивирование по меньшей мере одной клетки, производящей обратное химерное относящееся к грызуну/относящееся к человеку антитело, специфическое к антигену, проводят по меньшей мере на одной гибридомной клетке, созданной по меньшей мере из одной клетки, выделенной из мыши.

Согласно одному аспекту предусмотрен способ создания полностью человеческого антитела, специфического к представляющему интерес антигену, предусматривающий стадии иммунизации описанной в настоящем документе мыши антигеном, выделение по меньшей мере одной клетки из мыши, производящей обратное химерное относящееся к грызуну/относящееся к человеку антитело, специфическое к антигену, создание по меньшей мере одной клетки, производящей полностью человеческое антитело, полученное из обратного химерного относящегося к грызуну/относящегося к человеку антитела, специфического к антигену, и культивирование по меньшей мере одной клетки, производящей полностью человеческое антитело, и получение указанного полностью человеческого антитела.

Согласно различным вариантам осуществления по меньшей мере одна клетка, выделенная из мыши, производящей обратное химерное относящееся к грызуну/относящееся к человеку антитело, специфическое к антигену, представляет собой спленоцит или В-клетку.

Согласно различным вариантам осуществления антитело представляет собой моноклональное антитело.

Согласно различным вариантам осуществления антитело содержит вариабельный домен тяжелой цепи, который содержит реаранжированный генный сегмент VH1-69 человека или генный сегмент VH1-2 человека.

Согласно различным вариантам осуществления иммунизацию представляющим интерес антигеном проводят с помощью белка, ДНК, комбинации ДНК и белка или экспрессирующих антиген клеток.

Согласно одному аспекту предусмотрено применение описанной в настоящем документе мыши для получения последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей вариабельную область иммуноглобулина или ее фрагмент. Согласно одному варианту осуществления последовательность нуклеиновой кислоты применяют для получения антитела человека или его антигенсвязывающего фрагмента. Согласно одному варианту осуществления мышь применяют для получения антигенсвязывающего белка, выбранного из антитела, мультиспецифического антитела (например, биспецифического антитела), scFv, биспецифического scFv, диатела, триатела, тетратела, V-NAR, VHH, VL, F(ab), F(ab)2, DVD (т.е. антигенсвязывающего белка с двойным вариабельным доменом), SVD (т.е. антигенсвязывающего белка с одним вариабельным доменом) или биспецифического проводника Т-клеток (BiTE).

Согласно одному аспекту предусмотрен способ получения антигенсвязывающего белка человека, предусматривающий воздействие на описанное в настоящем документе животное генетически сконструированное не относящееся к человеку, представляющего интерес антигена, предоставление не относящемуся к человеку животному возможности развить иммунный ответ на антиген, получение от не относящегося к человеку животного последовательности нуклеиновой кислоты вариабельного домена тяжелой цепи, кодирующей вариабельный домен тяжелой цепи человека, который специфически связывает представляющий интерес антиген, слияние последовательности нуклеиновой кислоты вариабельного домена тяжелой цепи с последовательностью константной области человека и экспрессию в клетке млекопитающего антитела, содержащего последовательность вариабельного домена тяжелой цепи человека и последовательность константной области человека. Согласно одному варианту осуществления клетка млекопитающего представляет собой клетку СНО. Согласно одному варианту осуществления не относящееся к человеку животное содержит репертуар генных сегментов VH человека, который состоит по существу из единственного генного сегмента VH человека, необязательно присутствующего в двух или больше его полиморфных вариантах, функционально связанных с одним или несколькими сегментами D и/или J человека. Согласно одному варианту осуществления репертуар генных сегментов VH человека находится на эндогенном не относящемся к человеку локусе генного сегмента VH. Согласно одному варианту осуществления репертуар генных сегментов VH человека находится на локусе, который не является эндогенным локусом генного сегмента VH. Согласно одному варианту осуществления генный сегмент VH человека реаранжируется с сегментом D человека и сегментом J человека для образования реаранжированного гена VDJ человека, функционально связанного с последовательностью константной области, причем последовательность константной области выбрана из последовательности человека и последовательности грызуна (например, последовательности мыши или крысы или хомяка). Согласно одному варианту осуществления последовательность константной области содержит последовательность, выбранную из CH1, шарнира, CH2, CH3 и их комбинации; согласно конкретному варианту осуществления последовательность константной области содержит CH1, шарнир, CH2 и CH3. Согласно одному варианту осуществления вариабельный домен человека и константная последовательность экспрессируют в клетке млекопитающего с когнатным вариабельным доменом легкой цепи человека, полученным от той же мыши (например, последовательность, полученная из той же В-клетки, что и последовательность вариабельного домена человека); согласно одному варианту осуществления последовательность, кодирующая вариабельный домен легкой цепи человека, полученную от мыши, затем сливают с последовательностью, кодирующей константную последовательность легкой цепи человека, и последовательность легкой цепи и последовательность тяжелой цепи экспрессируют в клетке млекопитающего.

Согласно одному аспекту предусмотрен способ получения вариабельного домена тяжелой цепи антитела, который связывает представляющий интерес антиген, предусматривающий экспрессию в одной клетке (а) первой последовательности VH описанного в настоящем документе иммунизированного не относящегося к человеку животного, причем первую последовательность VH сливают с генной последовательностью CH; и (b) генной последовательности VL описанного в настоящем документе иммунизированного не относящегося к человеку животного, причем генную последовательность VL сливают с генной последовательностью CL человека; содержание клетки в условиях, достаточных для экспрессии антитела; и выделение вариабельного домена тяжелой цепи антитела. Согласно одному варианту осуществления генная последовательность VL является когнатной первой последовательности VH.

Согласно одному варианту осуществления клетка содержит вторую VH генную последовательность описанного в настоящем документе иммунизированного не относящегося к человеку животного, причем вторую генную последовательность VH сливают с генной последовательностью CH, причем первая генная последовательность VH кодирует домен VH, которые специфически связывает первый эпитоп, и вторая генная последовательность VH кодирует домен VH, который специфически связывает второй эпитоп, причем первый эпитоп и второй эпитоп не являются идентичными.

Согласно одному варианту осуществления последовательности константной области представляют собой только последовательности константной области человека.

Согласно одному аспекту предусмотрен способ получения биспецифического антитела человека, предусматривающий получение биспецифического антитела с применением генных последовательностей вариабельной области человека В-клеток описанного в настоящем документе не относящегося к человеку животного.

Согласно одному варианту осуществления способ предусматривает (а) идентификацию подвергнутого клональной селекции лимфоцита не относящегося к человеку животного, причем не относящееся к человеку животное было подвергнуто воздействию представляющего интерес антигена и ему была предоставлена возможность развить иммунный ответ к представляющему интерес антигену, и причем лимфоцит экспрессирует антитело, которое специфически связывает представляющий интерес антиген, (b) получение из лимфоцита или антитела нуклеотидной последовательности, которая кодирует вариабельную область тяжелой цепи человека, которая специфически связывает представляющий интерес антиген, и (с) использование нуклеотидной последовательности, которая кодирует вариабельную область тяжелой цепи человека, которая специфически связывает представляющий интерес антиген, в получении биспецифического антитела. Согласно конкретному варианту осуществления вариабельная область тяжелой цепи человека содержит реаранжированный генный сегмент VH1-2 или VH1-69.

Согласно одному варианту осуществления стадии (а)-(с) проводят первый раз для первого представляющего интерес антигена для создания первой последовательности вариабельной области тяжелой цепи человека, и стадии (а)-(с) проводят второй раз для второго представляющего интерес антигена для создания второй последовательности вариабельной области тяжелой цепи человека, и причем первую последовательность вариабельной области тяжелой цепи человека экспрессируют слитой с первой константной областью тяжелой цепи человека для образования первой тяжелой цепи человека, вторую последовательность вариабельной области тяжелой цепи человека экспрессируют слитой со второй константной области тяжелой цепи для образования второй тяжелой цепи человека, причем первую и вторую тяжелые цепи человека экспрессируют в присутствии единственной легкой цепи человека, экспрессированной из реаранжированного генного сегмента Vκ1-39 человека или генного сегмента Vκ3-20 человека. Согласно конкретному варианту осуществления единственная легкая цепь человека содержит последовательность зародышевой линии.

Согласно одному варианту осуществления способ предусматривает (а) клонирование вариабельных областей тяжелой цепи из В-клеток описанного в настоящем документе не относящегося к человеку животного, который был подвергнут воздействию первого представляющего интерес антигена, и того же не относящегося к человеку животного или другого не относящегося к человеку животного, которое является генетически одинаковым и было подвергнуто воздействию второго представляющего интерес антигена; и (b) экспрессию в клетке вариабельных областей тяжелой цепи согласно (а) с такой же константной областью тяжелой цепи и такой же легкой цепью для образования биспецифического антитела.

Согласно одному аспекту предусмотрено применение не относящегося к человеку животного, описанного в настоящем документе, для получения последовательности нуклеиновой кислоты, которая кодирует вариабельный домен тяжелой цепи человека. Согласно одному варианту осуществления вариабельный домен тяжелой цепи содержит реаранжированный генный сегмент VH человека, выбранный из VH1-2 и VH1-69.

Согласно одному аспекту предусмотрено применение не относящегося к человеку животного, описанного в настоящем документе, для получения клетки, которая кодирует вариабельный домен тяжелой цепи человека. Согласно одному варианту осуществления вариабельный домен тяжелой цепи содержит реаранжированный генный сегмент VH человека, выбранный из VH1-2 и VH1-69.

Согласно одному аспекту предусмотрено применение описанного в настоящем документе не относящегося к человеку животного, для получения вариабельного домена антитела человека. Согласно одному аспекту предусмотрено применение описанного в настоящем документе не относящегося к человеку животного, для получения антитела человека. Согласно одному варианту осуществления антитело человека представляет собой биспецифическое антитело человека. Согласно различным вариантам осуществления вариабельный домен и/или антитело содержит реаранжированный генный сегмент VH человека, выбранный из VH1-2 и VH1-69.

Согласно одному аспекту применение описанного в настоящем документе не относящегося к человеку животного, для выбора вариабельного домена тяжелой цепи иммуноглобулина человека. Согласно одному варианту осуществления вариабельный домен тяжелой цепи содержит реаранжированный генный сегмент VH человека, выбранный из VH1-2 и VH1-69.

Согласно одному аспекту предусмотрено применение описанной в настоящем документе мыши для введения эктопической последовательности ADAM6 в организм мыши, которая не содержит функциональную эндогенную последовательность ADAM6 мыши, причем применение предусматривает спаривание описанной в настоящем документе мыши с мышью, которая не содержит функциональную эндогенную последовательность ADAM6 мыши.

Согласно одному аспекту предусмотрено применение генетического материала из описанной в настоящем документе мыши для получения мыши, содержащей эктопическую последовательность ADAM6. Согласно одному варианту осуществления предусмотрено применение ядерной передачи с использованием ядра клетки описанной в настоящем документе мыши. Согласно одному варианту осуществления применение предусматривает клонирование клетки описанной в настоящем документе мыши для получения животного, полученного из клетки. Согласно одному варианту осуществления применение предусматривает использование спермы или яйцеклетки описанной в настоящем документе мыши в способе получения мыши, содержащей эктопическую последовательность ADAM6.

Согласно одному аспекту предусмотрен способ получения фертильного самца мыши, содержащего модифицированный локус тяжелой цепи иммуноглобулина, предусматривающий оплодотворение первой половой клетки мыши, которая содержит модификацию эндогенного локуса тяжелой цепи иммуноглобулина, второй половой клеткой мыши, которая содержит ген ADAM6 или его ортолог или гомолог или фрагмент, который является функциональным у самца мыши; образование оплодотворенной клетки; предоставление возможности оплодотворенной клетке развиться в зародыш; и вынашивание зародыша в суррогатной матери для получения мыши.

Согласно одному варианту осуществления оплодотворение достигается путем спаривания самца мыши и самки мыши. Согласно одному варианту осуществления самка мыши содержит ген ADAM6 или его ортолог или гомолог или фрагмент. Согласно одному варианту осуществления самец мыши содержит ген ADAM6 или его ортолог или гомолог или фрагмент.

Согласно одному аспекту предусмотрено применение последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей белок ADAM6 мыши или его ортолог или гомолог или функциональный фрагмент соответствующего белка ADAM6, для восстановления или усиления фертильности мыши с геномом, содержащим модификацию локуса тяжелой цепи иммуноглобулина, причем модификация снижает или устраняет эндогенную функцию ADAM6.

Согласно одному варианту осуществления последовательность нуклеиновой кислоты интегрирована в геном мыши в эктопическом положении. Согласно одному варианту осуществления последовательность нуклеиновой кислоты интегрирована в геном мыши на эндогенном локусе иммуноглобулина. Согласно конкретному варианту осуществления эндогенный локус иммуноглобулина представляет собой локус тяжелой цепи. Согласно одному варианту осуществления последовательность нуклеиновой кислоты интегрирована в геном мыши в положении, отличном от эндогенного локуса иммуноглобулина.

Согласно одному аспекту предусмотрено применение описанной в настоящем документе мыши для получения лекарственного средства (например, антигенсвязывающего белка) или для получения последовательности, кодирующей вариабельную последовательность лекарственного средства (например, антигенсвязывающего белка), для лечения заболевания или нарушения человека. Согласно одному варианту осуществления вариабельная последовательность лекарственного средства содержит полиморфный генный сегмент VH человека. Согласно одному варианту осуществления вариабельная последовательность лекарственного средства содержит генный сегмент VH1-69 человека. Согласно одному варианту осуществления вариабельная последовательность лекарственного средства содержит генный сегмент VH1-2 человека.

Согласно одному аспекту предусмотрен конструкт нуклеиновой кислоты, кодирующий вариабельный домен иммуноглобулина, полученный у описанной в настоящем документе мыши. Согласно одному варианту осуществления вариабельный домен представляет собой вариабельный домен тяжелой цепи. Согласно конкретному варианту осуществления вариабельный домен тяжелой цепи содержит генный сегмент VH человека, выбранный из VH1-2, VH1-69, VH2-26, VH2-70 или VH3-23. Согласно другому конкретному варианту осуществления вариабельный домен тяжелой цепи содержит генный сегмент VH1-2 человека. Согласно другому конкретному варианту осуществления вариабельный домен тяжелой цепи содержит генный сегмент VH1-69 человека.

Согласно одному варианту осуществления вариабельный домен представляет собой вариабельный домен легкой цепи. Согласно конкретному варианту осуществления вариабельный домен представляет собой вариабельный домен κ легкой цепи, который является когнатным вариабельному домену тяжелой цепи человека, который содержит реаранжированный генный сегмент VH1-69 человека. Согласно конкретному варианту осуществления вариабельный домен представляет собой вариабельный домен κ легкой цепи, который является когнатным вариабельному домену тяжелой цепи человека, который содержит реаранжированный генный сегмент VH1-2 человека.

Согласно одному аспекту предусмотрено применение описанной в настоящем документе мыши для получения конструкта нуклеиновой кислоты, кодирующего вариабельный домен иммуноглобулина человека. Согласно одному варианту осуществления вариабельный домен представляет собой вариабельный домен легкой цепи. Согласно одному варианту осуществления вариабельный домен представляет собой вариабельный домен κ легкой цепи, который содержит реаранжированный генный сегмент Vκ человека, выбранный из Vκ4-1, Vκ5-2, Vκ7-3, Vκ2-4, Vκ1-5, Vκ1-6, Vκ3-7, Vκ1-8, Vκ1-9, Vκ2-10, Vκ3-11, Vκ1-12, Vκ1-13, Vκ2-14, Vκ3-15, Vκ1-16, Vκ1-17, Vκ2-18, Vκ2-19, Vκ3-20, Vκ6-21, Vκ1-22, Vκ1-23, Vκ2-24, Vκ3-25, Vκ2-26, Vκ1-27, Vκ2-28, Vκ2-29, Vκ2-30, Vκ3-31, Vκ1-32, Vκ1-33, Vκ3-34, Vκ1-35, Vκ2-36, Vκ1-37, Vκ2-38, Vκ1-39 и Vκ2-40.

Согласно одному варианту осуществления вариабельный домен представляет собой вариабельный домен тяжелой цепи. Согласно конкретному варианту осуществления вариабельный домен тяжелой цепи содержит реаранжированный генный сегмент VH человека, выбранный из VH1-2, VH1-69, VH2-26, VH2-70 или VH3-23. Согласно конкретному варианту осуществления вариабельный домен тяжелой цепи содержит реаранжированный генный сегмент VH1-69 человека. Согласно конкретному варианту осуществления вариабельный домен тяжелой цепи содержит реаранжированный генный сегмент VH1-2 человека.

Согласно одному аспекту предусмотрено применение описанной в настоящем документе мыши для получения вариабельного домена иммуноглобулина человека. Согласно одному варианту осуществления вариабельный домен представляет собой вариабельный домен легкой цепи. Согласно одному варианту осуществления вариабельный домен представляет собой вариабельный домен κ легкой цепи, который содержит реаранжированный генный сегмент Vκ человека, выбранный из Vκ4-1, Vκ5-2, Vκ7-3, Vκ2-4, Vκ1-5, Vκ1-6, Vκ3-7, Vκ1-8, Vκ1-9, Vκ2-10, Vκ3-11, Vκ1-12, Vκ1-13, Vκ2-14, Vκ3-15, Vκ1-16, Vκ1-17, Vκ2-18, Vκ2-19, Vκ3-20, Vκ6-21, Vκ1-22, Vκ1-23, Vκ2-24, Vκ3-25, Vκ2-26, Vκ1-27, Vκ2-28, Vκ2-29, Vκ2-30, Vκ3-31, Vκ1-32, Vκ1-33, Vκ3-34, Vκ1-35, Vκ2-36, Vκ1-37, Vκ2-38, Vκ1-39 и Vκ2-40.

Согласно одному варианту осуществления вариабельный домен представляет собой вариабельный домен тяжелой цепи. Согласно конкретному варианту осуществления вариабельный домен тяжелой цепи содержит реаранжированный генный сегмент VH человека, выбранный из VH1-2, VH1-69, VH2-26, VH2-70 или VH3-23. Согласно конкретному варианту осуществления вариабельный домен тяжелой цепи содержит реаранжированный генный сегмент VH1-69 человека. Согласно конкретному варианту осуществления вариабельный домен тяжелой цепи содержит реаранжированный генный сегмент VH1-2 человека.

Различные аспекты и варианты осуществления можно применять совместно, если только ясно не указано иное или контекст явно запрещает совместное применение.

Краткое описание фигур

На фиг. 1 показано общее изображение, без соблюдения масштаба, серии стадий нацеливания и молекулярного конструирования, используемых для создания нацеливающего вектора для конструкции модифицированного локуса тяжелой цепи, содержащего единственный генный сегмент VH1-69 человека, двадцать семь генных сегментов DH человека и шесть генных сегментов JH человека в эндогенном локусе тяжелой цепи иммуноглобулина.

На фиг. 2 показано общее изображение, без соблюдения масштаба, серии стадий нацеливания и молекулярного конструирования, используемых для создания нацеливающего вектора для конструкции модифицированного локуса тяжелой цепи, содержащего единственный генный сегмент VH1-2 человека, двадцать семь генных сегментов DH человека и шесть генных сегментов JH человека в эндогенном локусе тяжелой цепи иммуноглобулина.

На фиг. 3 показано общее изображение, без соблюдения масштаба, серии стадий нацеливания и молекулярного конструирования, используемых для создания нацеливающего вектора для конструкции модифицированного локуса тяжелой цепи, содержащего единственный генный сегмент VH1-69 человека, 27 генных сегментов DH человека, шесть генных сегментов JH человека и эктопический геномный фрагмент, кодирующий ADAM6 мыши на эндогенном локусе тяжелой цепи иммуноглобулина.

На фиг. 4 показано общее изображение, без соблюдения масштаба, серии стадий нацеливания и молекулярного конструирования, используемых для создания нацеливающего вектора для конструкции модифицированного локуса тяжелой цепи, содержащего единственный генный сегмент VH1-2 человека, 27 генных сегментов DH человека, шесть генных сегментов JH человека и эктопический геномный фрагмент, кодирующий ADAM6 мыши на эндогенном локусе тяжелой цепи иммуноглобулина.

На фиг. 5 показано выравнивание нуклеотидов второго экзона для каждого из тринадцати представленных аллелей для гена VH1-69 человека. Основания строчными буквами обозначают различия нуклеотидов зародышевой линии среди аллелей. Определяющие комплементарность области (CDR) обозначены прямоугольниками вокруг последовательности. Тире обозначают искусственные пробелы для правильного выравнивания последовательностей. VH1-69*01 (SEQ ID NO: 37); VH1-69*02 (SEQ ID NO: 39); VH1-69*03 (SEQ ID NO: 41); VH1-69*04 (SEQ ID NO: 43); VH1-69*05 (SEQ ID NO: 45); VH1-69*06 (SEQ ID NO: 47); VH1-69*07 (SEQ ID NO: 49); VH1-69*08 (SEQ ID NO: 51); VH1-69*09 (SEQ ID NO: 53); VH1-69*10 (SEQ ID NO: 55); VH1-69*11 (SEQ ID NO: 57); VH1-69*12 (SEQ ID NO: 59); VH1-69*13 (SEQ ID NO: 61).

На фиг. 6 показано выравнивание белка в зрелой последовательности вариабельного гена тяжелой цепи для каждого из тринадцати представленных аллелей гена VH1-69 человека. Основания строчными буквами обозначают различия нуклеотидов зародышевой линии среди аллелей. Определяющие комплементарность области (CDR) обозначены прямоугольниками вокруг последовательности. Тире обозначают искусственные пробелы для правильного выравнивания последовательностей. VH1-69*01 (SEQ ID NO: 38); VH1-69*02 (SEQ ID NO: 40); VH1-69*03 (SEQ ID NO: 42); VH1-69*04 (SEQ ID NO: 44); VH1-69*05 (SEQ ID NO: 46); VH1-69*06 (SEQ ID NO: 48); VH1-69*07 (SEQ ID NO: 50); VH1-69*08 (SEQ ID NO: 52); VH1-69*09 (SEQ ID NO: 54); VH1-69*10 (SEQ ID NO: 56); VH1-69*11 (SEQ ID NO: 58); VH1-69*12 (SEQ ID NO: 60); VH1-69*13 (SEQ ID NO: 62).

На фиг. 7 показан процент идентичности/процент сходства матрицы для подвергнутых выравниванию белковых последовательностей зрелого вариабельного гена для каждого из тринадцати известных аллелей для гена VH1-69 человека. Процент идентичности среди аллелей VH1-69 указан над затемненными прямоугольниками, и процент сходства указан под затемненными прямоугольниками. Значения процента идентичности и процента сходства определяли с помощью инструмента выравнивания ClustalW (v1.83), используя программное обеспечение MacVector (MacVector, Inc., North Carolina).

На фиг. 8 показано выравнивание нуклеотидов второго экзона для каждого из пяти известных аллелей гена для гена VH1-2 человека. Основания строчными буквами обозначают различия нуклеотидов зародышевой линии среди аллелей. Определяющие комплементарность области (CDR) обозначены прямоугольниками вокруг последовательности. Тире обозначают искусственные пробелы для правильного выравнивания последовательностей. VH1-2*01 (SEQ ID NO: 63); VH1-2*02 (SEQ ID NO: 65); VH1-2*03 (SEQ ID NO: 67); VH1-2*04 (SEQ ID NO: 69); VH1-2*05 (SEQ ID NO: 71).

На фиг. 9 показано выравнивание белка в зрелой последовательности вариабельного гена тяжелой цепи для каждого из пяти известных аллелей для гена VH1-2 человека. Аминокислоты строчными буквами обозначают различия зародышевой линии среди аллелей. Определяющие комплементарность области (CDR) обозначены прямоугольниками вокруг последовательности. Тире обозначают искусственные пробелы для правильного выравнивания последовательностей. VH1-2*01 (SEQ ID NO: 64); VH1-2*02 (SEQ ID NO: 66); VH1-2*03 (SEQ ID NO: 68); VH1-2*04 (SEQ ID NO: 70); VH1-2*05 (SEQ ID NO: 72).

На фиг. 10 показан процент идентичности/процент сходства матрицы для подвергнутых выравниванию белковых последовательностей зрелого вариабельного гена для каждого из пяти известных аллелей для гена VH1-2 человека. Процент идентичности среди аллелей VH1-2 указан над затемненными прямоугольниками, и процент сходства указан под затемненными прямоугольниками. Значения процента идентичности и процента сходства определяли с помощью инструмента выравнивания ClustalW (v1.83), используя программное обеспечение MacVector (MacVector, Inc., North Carolina).

Подробное раскрытие настоящего изобретения

Настоящее изобретение не ограничивается конкретными способами и описанными экспериментальными условиями, поскольку такие способы и условия могут варьировать. Кроме того, следует понимать, что используемая в настоящем документе терминология предназначена только для цели описания конкретных вариантов осуществления и не предусматривается для ограничения, поскольку объем настоящего изобретения определяется его формулой.

Если не указано иное, все используемые в настоящем документе термины и фразы, включают в себя те значения, которые подразумеваются под терминами и фразами в настоящей области техники, если иное прямо не указано или явно не следует из контекста, в котором используется термин или фраза. Хотя любые способы и материалы, подобные или эквивалентные описанным в настоящем документе, могут быть использованы на практике или при испытании настоящего изобретения, далее будут описаны конкретные способы и материалы.

Фраза "существенный" или "по существу" при использовании для обозначения количества генных сегментов (например, "по существу все" генные сегменты V) включает в себя как функциональные, так и нефункциональные генные сегменты и включает в себя, согласно различным вариантам осуществления например, 80% или более, 85% или более, 90% или более, 95% или более 96% или более, 97% или более, 98% или более, или 99% или более всех генных сегментов; согласно различным вариантам осуществления фраза "по существу все" генные сегменты включает в себя, например, по меньшей мере 95%, 96%, 97%, 98% или 99% функциональных (т.е. не относящихся к псевдогенам) генных сегментов.

Термин "замещение" включает в себя помещение последовательности ДНК в геном клетки таким образом, чтобы заменить последовательность в пределах генома гетерологичной последовательностью (например, последовательностью человека у мыши) на локусе геномной последовательности. Помещенная таким образом последовательность ДНК может включать в себя одну или несколько регуляторных последовательностей, которые представляют собой часть исходной ДНК, используемой для получения помещенной таким образом последовательности (например, промоторы, энхансеры, 5'- или 3'-нетранслируемые области, соответствующие последовательности сигналов рекомбинации и т.д.). Например, согласно различным вариантам осуществления замещение представляет собой замену эндогенной последовательности гетерологичной последовательностью, что приводит к производству генного продукта из помещенной таким образом последовательности ДНК (содержащей гетерологичную последовательность), но не экспрессии эндогенной последовательности; замещение эндогенной геномной последовательности последовательностью ДНК, которая кодирует белок, который характеризуется аналогичной функцией, что и белок, кодируемый эндогенной геномной последовательностью (например, эндогенная геномная последовательность кодирует ген или домен иммуноглобулина, и фрагмент ДНК кодирует один или несколько генов или доменов иммуноглобулина человека). Согласно различным вариантам осуществления эндогенный ген или его фрагмент заменяют соответствующим геном человека или его фрагментом. Соответствующий ген человека или его фрагмент представляет собой ген человека или фрагмент, который представляет собой ортолог, гомолог или по существу идентичный или такой же по структуре и/или функции, как эндогенный ген или его фрагмент, который заменен.

Мышь в качестве генетической модели была значительно усовершенствована с помощью трансгенных технологий и технологий нокаута, которые предоставили возможность для изучения эффектов направленной избыточной экспрессии или делеции специфических генов. Несмотря на все свои преимущества, мышь все еще демонстрирует генетические затруднения, которые делают ее несовершенной моделью для заболеваний человека и несовершенной платформой для испытания или получения терапевтических средств для людей. Во-первых, несмотря на то, что приблизительно 99% генов человека имеют мышиный гомолог (Waterston et. al. (2002). Initial sequencing and comparative analysis of the mouse genome, Nature 420, 520-562), потенциальные терапевтические средства зачастую не дают перекрестной реакции или дают неадекватную перекрестную реакцию с мышиными ортологами предполагаемых мишеней человека. Для устранения этой проблемы выбранные целевые гены могут быть "гуманизированы", то есть ген мыши может быть устранен и замещен соответствующей ортологичной генной последовательностью человека (например, патенты США №№6586251, 6596541 и 7105348). Изначально, попытки гуманизировать мышиные гены с помощью стратегии "генный нокаут совместно с трансгенной гуманизацией" предусматривали скрещивание мыши, несущей делецию (т.е. нокаут) эндогенного гена, с мышью, несущей интегрированный в произвольном порядке трансген человека (смотрите, например, Bril et al., 2006, Tolerance to factor VIII in a transgenic mouse expressing human factor VIII cDNA carrying an Arg(593) to Cys substitution, Thromb Haemost 95:341-347; Homanics et al., 2006, Production and characterization of murine models of classic and intermediate maple syrup urine disease, BMC Med Genet 7:33; Jamsai et al., 2006, A humanized ВАС transgenic/knockout mouse model for HbE/beta-thalassemia, Genomics 88(3):309-15; Pan et al., 2006, Different role for mouse and human CD3delta/epsilon heterodimer in preT cell receptor (preTCR) function : human CD3delta/epsilon heterodimer restores the defective preTCR function in CD3gamma- and CD3gammadelta-deficient mice, Mol Immunol 43:1741-1750). Но эти попытки затруднялись ограничениями в размере; традиционные технологии генного нокаута были недостаточными для прямого замещения больших мышиных генов их большими геномными эквивалентами человека. Простой подход прямого гомологичного замещения, при котором эндогенный мышиный ген напрямую замещается эквивалентным геном человека в том же точном генетическом положении гена меши (т.е., на эндогенном мышином локусе), предпринимался редко вследствие технических сложностей. До настоящего времени попытки прямого замещения предусматривали усложненные и трудные процедуры, таким образом, ограничивая длину генетического материала, с который могли быть произведены манипуляции, и точность, с которой эти манипуляции могли быть произведены.

Экзогенно введенные трансгены иммуноглобулина человека перестраиваются в предшественниках В-клеток у мышей (Alt et al., 1985, Immunoglobulin genes in transgenic mice, Trends Genet 1:231-236). Это открытие использовалось в конструировании мышей с использованием генного нокаута вместе с трансгенным подходом для экспрессии антител человека (Green et al., 1994, Antigen-specific human monoclonal antibodies from mice engineered with human Ig heavy and light chain YACs, Nat Genet 7:13-21; Lonberg et al., 1994, Antigen-specific human antibodies from mice comprising four distinct genetic modifications, Nature 368:856-859; Jakobovits et al., 2007, From XenoMouse technology to panitumumab, the first fully human antibody product from transgenic mice, Nat Biotechnol 25:1134-1143). Локусы тяжелой цепи и κ легкой цепи иммуноглобулина мыши инактивировали у этих мышей путем направленной делеции небольших, но критически важных частей каждого эндогенного локуса с последующим введением генных локусов иммуноглобулина человека в виде описанных выше случайным образом интегрированных больших трансгенов или минихромосом (Tomizuka et al., 2000, Double trans-chromosomic mice: maintenance of two individual human chromosome fragments containing Ig heavy and kappa loci and expression of fully human antibodies, PNAS USA 97:722-727). Такие мыши представляли важное преимущество в генной инженерии; выделенные из них полностью человеческие моноклональные антитела давали в результате перспективные терапевтические средства для лечения различных заболеваний человека (Gibson et al., 2006, Randomized phase III trial results of panitumumab, a fully human anti-epidermal growth factor receptor monoclonal antibody, in metastatic colorectal cancer, Clin Colorectal Cancer 6:29-31; Jakobovits et al., 2007; Kim et al., 2007, Clinical efficacy of zanolimumab (HuMax-CD4): two Phase II studies in refractory cutaneous T-cell lymphoma, Blood 109(11):4655-62; Lonberg, 2005, Human antibodies from transgenic animals, Nat Biotechnol 23:1117-1125; Maker et al., 2005, Tumor regression and autoimmunity in patients treated with cytotoxic T lymphocyte-associated antigen 4 blockade and interleukin 2: a phase I/II study, Ann Surg Oncol 12:1005-1016; McClung et al., 2006, Denosumab in postmenopausal women with low bone mineral density, New Engl J Med 354:821-831). Но, как обсуждалось выше, эти мыши проявляют нарушенное развитие В-клеток и иммунологические дефициты по сравнению с мышами дикого типа. Такие проблемы потенциально ограничивают способность мышей обеспечивать сильный гуморальный ответ и, следовательно, образовывать полностью человеческие антитела к некоторым антигенам. Недостаточности могут быть обусловлены следующим: (1) неэффективная функциональность вследствие введения случайным образом трансгенов иммуноглобулина человека и полученная в результате неправильная экспрессия вследствие отсутствия контролирующих элементов против хода транскрипции и по ее ходу (Garrett et al., 2005, Chromatin architecture near a potential 3' end of the IgH locus involves modular regulation of histone modifications during B-Cell development and in vivo occupancy at CTCF sites, Mol Cell Biol 25:1511-1525; Manis et al., 2003, Elucidation of a downstream boundary of the 3' IgH regulatory region, Mol Immunol 39:753-760; Pawlitzky et al., 2006, Identification of a candidate regulatory element within the 5' flanking region of the mouse IgH locus defined by pro-B cell-specific hypersensitivity associated with binding of PU.1, Pax5, and E2A, J Immunol 176:6839-6851); (2) неэффективные межвидовые взаимодействия между константными доменами человека и мышиными компонентами В-клеточного рецепторного сигнального комплекса на клеточной поверхности, которые могут ослаблять сигнальные процессы, необходимые для нормального созревания, пролиферации и выживания В-клеток (Hombach et al., 1990, Molecular components of the B-cell antigen receptor complex of the IgM class, Nature 343:760-762); и (3) неэффективные межвидовые взаимодействия между растворимыми иммуноглобулинами человека и Fc рецепторами мыши, которые могут снижать аффинную селекцию (Rao et al., 2002, Differential expression of the inhibitory IgG Fc receptor FcgammaRIIB on germinal center cells: implications for selection of high-affinity В cells, J Immunol 169:1859-1868) и концентрации иммуноглобулинов в сыворотке (Brambell et al., 1964, A Theoretical Model of Gamma-Globulin Catabolism, Nature 203:1352-1354; Junghans and Anderson, 1996, The protection receptor for IgG catabolism is the beta2-microglobulin-containing neonatal intestinal transport receptor, PNAS USA 93:5512-5516; Rao et al., 2002; Hjelm et al., 2006, Antibody-mediated regulation of the immune response, Scand J Immunol 64:177-184; Nimmerjahn and Ravetch, 2007, Fc-receptors as regulators of immunity, Adv Immunol 96:179-204). Указанные недостаточности можно корректировать с помощью гуманизации in situ только вариабельных областей локусов иммуноглобулина мыши в пределах их естественных положений на эндогенных локусах тяжелых и легких цепей. Это будет фактически давать в результате мышей, которые образуют обратные химерные антитела (т.е., V человека: С мыши), которые будут способны к нормальным взаимодействиям и селекции в мышином окружении на основании сохранения константных областей мыши. С помощью указанного подхода может быть сконструирован конкретный вариант гуманизированного локуса на основании той сложности химерного локуса, которая требуется. Более того, такие обратные химерные антитела легко реформатируются в полностью человеческие антитела для терапевтических целей.

Генетически модифицированные животные, которые содержат вставку или замещение на эндогенном локусе тяжелой цепи иммуноглобулина гетерологичными (например, от другого вида) последовательностями иммуноглобулина, могут быть получены в сочетании со вставками или замещениями на эндогенных локусах легкой цепи иммуноглобулина или в сочетании с трансгенами легкой цепи иммуноглобулина (например, химерными трансгенами легкой цепи иммуноглобулина или полностью человеческими полностью мышиными и т.д.). Вид, из которого происходят гетерологичные последовательности тяжелой цепи иммуноглобулина, может широко варьировать; как и в случае последовательностей легкой цепи иммуноглобулина, используемых в замещениях последовательностей легкой цепи иммуноглобулина или трансгенах легкой цепи иммуноглобулина. Иллюстративные гетерологичные последовательности тяжелой цепи иммуноглобулина включают в себя последовательности человека.

Последовательности нуклеиновой кислоты вариабельной области иммуноглобулина, например, сегменты V, D и/или J согласно различным вариантам осуществления получены от человека или не относящегося к человеку животного. Не относящиеся к человеку животные, подходящие для предоставления сегментов V, D и/или J, включают в себя, например, костных рыб, таких хрящевых рыб, как акулы и ромбовидные скаты, амфибий, рептилий, млекопитающих, птиц (например, куриц). Не относящиеся к человеку животные включают в себя, например, млекопитающих. Млекопитающие включают в себя, например, не относящихся к человеку приматов, коз, овец, свиней, собак, крупный рогатый скот (например, корову, быка, буйвола), оленя, верблюдов, хорьков и грызунов и не относящихся к человеку приматов (например, шимпанзе, орангутанов, горилл, мармазеток, макак-резусов, бабуинов). Подходящие не относящиеся к человеку животные выбраны из семейства грызунов, включающего в себя крыс, мышей и хомяков. Согласно одному варианту осуществления не относящиеся к человеку животные представляют собой мышей. Из контекста ясно, что различные не относящиеся к человеку животные могут быть использованы в качестве источника вариабельных доменов или генных сегментов вариабельной области (например, акулы, ромбовидные скаты, млекопитающие, например, верблюды, такие грызуны, как мыши и крысы).

Согласно контексту не относящиеся к человеку животные также используются в качестве источника последовательностей константной области для применения вместе с вариабельными последовательностями или сегментами, например, константные последовательности грызуна могут использоваться в трансгенах, функционально связанных с относящимися к человеку или не относящимися к человеку вариабельными последовательностями (например, вариабельные последовательности человека или не относящегося к человеку примата, функционально связанные, например, с константными последовательностями грызуна, например, мыши или крысы или хомяка). Таким образом, согласно различным вариантам осуществления сегменты V, D и/или J человека функционально связаны с генными последовательностями константной области грызуна (например, мыши или крысы или хомяка). Согласно некоторым вариантам осуществления сегменты V, D и/или J человека (или одного или нескольких реаранжированных генов VDJ или VJ) функционально связаны или слиты с генной последовательностью константной области мыши, крыса или хомяка, например, в трансгене, интегрированном в локус, который не является эндогенным локусом иммуноглобулина.

Согласно конкретному варианту осуществления предусмотрена мышь, которая содержит замещение генных сегментов VH, DH и JH на эндогенном локусе тяжелой цепи иммуноглобулина единственным генным сегментом VH человека, одним или несколькими генными сегментами DH и одним или несколькими генными сегментами JH, причем единственный генный сегмент VH человека, один или несколько генных сегментов DH и один или несколько генных сегментов JH функционально связаны с эндогенным геном тяжелой цепи иммуноглобулина; причем мышь содержит трансген на локусе, отличном от эндогенного локуса иммуноглобулина, причем трансген содержит нереаранжированный или реаранжированный генный сегмент VL человека и генный сегмент JL человека, функционально связанный с константной областью мыши или крысы или человека. Согласно различным вариантам осуществления единственный генный сегмент VH человека представляет собой полиморфный генный сегмент. Согласно одному варианту осуществления единственный генный сегмент VH человека представляет собой генный сегмент VH1-69 человека или генный сегмент VH1-2 человека.

Описан способ для генетического замещения in situ зародышевого вариабельного генного локуса тяжелой цепи иммуноглобулина мыши ограниченным зародышевым локусом тяжелой цепи иммуноглобулина человека и замещения зародышевых вариабельных генных локусов κ легкой цепи иммуноглобулина мыши зародышевыми локусами κ легкой цепи иммуноглобулина человека, при сохранении способности мышей производить потомство. В частности, описано точное замещение шести миллионов пар нуклеотидов вариабельных генных локусов, как тяжелой цепи, так и κ легкой цепи иммуноглобулина мыши последовательностями тяжелой и κ легкой цепи иммуноглобулина человека, при этом оставляя константные области мыши интактными. В результате этого были созданы мыши, которые содержат точное замещение своего полного зародышевого вариабельного репертуара иммуноглобулина зародышевыми вариабельными последовательностями иммуноглобулина человека, при сохранении константных областей мыши. Вариабельные области человека связывают с константными областями мыши для образования химерных относящихся к человеку-мыши локусов иммуноглобулина, которые реаранжируются и экспрессируются на физиологически приемлемых уровнях. Экспрессированные антитела представляют собой "обратные химеры", т.е. они содержат последовательности вариабельной области человека и последовательности константной области мыши.

Описанные в настоящем документе генетически модифицированные мыши проявляют полностью функциональную гуморальную иммунную систему и предоставляют обильный источник последовательностей вариабельной области иммуноглобулина человека с созревшей естественным образом аффинностью для получения фармацевтически приемлемых антител и других антигенсвязывающих белков, которые являются эффективными для борьбы с патогенными антигенами, например, вирусными антигенами.

Конструирование последовательностей иммуноглобулина человека в геном мыши, даже в точных положениях, например, на эндогенных локусах иммуноглобулина мыши, может представлять определенные проблемы вследствие дивергентной эволюции локусов иммуноглобулина между мышью и человеком. Например, межгенные последовательности, разбросанные в пределах локусов иммуноглобулина, не идентичны между мышами и людьми и в некоторых обстоятельствах могут не быть функционально эквивалентными. Различия между мышами и людьми в их локусах иммуноглобулина может все еще приводить к аномалиям у гуманизированных мышей, в частности, при гуманизации или манипуляции с определенными частями эндогенных локусов тяжелой цепи иммуноглобулина мыши. Некоторые модификации на локусах тяжелой цепи иммуноглобулина мыши являются вредными. Вредные модификации могут включать в себя, например, потерю способности модифицированных мышей спариваться и производить потомство. Согласно различным вариантам осуществления конструирование последовательностей иммуноглобулина человека в геноме мыши включает в себя способы, которые сохраняют эндогенные последовательности, которые при отсутствии у модифицированных линий мышей являются вредными. Иллюстративные неблагоприятные эффекты могут включать в себя неспособность воспроизводить модифицированные линии, потерю функции жизненно важных генов, неспособность экспрессировать полипептиды и т.д. Такие неблагоприятные эффекты могут быть напрямую или косвенно связаны с модификацией, разработанной в геноме мыши.

Несмотря на то, что близкая к дикому типу гуморальная иммунная функция, наблюдаемая у мышей с гуманизированными локусами иммуноглобулина, существуют другие обнаруживаемые при использовании прямого замещения последовательностей иммуноглобулина сложности, которые не встречаются в некоторых подходах, которые используют интегрированные случайным образом трансгены. Различия в генетическом составе иммуноглобулиновых локусов между мышами и людьми привело к открытию последовательностей, преимущественных для размножения мышей с замещенными иммуноглобулиновыми генными сегментами. В частности, гены ADAM мыши, расположенные в пределах эндогенного локуса иммуноглобулина, оптимально присутствуют у мышей с замещенными иммуноглобулиновыми локусами вследствие их роли в фертильности.

Провели точное замещение in situ шести миллионов пар нуклеотидов вариабельных областей локусов тяжелой цепи иммуноглобулина мыши (VH-DH-JH) ограниченным локусом тяжелой цепи иммуноглобулина человека, оставляя фланкирующие последовательности мыши интактными и функциональными в пределах гибридных локусов, включая в себя все гены константной цепи мыши и области транскрипционного контроля локуса (фиг. 1 и фиг. 8). Дополнительные стадии конструирования провели для сохранения последовательностей мыши, которые придают мыши способность спариваться и производить потомство сопоставимым с мышью дикого типа образом (фиг. 9 и фиг. 10). В частности, единственный VH человека, 27 генных сегментов DH и шесть генных сегментов JH и гены ADAM6 мыши вводили посредством химерных основанных на ВАС нацеливающих векторов в ES клетки мыши с использованием технологии генной инженерии VELOCIGENE® (смотрите, например, патент США №6586251 и Valenzuela et al., 2003, High-throughput engineering of the mouse genome coupled with high-resolution expression analysis, Nat Biotechnol 21:652-659).

Мыши с ограниченными вариабельными генными сегментами тяжелой цепи иммуноглобулина

Предусмотрены не относящиеся к человеку животные, содержащие локусы иммуноглобулина, которые содержат ограниченное количество генов VH и один или несколько генов D, и один или несколько генов J, а также способы их получения и использования. После иммунизации представляющим интерес антигеном не относящиеся к человеку животные генерируют популяции В-клеток с вариабельными областями антител, полученными только от ограниченного, заранее выбранного гена VH или набора генов VH (например, заранее выбранный ген VH и его варианты). Согласно различным вариантам осуществления предусмотрены не относящиеся к человеку животные, которые генерируют популяции В-клеток, которые экспрессируют вариабельные домены человеческих антител, которые представляют собой вариабельные домены тяжелой цепи человека, вместе с когнатными вариабельными доменами легкой цепи человека. Согласно различным вариантам осуществления не относящиеся к человеку животные реаранжируют вариабельные генные сегменты тяжелой цепи человека и вариабельные генные сегменты легкой цепи человека из модифицированных эндогенных локусов иммуноглобулина мыши, которые включают замещение или вставку нереаранжированных не относящихся к человеку последовательностей вариабельной области переаранжированными последовательностей вариабельной области человека.

Предыдущие работы по организации, структуре и функции генов иммуноглобулина были проведены частично на мышах с недееспособными эндогенными локусами и сконструированными для получения трансгенных локусов (помещенных в случайном порядке) с частичными генами иммуноглобулина человека, например, частичный репертуар генов тяжелой цепи человека, связанный с константным геном человека, случайным образом вставленным в геном в присутствии или в отсутствие трансгена легкой цепи человека. Хотя этих мышей было несколько меньше, чем оптимально необходимо для получения применимых высокоаффинных антител, они способствовали проведению определенных функциональных анализов локусов иммуноглобулина. Некоторые из этих мышей содержали всего лишь два или три или даже всего лишь единственный вариабельный ген тяжелой цепи.

Сообщалось о мышах, которые экспрессируют полностью человеческие тяжелые цепи иммуноглобулина, полученные из единственного гена VH5-51 человека и 10 генов DH человека, и шести генов JH человека, с константными генами μ и γ1 человека, на случайно вставленном трансгене (и недееспособных эндогенных локусах иммуноглобулина) (Xu and Davis, 2000, Diversity in the CDR3 Region of VH Is Sufficient for Most Antibody Specificities, Immunity 13:37-45). Полностью человеческие тяжелые цепи иммуноглобулина этих мышей в основном экспрессируются с одной из всего двух полностью мышиных λ легких цепей, полученных из эндогенного локуса λ легкой цепи мыши (только Vλ1-Jλ1 или Vλ2-Jλ2), и не могут экспрессировать к легкую цепь (мыши представляют собой Igκ-/-). Эти мыши проявляют строго аномальную дисфункцию в развитии В-клеток и экспрессии антител. Количество В-клеток, как сообщается, составляет 5-10% от дикого типа, содержание IgM 5-10% от дикого типа и содержание IgG1 только 0,1-1% от дикого типа. Наблюдаемый репертуар IgM выявил крайне ограниченную множественность J-сегментов. Полностью человеческие тяжелые цепи демонстрируют в основном одинаковую длину CDR3 по антигенам, одну и ту же частоту использования JH (JH2) в антигенах и начальный остаток Q множественности сегментов J, таким образом отражая определенную нехватку разнообразия CDR3. Почти все полностью мышиные λ легкие цепи содержали замену W96L в Jλ1 в качестве начального соединительного остатка. Как сообщается, мыши не в состоянии производить какие-либо антитела к бактериальному полисахариду. Поскольку вариабельные домены человека образуют пару с легкими цепями мыши, применимость вариабельных областей человека сильно ограничена.

Сообщалось о других мышах, которые содержали только единственный ген VH3-23 человека, гены DH и JH человека и гены легкой цепи мыши, но они проявляют ограниченное разнообразие (и, следовательно, ограниченную применимость) отчасти из-за потенциала ошибочного спаривания между доменами VH человека и VL мыши (смотрите, например, Mageed et al., 2001, Rearrangement of the human heavy chain variable region gene V3-23 in transgenic mice generates antibodies reactive with a range of antigens on the basis of VHCDR3 and residues intrinsic to the heavy chain variable region, Clin. Exp. Immunol. 123:1-5). Аналогичным образом, мыши, которые несут два гена VH (3-23 и 6-1) вместе с генами DH и JH человека в трансгене, содержащем константный ген μ человека (Bruggemann et al., 1991, Human antibody production in transgenic mice: expression from 100 kb of the human IgH locus, Eur. J. Immmunol 21:1323-1326), и экспрессируют их в цепи IgM человека с легкими цепями мыши, могут проявлять репертуар, ограниченный ошибочным спариванием (Mackworth-Young et al., 2003, The role of antigen in the selection of the human V3-23 immunoglobulin heavy chain variable region gene, Clin. Exp. Immunol. 134:420-425).

Также сообщалось о других трансгенных мышах, которые экспрессируют ограниченные в отношении VH полностью человеческие тяжелые цепи с трансгена человека, случайным образом вставленного в геном, с ограниченным репертуаром λ человека, экспрессированным с полностью человеческого случайным образом вставленного трансгена (смотрите, например, Taylor et al., 1992, A transgenic mouse that expresses a diversity of human sequence heavy and light chain immunoglobulins, Nucleic Acids Res. 20(23):6287-6295; Wagner et al., 1994, Antibodies generated form human immunoglobulin miniloci in transgenic mice, Nucleic Acids Res. 22(8):1389-1393). Тем не менее, трансгенные мыши, которые экспрессируют полностью человеческие антитела из случайным образом интегрированных в геном мыши трансгенов и которые содержат поврежденные эндогенные локусы, как известно, проявляют существенные различия в иммунном ответе по сравнению с мышами дикого типа, которые влияют на разнообразие вариабельных доменов антитела, получаемого из таких мышей.

Предпочтительно согласно некоторым вариантам осуществления применимые не относящиеся к человеку животные, которые производят разнообразную популяцию В-клеток, которые экспрессируют вариабельные домены антитела человека от ограниченного репертуара генов VH и одного или нескольких генов D и одного или нескольких генов J, будут способны производить репертуары реаранжированных генов вариабельной области, которые будут достаточно разнообразны. Согласно различным вариантам осуществления разнообразие включает в себя разнообразие множественности сегментов J, соматическую гипермутацию и полиморфное разнообразие в последовательности гена VH (для вариантов осуществления, где гены VH присутствуют в полиморфных формах). Комбинаторное разнообразие происходит в спаривании гена VH с одним из множества когнатных вариабельных доменов легкой цепи человека (которые, согласно различным вариантам осуществления содержат разнообразие множественности J сегментов и/или соматические гипермутации).

Согласно различным вариантам осуществления не относящиеся к человеку животные, содержащие ограниченный репертуар генов VH человека и полный или по существу полный репертуар генов VL человека, будут производить популяции В-клеток, которые отражают различные источники разнообразия, такие как разнообразие множественности сегментов J (например, соединение VDJ, VJ, присоединения Р, присоединения N), комбинаторное разнообразие (например, когнатный ограниченный VH тяжелой цепи человека, легкой цепи человека) и соматические гипермутации. Согласно вариантам осуществления включающим ограничение репертуара VH до одного гена VH человека, один ген VH человека может присутствовать в двух или более вариантах. Согласно различным вариантам осуществления присутствие двух или более полиморфных форм гена VH будет обогащать разнообразие вариабельных доменов популяции В-клеток.

Изменчивости в последовательностях зародышевой линии генных сегментов (например, генов V) вносят вклад в разнообразие ответа антител у людей. Относительный вклад в разнообразие благодаря различиям последовательности гена V изменяется среди генов V. Степень полиморфизма варьирует в семействе генов и отражается во множестве гаплотипов (участки последовательности с унаследованными полиморфизмами), способных производить дополнительное разнообразие, как это наблюдается в различиях гаплотипов VH между связанными и несвязанными индивидуумами в человеческой популяции (смотрите, например, Souroujon et al., 1989, Polymorphisms in Human H Chain V Region Genes from the VHIII Gene Family, J. Immunol 143(2):706-711). Основываясь на данных от определенных полиморфных семейств генов VH человека, некоторые исследователи предположили, что разнообразие гаплотипов в зародышевой линии вносит основной вклад в неоднородность генов VH в человеческой популяции, что отражается в большом разнообразии различных генов VH зародышевой линии в человеческой популяции (смотрите, Sasso et al., 1990, Prevalence and Polymorphism of Human VH3 Genes, J. Immunol. 145(8):2751-2757).

Хотя человеческая популяция отображает большое разнообразие гаплотипов по отношению к репертуару генов VH благодаря широко распространенному полиморфизму, определенные полиморфизмы отражаются в преобладающих (т.е. консервативных) аллелях, наблюдаемых в человеческой популяции (Sasso et al., 1990). Полиморфизм VH может быть описан в двух основных формах. Первая представляет собой вариацию, вытекающую из вариации аллелей, связанной с различиями в нуклеотидной последовательности между аллелями одного и того же генного сегмента. Вторая вытекает из многочисленных дубликатов, вставок и/или удалений, которые произошли в локусе тяжелой цепи иммуноглобулина. Это привело к уникальной ситуации, в которой гены VH, полученные путем дублирования из идентичных генов, отличаются от их соответствующих аллелей одной или несколькими нуклеотидными заменами. Это также напрямую влияет на количество копий генов VH в локусе тяжелой цепи.

Полиморфные аллели вариабельных генных сегментов тяжелой цепи иммуноглобулина человека (гены VH) в значительной степени были результатом вставки/удаления генных сегментов и единственных нуклеотидных различий в кодирующих областях, оба из которых потенциально могут иметь функциональные последствия на молекулу иммуноглобулина. В таблице 1 представлены функциональные гены VH, перечисленные по семейству генов VH человека и количеству идентифицированных аллелей для каждого гена VH в локусе тяжелой цепи иммуноглобулина человека. Существуют некоторые данные, чтобы сделать предположение о том, что полиморфные гены VH были вовлечены в чувствительность к таким определенным заболеваниям, как, например, ревматоидный артрит, в то время как в других случаях связь между VH и заболеванием была менее ясна. Эта неоднозначность была приписана числу копий и присутствию различных аллелей в различных популяциях человека. На самом деле, несколько генов VH человека демонстрируют вариации числа копий (например, VH1-2, VH1-69, VH2-26, VH2-70 и VH3-23). Согласно различным вариантам осуществления описанные в настоящем документе гуманизированные мыши с ограниченными репертуарами VH содержат множественные полиморфные варианты отдельного представителя семейства VH (например, два или более полиморфных вариантов VH1-2, VH1-69, VH2-26, VH2-70 или VH3-23, замещая все или по существу все функциональные сегменты VH мыши в эндогенном локусе мыши). Согласно конкретному варианту осуществления два или более полиморфных варианта описанных в настоящем документе мышей находятся в количестве вплоть до и включая в себя число, указанное для соответствующего представителя семейства VH в таблице 1 (например, для VH1-69, 13 вариантов; для VH1-2, пять вариантов; и т.д.).

Обычно наблюдаемые варианты определенных генов VH человека известны в настоящей области техники. Например, один из наиболее сложных полиморфизмов в локусе VH принадлежит гену VH1-69. Ген VH1-69 человека содержит 13 известных аллелей (Sasso et al., 1993, A fetally expressed immunoglobulin VH1 gene belongs to a complex set of alleles, Journal of Clinical Investigation 91:2358-2367; Sasso et al., 1996, Expression of the immunoglobulin VH gene 51p1 is proportional to its germline gene copy number, Journal of Clinical Investigation 97(9):2074-2080) и существует по меньшей мере в трех гаплотипах, которые несут дубликаты гена VH1-69, что приводит к множественным копиям гена VH в данном локусе. Эти полиморфные аллели включают в себя различия в определяющих комплементарность областях (CDR), которые могут существенно влиять на антигенную специфичность. В таблице 2 представлены известные аллели для VH1-69 человека и для VH1-2 человека и SEQ ID NO для последовательностей ДНК и белка зрелых вариабельных областей тяжелой цепи.

Репрезентативные последовательности геномной ДНК и полноразмерного белка гена VH1-69 представлены в SEQ ID NO: 4 и SEQ ID NO: 5, соответственно. На фиг. 5 и фиг. 6 представлены выравнивания ДНК и белка тринадцати известных аллелей VH1-69, соответственно. Репрезентативные последовательности ДНК и белка гена VH1-2 представлены в SEQ ID NO: 63 и SEQ ID NO: 64, соответственно. На фиг. 8 и фиг. 9 представлены выравнивания ДНК и белка пяти известных аллелей VH1-2, соответственно. На фиг. 7 и фиг. 10 представлена идентичность в процентах/сходство матрицы в процентах для подвергнутых выравниванию белковых последовательностей, соответствующих тринадцати известным аллелям VH1-69 человека и пяти известным аллелям VH1-2 человека, соответственно. Согласно различным вариантам осуществления модифицированный локус согласно изобретению содержит ген VH, выбранный из таблицы 1, присутствующий в двух или более числе копий, причем число копий включает в себя вплоть до и включая в себя число аллелей, представленное в таблице 1. Согласно одному варианту осуществления модифицированный локус согласно настоящему изобретению содержит ген VH1-69 или VH1-2, выбранный из таблицы 2, присутствующий в двух или более числе копий, причем число копий включает в себя вплоть до и включая в себя число аллелей, представленное в таблице 1.

Антиген-зависимое использование вариабельных генов тяжелой цепи

Антиген-зависимое преимущественное использование генов VH может быть использовано в разработке терапевтических средств для людей, направленных на клинически значимые антигены. Способность производить репертуар вариабельных доменов антител с использованием конкретного гена VH может обеспечить значительное преимущество в поиске высокоаффинных вариабельных доменов антител для использования в терапевтических средствах для людей. Исследования, касающиеся частоты использования гена VH наивной мыши и человека в вариабельных доменах антител показывают, что большинство вариабельных доменов тяжелой цепи не происходят от любого определенного единственного или преимущественно используемого гена VH. С другой стороны, исследования ответа антител на определенные антигены показывают, что в некоторых случаях определенный ответ антитела отображает смещенное использование определенного гена VH в репертуаре В-клеток после иммунизации.

Хотя репертуар VH человека довольно разнообразен, по некоторым оценкам ожидаемая частота использования любого данного гена VH, предполагая случайный выбор генов VH, составляет приблизительно 2% (Brezinschek et al., 1995, Analysis of the Heavy Chain Repertoire of Human Peripheral В Cells Using Single-Cell Polymerase Chain Reaction, J. Immunol. 155:190-202). Но использование VH в периферических В-клетках у людей искажается. Согласно одному исследованию функциональное изобилие генов V соответствует схеме VH3>VH4>VH1>VH2>VH5>VH6 (Davidkova et al., 1997, Selective Usage of VH Genes in Adult Human Lymphocyte Repertoires, Scand. J. Immunol. 45:62-73). Одно из ранних исследований показало, что частота использования семейства VH3 была приблизительно 0,65, в то время как частота использования семейства VH1 была приблизительно 0,15; эти и другие наблюдения показывают, что сложность зародышевой линии репертуара VH человека не точно отражена в компартменте периферической В-клетки у людей, имеющих нормальный репертуар VH зародышевой линии, ситуация, которая близка с наблюдаемой у мыши, т.е. экспрессия гена VH нестохастическая (Zouali and These, 1991, Probing VH Gene-Family Utilization in Human Peripheral В Cells by In Situ Hybridization, J. Immunol. 146(8):2855-2864). Согласно одному сообщению частота использования гена VH у людей, от наибольшей к наименьшей представляет собой VH3>VH4>VH1>VH5>VH2>VH6; реаранжировки в периферических В-клетках, показывают, что частота использования семейства VH3 выше, чем можно ожидать, основываясь на относительном числе генов VH3 зародышевой линии (Brezinschek et al., 1995). Согласно другому сообщению частота использования VH у человека соответствует схеме VH3>VH5>VH2>VH1>VH4>VH6, основанной на анализе периферийных небольших иммунокомпетентных В-клеток, активированных митогеном лаконоса (Davidkova et al., 1997, Selective Usage of VH Genes in Adult Human Lymphocyte Repertoires, Scand. J. Immunol. 45:62-73). В одном из докладов утверждается, что среди наиболее часто используемых представителей семейства VH3 находятся 3-23, 3-30 и 3-54 (Brezinschek et al., 1995). В семействе VH4 представитель 4-59 и 4-4b обнаруживались относительно более часто (там же), а также 4-39 и 4-34 (Brezinscheck et al., 1997, Analysis of the Human VH Gene Repertoire, J. Clin. Invest. 99(10):2488-2501). Другие утверждают, что активированный репертуар тяжелой цепи искажен в пользу высокой экспрессии VH5 и более низкой экспрессии VH3 (Van Dijk-Hard and Lundkvist, 2002, Long-term kinetics of adult human antibody repertoires, Immunology 107:136-144). Другие исследования утверждают, что к наиболее часто используемым генам VH в репертуаре взрослого человека относится VH4-59, а затем VH3-23 и VH3-48 (Arnaout et al., 2001, High-Resolution Description of Antibody Heavy-Chain Repertoires in Humans, PLoS ONE 6(8):108). Хотя исследования частоты использования основаны на относительно небольшом количестве образцов, следовательно, проявляют высокую дисперсию, обобщенно исследования показывают, что экспрессия V гена не представляет собой чисто стохастический процесс. Более того, исследования с определенными антигенами установили, что в некоторых случаях происходит искажение против определенных частот использования и в пользу других.

Со временем стало очевидно, что наблюдаемый репертуар вариабельных доменов тяжелой цепи человека, созданных в ответ на определенные антигены, сильно ограничен. Некоторые антигены связаны почти исключительно с нейтрализующими антителами, содержащими только определенные конкретные гены VH, в том смысле, что эффективные нейтрализующие антитела получают, по сути, только из одного гена VH. Так обстоит дело в отношении ряда клинически важных патогенов человека.

Были обнаружены производные VH1-69 тяжелых цепей в различных репертуарах антигенспецифических антител терапевтического значения. Например, VH1-69 часто наблюдались в транскриптах тяжелых цепей репертуара IgE лимфоцитов периферической крови у детей раннего возраста с атопическим заболеванием (Bando et al., 2004, Characterization of VHS gene expressed in PBL from children with atopic diseases: detection of homologous VH1-69 derived transcripts from three unrelated patients, Immunology Letters 94:99-106). Производные VH1-69 тяжелых цепей с высокой степенью соматической гипермутации также встречаются в В-клетках лимфомы (Perez et al., 2009, Primary cutaneous B-cell lymphoma is associated with somatically hypermutated immunoglobulin variable genes and frequent use of VH1-69 and VH4-59 segments, British Journal of Dermatology 162:611-618), в то время как некоторые производные VH1-69 тяжелых цепей с существенными последовательностями зародышевой линии (т.е. практически без соматической гипермутации) были обнаружены среди аутоантител у пациентов с заболеваниями крови (Pos et al., 2008, VH1-69 germline encoded antibodies directed towards ADAMTS13 in patients with acquired thrombotic thrombocytopenic purpura, Journal of Thrombosis and Haemostasis 7:421-428).

Кроме того, были найдены нейтрализующие антитела против таких вирусных антигенов, как ВИЧ, грипп и гепатит С (ВГС), чтобы использовать последовательности, полученные из VH1-69 зародышевой линии и/или соматически мутированные (Miklos et al., 2000, Salivary gland mucosa-associated lymphoid tissue lymphoma immunoglobulin VH genes show frequent use of V1-69 with distinctive CDR3 features, Blood 95(12):3878-3884; Kunert et al., 2004, Characterization of molecular features, antigen-binding, and in vitro properties of IgG and IgM variants of 4E10, an anti-HIV type I neutralizing monoclonal antibody, Aids Research and Human Retroviruses 20(7):755-762; Chan et al., 2001, VH1-69 gene is preferentially used by hepatitis С virus-associated В cell lymphomas and by normal В cells responding to the E2 viral antigen, Blood 97(4):1023-1026; Carbonari et al., 2005, Hepatitis С virus drives the unconstrained monoclonal expansion of VH1-69-expressing memory В cells in type II cryoglobulinemia: A model of infection-driven lymphomagenesis, Journal of Immunology 174:6532-6539; Wang and Palese, 2009, Universal epitopes of influenza virus hemagglutinins?, Nature Structural & Molecular Biology 16(3):233-234; Sui et al., 2009, Structural and functional bases for broad-spectrum neutralization of avian and human influenza A viruses, Nature Structural & Molecular Biology 16(3):265-273; Marasca et al., 2001, Immunoglobulin Gene Mutations and Frequent Use of VH1-69 and VH4-34 Segments in Hepatitis С Virus-Positive and Hepatitis С Virus-Negative Nodal Marginal Zone B-Cell Lymphoma, Am. J. Pathol. 159(1):253-261).

Искажение частоты использования VH наблюдается также в гуморальном иммунном ответе на гемофильные инфекции типа В (Hib PS) у людей. Исследования показывают, что семейство VHIII (подсемейство VHIIIb, в частности, VH9.1) характеризует исключительно гуморальный ответ человека на Hib PS, с разнообразными генами D и J (Adderson et al., 1991, Restricted Ig H Chain V Gene Usage in the Human Antibody Response to Haemophilus influenzae Type b Capsular Polysaccharide, J. Immunol. 147(5): 1667-1674; Adderson et al., 1993, Restricted Immunoglobulin VH Usage and VDJ Combinations in the Human Response to Haemophilus influenzae Type b Capsular Polysaccharide, J. Clin. Invest. 91:2734-2743). Гены JH человека также отображают искаженную частоту использования; JH4 и JH6 наблюдаются приблизительно в 38-41% в периферических В-клетках у людей (Brezinschek et al., 1995).

Частота использование VH у ВИЧ-1-инфицированных людей искажена относительно использования VH3 и в пользу семейств генов VH1 и VH4 (Wisnewski et al., 1996, Human Antibody Variable Region Gene Usage in HIV-1 Infection, J. Acquired Immune Deficiency Syndromes & Human Retroviology 11(1):31-38). Однако анализ кДНК костного мозга от инфицированных пациентов показал значительное использование VH3, не экспрессированных в функциональном репертуаре В-клеток, где Fab, отражающие использование VH3, проявляли эффективную нейтрализацию ВИЧ-1 in vitro (там же). Можно предположить, что гуморальный иммунный ответ на ВИЧ-1 инфекцию, возможно, ослабляется вследствие ограничения VH; описанные в настоящем документе не относящиеся к человеку модифицированные животные (не инфицированные ВИЧ-1), могут быть таким образом полезны для получения доменов нейтрализующих антител, полученных из определенных генов VH, присутствующих у описанных в настоящем документе генетически модифицированных животных, но полученных из разных генов VH, чем наблюдаемые в ограниченном репертуаре инфицированных людей.

Таким образом, способность производить высокоаффинные вариабельные домены антител человека у ограниченных по VH мышей, например, (ограниченный, например, представителем семейства VH3 и его полиморфом (полиморфами)) иммунизированных ВИЧ-1, может предусматривать богатый источник для разработки эффективных терапевтических средств для людей, нейтрализующих ВИЧ-1, путем получения ограниченного (например, ограниченный представителем семейства VH3 и его полиморфы (полиморф)) репертуара такой иммунизированной мыши.

Ограничение ответа человеческого антитела на определенные патогены может снижать вероятность получения вариабельных областей антител от инфицированных людей, которые могут служить трамплинами для разработки высокоаффинных нейтрализующих антител против патогена. Например, иммунный ответ человека на инфекцию ВИЧ-1 клонально ограничен по всем инфекциям ВИЧ-1 и в развитии СПИДа (Muller et al., 1993, B-cell abnormalities in AIDS: stable and clonally restricted antibody response in HIV-1 infection, Scand. J. Immunol. 38:327-334; Wisnewski et al., 1996). Кроме того, гены VH вообще не присутствуют во всех полиморфных формах у индивидуумов; определенные индивидуумы в определенных популяциях обладают одним вариантом, в то время как индивидуумы в других популяциях обладают другим вариантом. Таким образом, наличие биологической системы, которая ограничена одним геном VH и его вариантами будет согласно различным вариантам осуществления предусматривать до сих пор неиспользованный источник разнообразия для производства вариабельных областей антител (например, тяжелые и легкие когнатные домены человека) на основе ограниченного гена VH.

Генетически модифицированные мыши, которые экспрессируют вариабельные области тяжелой цепи человека с ограниченным использованием генного сегмента VH, применимы для получения относительно большого репертуара разнообразия множественности сегментов J, комбинаторного разнообразия и соматически мутированных высокоаффинных вариабельных областей тяжелой цепи иммуноглобулина человека от иначе ограниченного репертуара. В указанном случае ограниченный репертуар относится к заранее определенному ограничению в генах зародышевой линии, что приводит к невозможности образовать у мыши реаранжированный ген тяжелой цепи, который происходит от любого гена V, кроме предварительно выбранного гена V. Согласно вариантам осуществления которые используют предварительно выбранный ген V, но не предварительно выбранный ген D и/или ген J, репертуар ограничен по отношению к идентичности гена V, но не гена D и/или J. Идентичность предварительно выбранного гена V (и любого предварительно выбранного гена D и/или J) не ограничивается каким-либо конкретным геном V.

Разработка такой мыши, которая реаранжировала бы единственный ген VH (присутствует в виде единственного сегмента или набора вариантов) с различными генными сегментами D и J человека (например, сегментами DH и JH) предусмотрен механизм перестановки in vivo разнообразия множественности сегментов J/комбинаторного разнообразия/соматической гипермутации, которая может быть использована для повторения мутаций в полученных в результате реаранжированных последовательностях вариабельной области тяжелой цепи (например, в зависимости от обстоятельств может быть V/D/J или V/J). У такой мыши процесс клональной селекции работает для выбора подходящих вариабельных областей, которые связывают представляющий интерес антиген, основанные на единственном заранее выбранном гене VH (или его вариантах). Поскольку компоненты клональной селекции мыши предназначены для селекции, основанной на единственном предварительно выбранном генном сегменте VH, фоновый шум в значительной степени ликвидирован. С помощью правильного отбора генного сегмента VH относительно большее число клонально отобранных антигенспецифических антител может быть подвергнуто скринингу в течение более короткого периода времени, чем с помощью мыши с большим разнообразием сегментов V.

Предварительный отбор и ограничение мыши по единственному сегменту V предусматривает систему для перестановки множественности сегментов V/D/J со скоростью, которая согласно различным вариантам осуществления выше, чем наблюдаемая у мышей, которые иначе должны рекомбинировать до 40 или более сегментов V с областей D и J. Удаление других сегментов V освобождает локус для образования большего количества комбинаций V/D/J для предварительно выбранного сегмента V, чем иначе наблюдается. Увеличенное число транскриптов, к которым приводит рекомбинация предварительно выбранного V с одним из множества сегментов D и одним из множества сегментов J, будет поддерживать эти транскрипты в системе клональной селекции в виде пре-В клеток, и система клональной селекции, таким образом, предназначена для циклирования В-клеток, которые экспрессируют предварительно выбранную область V. Таким образом, более уникальные области V, полученные от предварительно выбранного сегмента V, могут быть подвергнуты скринингу организмом, чем это было бы возможно в ином случае в заданный промежуток времени.

Согласно различным аспектах описываются мыши, которые повышают разнообразие множественности сегментов рекомбинаций V/D для предварительно выбранной области V, потому что все или по существу все рекомбинации в вариабельном локусе тяжелой цепи иммуноглобулина будут в предварительно выбранном сегменте V и сегментах D и J, которые помещены в таких мышах. Таким образом, мыши предусматривают способ получения разнообразия сегментов CDR3 с использованием основания или ограниченного репертуара генов VH.

Геномная локализация и функция ADAM6 мыши

Самцы мышей, которые не характеризуются способностью к экспрессии какого-либо функционального белка ADAM6, неожиданно проявляют дефект в своей способности спариваться и производить потомство. Мыши не обладают способностью экспрессировать функциональный белок ADAM6 вследствие замещения всех или по существу всех генных сегментов вариабельной области иммуноглобулина мыши генными сегментами вариабельной области человека. В результате этого происходит потеря функции ADAM6, поскольку локус ADAM6 расположен в пределах области эндогенного генного локуса вариабельной области тяжелой цепи иммуноглобулина мыши, ближайшего к 3' концу локуса генного сегмента VH, который расположен выше относительно генных сегментов DH. Разведение мышей, которые являются гомозиготными в отношении замещения всех или по существу всех эндогенных вариабельных последовательностей тяжелой цепи мыши ограниченной последовательностью тяжелой цепи человека, как правило, представляет собой трудоемкий подход для спаривания самцов и самок, каждый из которых является гомозиготным в отношении ограниченной последовательности тяжелой цепи человека, и ожидания продуктивного спаривания. Частота и размер успешных пометов являются низкими. Вместо этого, самцы, гетерозиготные в отношении ограниченной последовательности тяжелой цепи человека, использовались для спаривания с самками, гомозиготными в отношении замещения, для создания потомства, которое является гетерозиготным в отношении ограниченной последовательности тяжелой цепи человека, затем выводя из него гомозиготную мышь. Авторы настоящего изобретения показали, что вероятной причиной потери фертильности у самцов мышей является отсутствие у гомозиготных самцов мышей функционального белка ADAM6.

Согласно различным аспектам самцы мышей, которые содержат поврежденный (т.е. нефункциональный или незначительно функциональный) ген ADAM6, проявляют снижение или устранение фертильности. Поскольку у мышей (и других грызунов) ген ADAM6 расположен в локусе тяжелой цепи иммуноглобулина, авторы настоящего изобретения определили, что для того чтобы воспроизвести мышей или создать и поддержать линию мышей, которые содержат гуманизированный локус тяжелой цепи иммуноглобулина, использовали различные модифицированные схемы скрещивания или размножения. Низкая фертильность, или стерильность, самцов мышей, гомозиготных в отношении гуманизированного вариабельного генного локуса тяжелой цепи иммуноглобулина затрудняет поддержание такой модификации в линии мыши. Согласно различным вариантам осуществления сохранение линии предусматривает устранение проблем со стерильностью, которые проявляют самцы мышей, гомозиготные в отношении гуманизированного локуса тяжелой цепи.

Согласно одному аспекту предусмотрен способ поддержания линии описанной в настоящем документе мыши. Линия мыши может не содержать эктопическую последовательность ADAM6, и согласно различным вариантам осуществления линия мыши является гомозиготным или гетерозиготным в отношении нокаута (например, функционального нокаута) ADAM6.

Линия мыши содержит модификацию эндогенного локуса тяжелой цепи иммуноглобулина, которая приводит к снижению или потере фертильности у самца мыши. Согласно одному варианту осуществления модификация предусматривает делецию регуляторной области и/или кодирующей области гена ADAM6. Согласно конкретному варианту осуществления модификация предусматривает модификацию эндогенного гена ADAM6 (регуляторной и/или кодирующей области), которая снижает или устраняет фертильность самца мыши, который содержит модификацию; согласно конкретному варианту осуществления модификация снижает или устраняет фертильность самца мыши, который является гомозиготным в отношении модификации.

Согласно одному варианту осуществления линия мыши является гомозиготным или гетерозиготным в отношении нокаута (например, функционального нокаута) или делеции гена ADAM6.

Согласно одному варианту осуществления линию мыши поддерживают путем выделения из мыши, которая является гомозиготной или гетерозиготной в отношении модификации, клетки, и использование донорной клетки в зародыше-хозяине и вынашивание зародыша-хозяина и донорной клетки в суррогатной матери и получение от суррогатной матери потомства, которое содержит генетическую модификацию. Согласно одному варианту осуществления донорная клетка представляет собой ES клетку. Согласно одному варианту осуществления донорная клетка представляет собой плюрипотентную клетку, например, индуцированную плюрипотентную клетку.

Согласно одному варианту осуществления линию мыши поддерживают путем выделения из мыши, которая является гомозиготной или гетерозиготной в отношении модификации, последовательности нуклеиновой кислоты, содержащей модификацию, и введение последовательности нуклеиновой кислоты в ядро-хозяина и вынашивание клетки, содержащей последовательность нуклеиновой кислоты и ядро-хозяин в подходящем животном. Согласно одному варианту осуществления последовательность нуклеиновой кислоты вводят в зародыш из ооцита-хозяина.

Согласно одному варианту осуществления линию мыши поддерживают путем выделения из мыши, которая является гомозиготной или гетерозиготной в отношении модификации, ядра и введение ядра в клетку-хозяин, и вынашивание ядра и клетки-хозяина в подходящем животном для получения потомства, которое является гомозиготным или гетерозиготным в отношении модификации.

Согласно одному варианту осуществления линию мыши поддерживают путем использования оплодотворения in vitro (IVF) самки мыши (дикого типа, гомозиготной в отношении модификации или гетерозиготной в отношении модификации), используя сперму от самца мыши, содержащего генетическую модификацию. Согласно одному варианту осуществления самец мыши является гетерозиготным в отношении генетической модификации. Согласно одному варианту осуществления самец мыши является гомозиготным в отношении генетической модификации.

Согласно одному варианту осуществления линию мыши поддерживают путем скрещивания самца мыши, который является гетерозиготным в отношении генетической модификации, с самкой мыши для получения потомства, которое содержит генетическую модификацию, идентификации мужского и женского потомства, содержащего генетическую модификацию, и использования самца, который является гетерозиготным в отношении генетической модификации, в скрещивании с самкой, которая относится к дикому типу, является гомозиготной или гетерозиготной в отношении генетической модификации, для получения потомства, содержащего генетическую модификацию. Согласно одному варианту осуществления стадию скрещивания самца, гетерозиготного в отношении генетической модификации, с самкой дикого типа, самкой, гетерозиготной в отношении генетической модификации, или самкой, гомозиготной в отношении генетической модификации, повторяют для поддержания генетической модификации в линии мыши.

Согласно одному аспекту предусмотрен способ поддержания линии мыши, который предусматривает замещение эндогенного вариабельного генного локуса тяжелой цепи иммуноглобулина одним или несколькими последовательностями тяжелой цепи иммуноглобулина человека, предусматривая скрещивание линии мыши так, чтобы создать гетерозиготных самцов мышей, причем гетерозиготных самцов мышей скрещивают для поддержания генетической модификации в линии. Согласно конкретному варианту осуществления линию не поддерживают путем какого-либо скрещивания гомозиготного самца с самкой дикого типа или самкой, гомозиготной или гетерозиготной в отношении генетической модификации.

Белок ADAM6 представляет собой представителя семейства белков дизинтегринов и металлопротеаз (ADAM), которое представляет собой большое семейство белков с разнообразными функциями, включающими в себя клеточную адгезию. Некоторые представители семейства ADAM вовлечены в сперматогенез и оплодотворение. Например, ADAM2 кодирует субъединицу белка фертилина, который вовлечен во взаимодействия сперматозоидов и яйцеклетки. ADAM3, или циритестин, оказывается необходимым для связывания сперматозоида с вителлиновым слоем. Отсутствие или ADAM2, или ADAM3 приводит к стерильности. Предположили, что ADAM2, ADAM3 и ADAM6 формируют комплекс на поверхности мышиных сперматозоидов. Ген - эквивалент человека (ADAM6 человека), в норме встречающийся между генными сегментами VH человека VH1-2 и VH6-1 в локусе тяжелой цепи иммуноглобулина человека, вероятно, представляет собой псевдоген. У мышей существуют два гена ADAM6 - ADAM6a и ADAM6b - которые встречаются в межгенной области между генными сегментами VH и DH мышь, и у мыши гены ADAM6a и ADAM6b ориентированы в транскрипционной ориентации, противоположной ориентации транскрипции окружающих иммуноглобулиновых генных сегментов. У мышей функциональный локус ADAM6 очевидно необходим для нормального оплодотворения. Функциональный локус или последовательность ADAM6, затем относится к локусу или последовательности ADAM6, которая может дополнить или восстановить резко сниженное оплодотворение, демонстрируемое самцами мышей с утраченными или нефункциональными эндогенными локусами ADAM6.

Положение межгенной последовательности у мышей, которая кодирует ADAM6a и ADAM6b, делает межгенную последовательность подверженной модификации при модификации эндогенной тяжелой цепи мыши. Когда генные сегменты VH подвергаются делеции или замещаются или когда генные сегменты DH подвергаются делеции или замещаются, существует высокая вероятность того, что полученная мышь будет проявлять тяжелую недостаточность фертильности. Для компенсации этой недостаточности мышь модифицируют, чтобы включить в нее нуклеотидную последовательность, которая кодирует белок, который будет дополнять потерю активности ADAM6 вследствие модификации эндогенного локуса ADAM6 мыши. Согласно различным вариантам осуществления дополняющая нуклеотидная последовательность представляет собой такую, которая кодирует мышиный ADAM6a, мышиный ADAM6b или его гомолог или ортолог или функциональный фрагмент, который восстанавливает недостаточность фертильности. Альтернативно, могут использоваться подходящие способы для сохранения эндогенного локуса ADAM6, при это делая эндогенные последовательности тяжелой цепи иммуноглобулина, фланкирующие локус ADAM6 мыши, неспособными к реаранжировке, чтобы кодировать функциональную эндогенную вариабельную область тяжелой цепи. Иллюстративные альтернативные способы включают в себя манипуляцию с большими частями хромосом мыши, которые располагают эндогенные локусы вариабельной области тяжелой цепи иммуноглобулина таким образом, что они являются неспособными к реаранжировке, чтобы кодировать функциональную вариабельную область тяжелой цепи, которая функционально связана с эндогенным константным геном тяжелой цепи. Согласно различным вариантам осуществления способы предусматривают вставки и/или транслокации хромосомных фрагментов мыши, содержащих эндогенные генные сегменты тяжелой цепи иммуноглобулина.

Нуклеотидная последовательность, которая восстанавливает фертильность, может быть расположена в любом подходящем положении. Она может быть расположена в межгенной области или в любом подходящем положении в геноме (т.е., эктопически). Согласно одному варианту осуществления нуклеотидная последовательность может быть введена в трансген, который случайным образом интегрирован в геном мыши. Согласно одному варианту осуществления последовательность может храниться эписомно, то есть на отдельной нуклеиновой кислоте, а не на хромосоме мыши. Подходящие положения предусматривают положения, которые являются транскрипционно пермиссивными или активными, например, локус ROSA26 (Zambrowicz et al., 1997, PNAS USA 94:3789-3794), локус BT-5 (Michael et al., 1999, Meek Dev. 85:35-47), или локус Oct4 (Wallace et al., 2000, Nucleic Acids Res. 28:1455-1464). Нацеливание нуклеотидных последовательностей на транскрипционно активные локусы описаны, например, в патенте США №7473557.

Альтернативно нуклеотидная последовательность, которая восстанавливает фертильность, может быть соединена с индуцируемым промотором так, чтобы облегчать оптимальную экспрессию в соответствующих клетках и/или тканях, например, репродуктивных тканях. Иллюстративные индуцируемые промоторы включают в себя промоторы, активируемые физическими (например, промотор теплового шока) и/или химическими средствами (например, IPTG или тетрациклином).

Кроме того, экспрессия нуклеотидной последовательности может быть ассоциирована с другими генами так, чтобы достичь экспрессии на конкретной стадии развития или в специфических тканях. Такая экспрессия может быть достигнута путем помещения нуклеотидной последовательности в функциональной связи с промотором гена, экспрессируемого на конкретной стадии развития. Например, последовательности иммуноглобулина от одного вида, сконструированные в геноме вида-хозяина, помещают в функциональной связи с промоторной последовательностью гена CD19 (специфический для В-клеток ген) от вида-хозяина. Достигается специфическая для В-клеток экспрессия на точно определенных стадиях развития при экспрессии иммуноглобулинов.

Еще один способ достижения устойчивой экспрессии вставленной нуклеотидной последовательности предусматривает использование конститутивного промотора. Иллюстративные конститутивные промоторы включают в себя SV40, CV, UBC, EF1A, PGK и CAGG. Аналогичным образом, требуемая нуклеотидная последовательность располагают в функциональной связи с выбранным конститутивным промотором, что обеспечивает высокий уровень экспрессии белка(ов), кодируемого(ых) нуклеотидной последовательностью.

Предусмотрено, что термин "эктопический" включает в себя перемещение или размещение в положении, которое в норме не встречается в природе (например, размещение последовательности нуклеиновой кислоты в положении, которое не является аналогичным положением, в котором последовательность нуклеиновой кислоты встречается у мыши дикого типа). Термин согласно различным вариантам осуществления используется в том смысле, что его объект находится за пределами его нормального, или правильного, положения. Например, фраза "эктопическая нуклеотидная последовательность, кодирующая…" относится к нуклеотидной последовательности, которая находится в положении, в котором она не встречается в норме у мыши. Например, в случае эктопической нуклеотидной последовательности, кодирующей белок ADAM6 мыши (или ее ортолога или гомолога или фрагмента, который обеспечивает такое же или сходное улучшение фертильности у самцов мышей), последовательность может быть расположена в положении в геноме мыши, которое отличается от встречающегося в норме у мыши дикого типа. В таких случаях, новые участки соединения последовательности для последовательности мыши будут создаваться путем помещения последовательности в положение в геноме мыши, отличное от такового у мыши дикого типа. Функциональный гомолог или ортолог ADAM6 мыши представляет собой последовательность, которая обеспечивает восстановление потери фертильности (например, потери способности самца мыши давать потомство путем спаривания), которая наблюдается у мыши ADAM6-/-. Функциональные гомологи или ортологи предусматривают белки, которые характеризуются по меньшей мере приблизительно 89% идентичности или более, например, до 99% идентичности, с аминокислотной последовательностью ADAM6a и/или с аминокислотной последовательностью ADAM6b, и которые могут дополнять или восстанавливать способность успешно спариваться у мыши, характеризующейся фенотипом, который содержит делецию или нокаут ADAM6a и/или ADAM6b.

Эктопическое положение может находиться где-либо (например, как в случае случайной вставки трансгена, содержащего последовательность ADAM6 мыши), или может находиться, например, в положении, которое приблизительно соответствует (но не является точно таким же как) его расположению у мыши дикого типа (например, в модифицированном эндогенном локусе иммуноглобулина мыши, но или выше, или ниже в отношении хода транскрипции относительно его естественного положения, например, в пределах модифицированного локуса иммуноглобулина, но между различными генными сегментами, или в другом положении в V-D межгенной последовательности мыши). Один пример эктопического размещения представляет собой поддержание положения, встречающегося в норме у мышей дикого типа в пределах эндогенного локуса тяжелой цепи иммуноглобулина, при этом делая окружающие эндогенные генные сегменты тяжелой цепи неспособными к реаранжировке, чтобы кодировать функциональную тяжелую цепь, содержащую эндогенную константную область тяжелой цепи. Согласно описанному примеру, это можно осуществить путем инверсии хромосомного фрагмента, содержащего эндогенные вариабельные локусы тяжелой цепи иммуноглобулина, например с использованием сконструированных сайтов сайт-специфической рекомбинации, помещенных в положениях, фланкирующих локус вариабельной области. Таким образом, при рекомбинации эндогенные локусы вариабельной области тяжелой цепи помещаются на большом расстоянии от эндогенных генов константной области тяжелой цепи, тем самым предотвращая реаранжировку для кодирования функциональной тяжелой цепи, содержащей эндогенную константную область тяжелой цепи. Другие иллюстративные способы для достижения функционального сайленсинга эндогенного вариабельного генного локуса тяжелой цепи иммуноглобулина при сохранении функционального локуса ADAM6 будут очевидными специалистам в настоящей области техники при прочтении настоящего раскрытия и/или в комбинации с известными в настоящей области техники способами. При таком размещении эндогенного локуса тяжелой цепи эндогенные гены ADAM6 сохраняются, и эндогенный локус тяжелой цепи иммуноглобулина является функционально выключенным.

Другой пример эктопического размещения представляет собой размещение в пределах гуманизированного локуса тяжелой цепи иммуноглобулина. Например, мышь, содержащая замещение одного или нескольких эндогенных генных сегментов VH единственным генным сегментом VH человека, причем замещение удаляет эндогенную последовательность ADAM6, может быть сконструирована так, чтобы содержать последовательность ADAM6 мыши, расположенную в пределах межгенной последовательности, которая находится между единственным генным сегментом VH человека и генным сегментом DH человека. Другой пример эктопического размещения представляет собой размещение последовательности ADAM6 мыши в положении 5' (относительно направления транскрипции единственного генного сегмента VH человека) относительно генного сегмента VH человека. Положение 5' относительно единственного генного сегмента VH человека может располагаться очень близко, например, на расстоянии от нескольких сотен пар нуклеотидов до нескольких тысяч пар нуклеотидов, или далеко, например, на расстоянии от нескольких тысяч пар нуклеотидов до сотен тысяч пар нуклеотидов или даже миллиона пар нуклеотидов или больше, относительно генного сегмента VH человека. Полученная модификация создаст (эктопическую) последовательность ADAM6 мышь в пределах или смежно, или даже на той же хромосоме, с генной последовательностью человека, и (эктопическое) размещение последовательности ADAM6 мышь в пределах генной последовательности человека может приблизительно соответствовать положению последовательности ADAM6 мыши (т.е. в пределах межгенной области V-D). Полученные точки соединения последовательностей, созданные путем соединения (эктопической) последовательности ADAM6 мыши в пределах или смежно с генной последовательностью человека (например, генной последовательностью иммуноглобулин) в пределах зародышевой линии мыши, будут новыми по сравнению с таким же или сходным положением в геноме мыши дикого типа.

Согласно различным вариантам осуществления предусмотрены не относящиеся к человеку животные, у которых отсутствует ADAM6 или его ортолог или гомолог, причем отсутствие делает не относящегося к человеку животного стерильным или по существу снижает фертильность не относящегося к человеку животного. Согласно различным вариантам осуществления отсутствие ADAM6 или его ортолога или гомолога обусловлено модификацией эндогенного локуса тяжелой цепи иммуноглобулина. Существенное снижение фертильности, например, представляет собой снижение фертильности (например, частоты скрещивания, количества детенышей на помет, количества пометов в год и т.д.) приблизительно на 50%, 60%, 70%, 80%, 90% или 95% или больше. Согласно различным вариантам осуществления не относящимся к человеку животным добавляют ген ADAM6 мыши или его ортолог или гомолог или функциональный фрагмент, который является функциональным у самца не относящегося к человеку животного, причем добавленный ген ADAM6 или его ортолог или гомолог или функциональный фрагмент восстанавливает снижение фертильности полностью или существенную ее часть. Восстановление существенной части фертильности представляет собой, например, такое восстановление фертильности, что не относящееся к человеку животное проявляет фертильность, которая составляет по меньшей мере 70%, 80% или 90% или больше по сравнению с немодифицированным (т.е. животное без модификации гена ADAM6 или его ортолога или гомолога) локусом тяжелой цепи.

Последовательность, которая обеспечивает генетически модифицированное животное (т.е. животное, которое не содержит функциональный ADAM6 или его ортолог или гомолог, вследствие, например, модификации локуса тяжелой цепи иммуноглобулина), согласно различным вариантам осуществления выбрана из гена ADAM6 или его ортолога или гомолога. Например, у мыши потеря функции ADAM6 восстанавливается путем добавления согласно одному варианту осуществления гена ADAM6 мыши. Согласно одному варианту осуществления потеря функции ADAM6 у мыши восстанавливается путем добавления ортолога или гомолога близкокогнатных видов по отношению к мыши, например, грызуна, например, мыши другой линии или вида, крысы любого вида, грызуна; причем добавление мыши ортолога или гомолога восстанавливает потерю фертильности вследствие потери функции ADAM6 или потери гена ADAM6. Ортологи и гомологи из других видов согласно различным вариантам осуществления выбраны из филогенетически когнатного вида и согласно различным вариантам осуществления проявляют процентную идентичность по отношению к эндогенному ADAM6 (или ортологу), которая составляет приблизительно 80% или более, 85% или более, 90% или более, 95% или более, 96% или более, или 97% или более; и которые восстанавливают связанную с ADAM6 или (у не относящихся к мыши) связанную с ортологом ADAM6 потерю фертильности. Например, у генетически модифицированного самца крысы, у которого отсутствует функция ADAM6 (например, крыса с эндогенной вариабельной областью тяжелой цепи иммуноглобулина, замещенной вариабельной областью тяжелой цепи иммуноглобулина человека, или нокаут у крысы области тяжелой цепи иммуноглобулина), потеря фертильности у крысы восстанавливается путем добавления ADAM6 крысы или согласно некоторым вариантам осуществления ортолога ADAM6 крысы (например, ортолога ADAM6 от другой линии или вида крысы или согласно одному варианту осуществления от мыши).

Таким образом, согласно различным вариантам осуществления генетически модифицированные животные, которые не проявляют фертильности или снижение фертильности вследствие модификации последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей белок ADAM6 (или его ортолог или гомолог) или регуляторной области, функционально связанной с последовательностью нуклеиновой кислоты, содержат последовательность нуклеиновой кислоты, которая взаимодополняет или восстанавливает потерю фертильности, если последовательность нуклеиновой кислоты, которая взаимодополняет или восстанавливает потерю фертильности, происходит от другой линии того же вида или из филогенетически когнатного вида. Согласно различным вариантам осуществления взаимодополняющая последовательность нуклеиновой кислоты представляет собой ADAM6, его ортолог или гомолог или функциональный фрагмент. Согласно различным вариантам осуществления взаимодополняющий ортолог ADAM6 или его гомолог или функциональный фрагмент происходит от не относящегося к человеку животного, которое является близкокогнатным генетически модифицированному животному с нарушением фертильности. Например, если генетически модифицированное животное представляет собой мышь конкретной линии, ортолог ADAM6 или его гомолог или функциональный фрагмент может быть получен от мыши другой линии или мыши когнатного вида. Согласно одному варианту осуществления если генетически модифицированное животное, содержащее нарушение фертильности, происходит из отряда Rodentia, то ортолог ADAM6 или его гомолог или функциональный фрагмент происходит от другого животного отряда Rodentia. Согласно одному варианту осуществления генетически модифицированное животное, содержащее нарушение фертильности, происходит из подотряда Myomoropha (например, тушканчики, полутушканчики, мышевидные хомяки, хомяки, крысы и мыши Нового Света, полевки, истинные мыши и крысы, карликовые песчанки, иглистые мыши, косматые хомяки, рипидомисы, скалистые хомяки, белохвостые крысы, мадагаскарские крысы и мыши, колючие соневидные хомяки, слепыши, бамбуковые крысы, цокоры), и ортолог ADAM6 или его гомолог или функциональный фрагмент выбран из животного отряда Rodentia или подотряда Myomorpha.

Согласно одному варианту осуществления генетически модифицированное животное происходит из надсемейства Dipodoidea, и ортолог ADAM6 или его гомолог или функциональный фрагмент происходит из надсемейства Muroidea. Согласно одному варианту осуществления генетически модифицированное животное происходит из надсемейство Muroidea, и ортолог ADAM6 или его гомолог или функциональный фрагмент происходит из надсемейства Dipodoidea.

Согласно одному варианту осуществления генетически модифицированное животное представляет собой грызуна. Согласно одному варианту осуществления грызун выбран из надсемейства Muroidea, и ортолог или гомолог ADAM6 происходит от другого вида в пределах надсемейства Muroidea. Согласно одному варианту осуществления генетически модифицированное животное происходит из семейства, выбранного из Calomyscidae (например, мышевидные хомяки), Cricetidae (например, хомяк, крысы и мыши Нового Света, полевки), Muridae (настоящие мыши и крысы, карликовые песчанки, иглистые мыши, косматые хомяки), Nesomyidae (рипидомисы, скалистые хомяки, белохвостые крысы, мадагаскарские крысы и мыши), Platacanthomyidae (например, колючие соневидные хомяки), и Spalacidae (например, слепыши, бамбуковые крысы и цокоры); и ортолог или гомолог ADAM6 выбран из другого вида того же семейства. Согласно конкретному варианту осуществления генетически модифицированный грызун выбран из настоящей мыши или крысы (семейство Muridae), и ортолог или гомолог ADAM6 происходит от вида, выбранного из карликовой песчанки, иглистой мыши, косматого хомяка. Согласно одному варианту осуществления генетически модифицированная мышь происходит из представителя семейства Muridae, и ортолог или гомолог ADAM6 происходит от другого вида семейства Muridae. Согласно конкретному варианту осуществления генетически модифицированный грызун представляет собой мышь семейства Muridae, и ортолог или гомолог ADAM6 происходит от крысы, карликовой песчанки, иглистой мыши, косматого хомяка семейства Muridae.

Согласно различным вариантам осуществления один или несколько ортологов ADAM6 грызуна или их гомологов или функциональных фрагментов грызуна в семействе восстанавливает фертильность генетически модифицированного грызуна того же семейства, который не содержит ортолог или гомолог ADAM6 (например, Cricetidae (например, хомяки, крысы и мыши Нового Света, полевки); Muridae (например, настоящие мыши и крысы, карликовые песчанки, иглистые мыши, косматые хомяки)).

Согласно различным вариантам осуществления ортологи ADAM6, их гомологи и фрагменты оценивают в отношении функциональности путем определения того, восстанавливает ли ортолог, гомолог или фрагмент фертильность генетически модифицированного самца не относящегося к человеку животного, у которого отсутствует активность ADAM6 (например, грызуна, например, мыши или крысы, которая содержит нокаут ADAM6 или его ортолога). Согласно различным вариантам осуществления функциональность определяют как способность спермы генетически модифицированного животного, у которого отсутствует эндогенный ADAM6 или его ортолог или гомолог, проходить яйцевод и оплодотворять яйцеклетку того же вида генетически модифицированного животного.

Согласно различным аспектам могут быть получены мыши, которые содержат делеции или замещения эндогенного локуса вариабельной области тяжелой цепи или его частей, которые содержат эктопическую нуклеотидную последовательность, кодирующую белок, обеспечивающий сходные улучшения фертильности ADAM6 мыши (например, его ортолог или гомолог или фрагмент, который является функциональным у самца мыши). Эктопическая нуклеотидная последовательность может содержать нуклеотидную последовательность, кодирующую белок, который представляет собой гомолог или ортолог ADAM6 (или их фрагмент) другой линии или другого вида, например, другого вида грызунов, и которая обеспечивает улучшение фертильности, например, увеличенное количество пометов в течение определенного периода времени и/или увеличенное количество детенышей на помет и/или способность сперматозоида самца мыши проходить через яйцевод мыши для оплодотворения яйцеклетки мыши.

Согласно одному варианту осуществления ADAM6 представляет собой гомолог или ортолог, которые по меньшей мере на 89%-99% идентичен белку ADAM6 мыши (например, по меньшей мере на 89%-99% идентичен ADAM6a мыши или ADAM6b мыши). Согласно одному варианту осуществления эктопическая нуклеотидная последовательность кодирует один или несколько белков, независимо выбранных из белка, по меньшей мере на 89% идентичного ADAM6a мыши, белка, по меньшей мере на 89% идентичного ADAM6b мыши, и их комбинации. Согласно одному варианту осуществления гомолог или ортолог представляет собой белок крысы, хомяка, мыши или морской свинки, который является или модифицирован, чтобы быть приблизительно на 89% или более идентичным ADAM6a мыши и/или ADAM6b мыши. Согласно одному варианту осуществления гомолог или ортолог является или по меньшей мере на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичен ADAM6a мыши и/или ADAM6b мыши.

Эктопический ADAM6 у мышей с гуманизированной тяжелой цепью

Разработки в области нацеленного воздействия на гены, например, разработка бактериальных искусственных хромосом (ВАС), в настоящее время обеспечивают возможность рекомбинации относительно больших геномных фрагментов. Конструирование ВАС предоставила возможность получения больших делеций и больших вставок в ES клетки мыши.

Мыши, которые производят человеческие антитела, были доступны уже в течение определенного времени. Хотя они представляют собой важный прогресс в разработке человеческих терапевтических антител, эти мыши проявляют ряд значительных нарушений, которые ограничивают их применимость. Например, они проявляют нарушенное развитие В-клеток. Нарушенное развитие может быть обусловлено разнообразными различиями между трансгенными мышами и мышами дикого типа.

Существует вероятность, что человеческие антитела не взаимодействуют оптимально с рецепторами пре-В-клеток или В-клеток мыши на поверхности клеток мыши, которые передают сигнал к созреванию, пролиферации или выживанию в ходе клональной селекции. Полностью человеческие антитела могут не взаимодействовать оптимально с Fc рецепторной системой мыши; мыши экспрессируют Fc рецепторы, которые не проявляют соответствия один к одному с Fc рецепторами человека. В конце концов, различные мыши, которые производят полностью человеческие антитела, не включают в себя все истинные мышиные последовательности, например, нижележащие энхансерные элементы и другие контролирующие элементы локуса, которые могут быть необходимы для развития В-клеток дикого типа.

Мыши, которые производят полностью человеческие антитела, как правило, содержат эндогенные локусы иммуноглобулина, которые являются некоторым образом недееспособными, и человеческие трансгены, которые содержат вариабельные и константные генные сегменты иммуноглобулина, вводят в случайное положение в геноме мыши. При условии, что эндогенный локус является достаточно недееспособным, так чтобы не реаранжировать генные сегменты для образования функционального гена иммуноглобулина, цель получения полностью человеческих антител в такой мыши может быть достигнута, хотя и с нарушенным развитием В-клеток.

Несмотря на принуждение производить полностью человеческие антитела из человеческого трансгенного локуса, образование человеческих антител у мыши является очевидно затрудненным процессом. У некоторых мышей процесс является настолько затрудненным, что приводит к формированию химерных человеческих вариабельных/мышиных константных тяжелых цепей (но не легких цепей) посредством механизма транс-переключения. С помощью этого механизм, транскрипты, которые кодируют полностью человеческие антитела, подвергаются переключению изотипа в транс-конфигурации из изотипа человека на изотип мыши. Процесс происходит в транс-конфигурации, поскольку полностью человеческий трансген расположен в отдалении от эндогенного локуса, который сохраняет неповрежденную копию генной константной области тяжелой цепи мыши. Хотя у таких мышей транс-переключение очевидно выражено, явление остается недостаточным для восстановления развития В-клеток, которое остается фактически нарушенным. В любом случае, транс-переключенные антитела, произведенные у таких мышей, сохраняют полностью человеческие легкие цепи, поскольку явление транс-переключения, очевидно, не происходит в отношении легких цепей; транс-переключение, вероятно, основано на переключении последовательностей в используемых эндогенных локусах (хотя и по-другому) в переключении нормального изотипа в цис-конфигурации. Таким образом, даже когда мыши, сконструированные для получения полностью человеческих антител, выбирают механизм транс-переключения для образования антител с константными областями мыши, стратегия остается все еще недостаточной для восстановления нормального развития В-клеток.

Первоочередной задачей в получении основанных на антителах терапевтических средств для людей, например, антител к патогенам, состоит в, идентификации применимых вариабельных доменов, которые специфически распознают конкретные эпитопы и связывают их с необходимой аффинностью, как правило, но не всегда, с высокой аффинностью. Описанные в настоящем документе мыши, которые содержат точное замещение вариабельных областей тяжелой цепи иммуноглобулина мыши ограниченным числом вариабельных генных сегментов тяжелой цепи иммуноглобулина человека на эндогенных локусах мыши, проявляют сходное с диким типом развитие В-клеток, и вариабельные области, созданные в ответ на иммунизацию, являются полностью человеческими, причем тяжелые цепи происходят из единственного генного сегмента VH человека. Таким образом, такие мыши предоставляют платформу для создания панели определяющих комплементарность областей тяжелой цепи (CDR), которые специфически направлены на связывание с данным антигеном, например, патогенным вирусом.

Описанный в настоящем документе мыши содержат точное крупномасштабное замещение зародышевых вариабельных генных локусов тяжелой цепи иммуноглобулина мыши (IgH) ограниченным вариабельным локусом тяжелой цепи иммуноглобулина человека, и легкой цепи иммуноглобулина (например, κ легкой цепи Igκ) эквивалентным вариабельным генным локусом κ легкой цепи иммуноглобулина человека, на эндогенных локусах. Это точное замещение дает в результате мышь с гибридными локусами иммуноглобулина, которая образует тяжелые и легкие цепи, которые содержатся вариабельные области человека и константную область мыши. Точное замещение сегментов VH-DH-JH и Vκ-Jκ мыши оставляет фланкирующие мышиные последовательности интактными и функциональными на гибридных локусах иммуноглобулина. Гуморальная иммунная система мыши функционирует как система у мыши дикого типа. Развитие В-клеток не затруднено каким-либо существенным образом, и у мыши при антигенной сенсибилизации образуется соматически мутированная панель CDR тяжелой цепи человека.

Описанные в настоящем документе мыши являются возможными, поскольку иммуноглобулиновые генные сегменты тяжелых и к легких цепей реаранжируются подобным образом у людей и мышей, что не означает, что их локусы являются одинаковыми или даже приблизительно таковы - ясно, что они не такие. Тем не менее, локусы являются достаточно сходными, чтобы гуманизация вариабельного генного локуса тяжелой цепи могла осуществиться путем замещения приблизительно трех миллионов пар нуклеотидов смежной мышиной последовательности, которая содержит все генные сегменты VH, DH и JH со смежной геномной последовательностью человека, содержащей ограниченный локус тяжелой цепи человека.

Согласно некоторым вариантам осуществления дополнительное замещение определенных генных последовательностей константной области мыши генными последовательностями человека (например, замещение последовательности CH1 мыши последовательностью CH1 человека и замещение последовательность CL мыши последовательностью CL человека) дает в результате мышей с гибридными локусами иммуноглобулина, которые образуют антитела, содержащие вариабельные области человека и частично константные области человека, подходящие, например, для образования полностью человеческих фрагментов антител, например, полностью человеческих Fab. Мыши с гибридными локусами иммуноглобулина проявляют нормальную реаранжировку вариабельных генных сегментов, нормальные показатели частоты соматической гипермутации и нормальное переключение класса. Эти мыши проявляют гуморальную иммунную систему, которая неотличима от мышей дикого типа, и демонстрируют нормальные клеточные популяции на всех стадиях развития В-клеток и нормальные структуры лимфомных органов - даже если у мышей отсутствует полный репертуар вариабельных генных сегментов человека. Иммунизация указанных мышей приводит к устойчивым гуморальным ответам, которые проявляют широкое разнообразие использования CDR тяжелой цепи и вариабельных генных сегментов легкой цепи.

Точное замещение зародышевых генных сегментов вариабельной области мыши обеспечивают получение мышей, которые содержат частично человеческие локусы иммуноглобулина. Поскольку частично человеческие локусы иммуноглобулина нормально реаранжируются, гипермутируют и подвергаются переключению класса, частично человеческие локусы иммуноглобулина образуют у мыши антитела, которые содержат вариабельные области человека. Нуклеотидные последовательности, которые кодируют вариабельные области, могут быть установлены и клонированы, затем слиты (например, в системе in vitro) с любыми предпочтительными последовательностями, например, любым изотипом иммуноглобулина, подходящим для конкретного применения, давая в результате антитело или антигенсвязывающий белок, происходящий полностью из последовательностей человека.

Крупномасштабную гуманизацию с помощью способов рекомбинационный инженерии использовали для модификации мышиных эмбриональных стволовых (ES) клеток для точного замещения до трех миллионов пар нуклеотидов локуса тяжелой цепи иммуноглобулина мыши, которые включали в себя по существу все генные сегменты VH, DH и JH мыши, геномной последовательностью человека, содержащей ограниченный локус тяжелой цепи человека, включая в себя единственный генный сегмент VH человека, 27 генных сегментов DH человека и шесть генных сегментов JH человека. До 0,5 миллиона пар нуклеотидов сегмент генома человека, содержащий один из двух повторов, кодирующих по существу все генные сегменты Vκ и Jκ человека, использовали для замещения сегмента локуса κ легкой цепи иммуноглобулина мыши размером 3 миллиона пар нуклеотидов, содержащего по существу все генные сегменты Vκ и Jκ мыши.

Мыши с такими замещенными иммуноглобулиновыми локусами могут содержать разрыв или делецию эндогенного локуса ADAM6 мыши, который в норме встречается между расположенным наиболее 3' генным сегментом VH и наиболее 5' генным сегментом DH на локусе тяжелой цепи иммуноглобулина мыши. Разрыв в этой области может привести к снижению или подавлению функциональности эндогенного локуса ADAM6 мыши. Если они или оба расположенных наиболее 3' генных сегмента VH репертуара тяжелой цепи человека используются в конструкции ограниченного локуса тяжелой цепи человека, межгенная область, содержащая псевдоген, который, вероятно, представляет собой псевдоген ADAM6 человека, присутствует между указанными генными сегментами VH, т.е. между VH1-2 и VH1-6 человека. Тем не менее, самцы мышей, которые содержат указанную межгенную последовательность человека, проявляют снижение фертильности (смотрите USSN 13/404075).

Описаны мыши, которые содержат ограниченную тяжелую цепь человека и эквивалентные локусы κ легкой цепи человека, описанные выше, и которые также содержат эктопическую последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую ADAM6 мыши, причем мыши проявляют по существу нормальную фертильность. Согласно одному варианту осуществления эктопическая последовательность нуклеиновой кислоты содержит последовательность ADAM6a мыши и/или ADAM6b мыши или ее функциональные фрагменты, расположенные между VH1-69 человека и DH1-1 человека на модифицированном эндогенном локусе тяжелой цепи. Согласно одному варианту осуществления эктопическая последовательность нуклеиновой кислоты представляет собой SEQ ID NO: 77, расположенную между VH1-69 человека и DH1-1 человека на модифицированном эндогенном локусе тяжелой цепи. Направление транскрипции генов ADAM6 SEQ ID NO: 77 является противоположным относительно направления транскрипции окружающих генных сегментов человека. Согласно одному варианту осуществления эктопическая последовательность нуклеиновой кислоты содержит последовательность ADAM6a мыши и/или ADAM6b мыши или ее функциональные фрагменты, расположенные выше (или 5') относительно генного сегмента VH1-2 человека на модифицированном эндогенном локусе тяжелой цепи. Согласно одному варианту осуществления эктопическая последовательность нуклеиновой кислоты представляет собой SEQ ID NO: 73, расположенную выше (или 5') относительно генного сегмента VH1-2 человека на модифицированном эндогенном локусе тяжелой цепи. Направление транскрипции генов ADAM6 SEQ ID NO: 73 является противоположным относительно направления транскрипции окружающих генных сегментов человека (например, генного сегмента VH1-2 человека).

Несмотря на то, что в примерах в настоящем документе показано восстановление фертильности путем размещения эктопической последовательности между указанными генными сегментами человека, специалистам в настоящей области будет понятно, что размещение эктопической последовательности на любом подходящем транскрипционно пермиссивном локусе в мышином геноме (или даже внехромосомно), как предполагается, приведет к подобному восстановлению фертильности у самца мыши.

Явление дополнения у мыши, у которой отсутствует функциональный локус ADAM6, с помощью эктопической последовательности, которая содержит ген ADAM6 мыши или его ортолог или гомолог или функциональный фрагмент, представляет собой общий способ, который является применимым для восстановления любых мышей с нефункциональными или минимально функциональными эндогенными локусами ADAM6. Таким образом, фертильность большого количества мышей, которые содержат разрушающую ADAM6 модификацию локуса тяжелой цепи иммуноглобулина, может быть восстановлена с помощью композиций и способов по настоящему изобретению. Соответственно, настоящее изобретение предусматривает мышей с широким разнообразием модификаций локусов тяжелой цепи иммуноглобулина, которые нарушают функцию эндогенного ADAM6. Некоторые (не ограничивающие) примеры представлены в настоящем описании. В дополнение к описанным мышам относящиеся к ADAM6 композиции и способы могут использоваться в многочисленных применениях, например, при модификации локуса тяжелой цепи разнообразными путями.

Согласно одному аспекту предусматривается мышь, которая содержит эктопическую последовательность ADAM6, которая кодирует функциональный белок ADAM6 (или его ортолог или гомолог или функциональный фрагмент), замещение всех или по существу всех генных сегментов VH мыши единственными генными сегментами VH человека, замещение всех или по существу всех генных сегментов DH мыши и генных сегментов JH мыши генными сегментами DH человека и генными сегментами JH человека; причем мышь не содержит CH1 и/или шарнирную область. Согласно одному варианту осуществления мышь производит единственный связывающий белок вариабельного домена, который представляет собой димер цепей иммуноглобулина, выбранных из: (a) VH человека - CH1 мыши - CH2 мыши - CH3 мыши; (b) VH человека - шарнир мыши - CH2 мыши - CH3 мыши; и (с) VH человека - CH2 мыши - CH3 мыши.

Согласно одному аспекту нуклеотидная последовательность, которая восстанавливает фертильность, расположена выше (или 5') относительно последовательности вариабельной области тяжелой цепи иммуноглобулина человека (например, выше генного сегмента VH1-2 человека или генного сегмента VH1-69 человека) у мыши, которая содержит замещение одного или нескольких вариабельных генных сегментов тяжелой цепи иммуноглобулина мыши (mVH, mDH и/или mJH) одним или несколькими вариабельными генными сегментами тяжелой цепи иммуноглобулина человека (hVH, hDH и/или hJH), и мышь дополнительно содержит замещение одного или нескольких вариабельных генных сегментов κ легкой цепи иммуноглобулина мыши (mVκ и/или mJκ) одним или несколькими вариабельными генными сегментами κ легкой цепи иммуноглобулина человека (hVκ и/или hJκ).

Согласно одному аспекту нуклеотидная последовательность, которая восстанавливает фертильность, расположена в пределах последовательности вариабельной области тяжелой цепи иммуноглобулина человека (например, между генным сегментом VH1-69 человека или генным сегментом VH1-2 человека и генным сегментом DH1-1 человека) у мыши, которая содержит замещение одного или нескольких вариабельных генных сегментов тяжелой цепи иммуноглобулина мыши (mVH, mDH и/или mJH) одним или несколькими вариабельными генными сегментами тяжелой цепи иммуноглобулина человека (hVH, hDH и/или hJH), и мышь дополнительно содержит замещение одного или нескольких вариабельных генных сегментов κ легкой цепи иммуноглобулина мыши (mVκ и/или mJκ) одним или несколькими вариабельными генными сегментами κ легкой цепи иммуноглобулина человека (hVκ и/или hJκ).

Согласно одному варианту осуществления один или несколько вариабельных генных сегментов тяжелой цепи иммуноглобулина мыши содержит приблизительно три миллиона пар нуклеотидов локуса тяжелой цепи иммуноглобулина мыши. Согласно одному варианту осуществления один или несколько вариабельных генных сегментов тяжелой цепи иммуноглобулина мыши содержит по меньшей мере 89 генных сегментов VH, по меньшей мере 13 генных сегментов DH, по меньшей мере 4 генных сегмента JH или их комбинацию локуса тяжелой цепи иммуноглобулина мыши. Согласно одному варианту осуществления один или несколько вариабельных генных сегментов тяжелой цепи иммуноглобулина мыши содержит ограниченное число (например, один, два или три) генных сегментов VH, по меньшей мере 27 генных сегментов DH, по меньшей мере шесть генных сегментов JH или их комбинацию локуса тяжелой цепи иммуноглобулина человека. Согласно конкретному варианту осуществления ограниченное число генных сегментов VH человека равно одному.

Согласно одному варианту осуществления один или несколько вариабельных генных сегментов κ легкой цепи иммуноглобулина мыши содержит приблизительно три миллиона пар нуклеотидов локуса κ легкой цепи иммуноглобулина мыши. Согласно одному варианту осуществления один или несколько вариабельных генных сегментов κ легкой цепи иммуноглобулина мыши содержит по меньшей мере 137 генных сегментов Vκ, по меньшей мере пять генных сегментов Jκ или их комбинацию локуса κ легкой цепи иммуноглобулина мыши. Согласно одному варианту осуществления один или несколько вариабельных генных сегментов κ легкой цепи иммуноглобулина человека содержит приблизительно 0,5 миллиона пар нуклеотидов локуса κ легкой цепи иммуноглобулина человека. Согласно конкретному варианту осуществления один или несколько вариабельных генных сегментов κ легкой цепи иммуноглобулина человека содержит проксимальный повтор (относительно κ константной области иммуноглобулина) локуса κ легкой цепи иммуноглобулина человека. Согласно одному варианту осуществления один или несколько вариабельных генных сегментов κ легкой цепи иммуноглобулина человека содержит по меньшей мере 40 генных сегментов Vκ, по меньшей мере пять генных сегментов Jκ или их комбинацию локуса κ легкой цепи иммуноглобулина человека.

Согласно одному варианту осуществления нуклеотидная последовательность расположена между двумя генными сегментами иммуноглобулина человека. Согласно конкретному варианту осуществления два генных сегмента иммуноглобулина человека представляют собой генные сегменты тяжелой цепи. Согласно одному варианту осуществления нуклеотидная последовательность расположена между генным сегментом VH1-69 человека и генным сегментом DH1-1 человека. Согласно одному варианту осуществления нуклеотидная последовательность расположена между генным сегментом VH12 человека и генным сегментом DH1-1 человека. Согласно одному варианту осуществления модифицированная таким образом мышь содержит замещение вариабельных генных сегментов тяжелой цепи иммуноглобулина мыши единственными генным сегментом VH человека, 27 генными сегментами DH человека и шестью генными сегментами JH человека и замещение вариабельных генных сегментов κ легкой цепи иммуноглобулина мыши по меньшей мере 40 генными сегментами Vκ человека и пятью генными сегментами Jκ человека.

Согласно одному аспекту функциональный локус ADAM6 мыши (или его ортолог или гомолог или функциональный фрагмент) присутствует в окружении генных сегментов мыши, которые присутствуют на эндогенном локусе вариабельной области тяжелой цепи мыши, причем указанный локус является неспособным к реаранжировке для кодирования функциональной тяжелой цепи, содержащей эндогенную константную область тяжелой цепи. Согласно одному варианту осуществления эндогенный локус тяжелой цепи мыши содержит по меньшей мере один и вплоть до 89 генных сегментов VH, по меньшей мере один и вплоть до 13 генных сегментов DH, по меньшей мере один и вплоть до четырех генных сегментов JH и их комбинацию. Согласно различным вариантам осуществления функциональный локус ADAM6 мыши (или его ортолог или гомолог или функциональный фрагмент) кодирует один или несколько белков ADAM6, которые являются функциональными у мыши, причем один или несколько белков ADAM6 содержат SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 и/или их комбинацию.

Согласно одному аспекту функциональный мышь локус ADAM6 (или его ортолог или гомолог или функциональный фрагмент) присутствует в окружении генных сегментов человека, которые замещают эндогенные генные сегменты мыши. Согласно одному варианту осуществления удаляют по меньшей мере 89 генных сегментов VH мыши и замещают их одним, двумя или тремя генными сегментами VH человека, и локус ADAM6 мыши присутствует непосредственно примыкая к 3' концу генных сегментов VH человека или между двумя генными сегментами VH человека. Согласно одному варианту осуществления удаляют по меньшей мере 89 генных сегментов VH мыши и замещают их единственным генным сегментом человека VH, и локус ADAM6 мыши присутствует непосредственно примыкая к 3' концу генного сегмента VH человека. Согласно конкретному варианту осуществления локус ADAM6 мыши присутствует 3' относительно генного сегмента VH в пределах приблизительно на расстоянии 20 тысяч пар нуклеотидов (т.п.н.) - приблизительно 40 тысяч пар нуклеотидов (т.п.н.) от 3' конца вставленного генного сегмента VH человека. Согласно конкретному варианту осуществления локус ADAM6 мыши присутствует 3' относительно генного сегмента VH в пределах приблизительно 29 т.п.н. - приблизительно 31 т.п.н. от 3' конца вставленного генного сегмента VH человека. Согласно конкретному варианту осуществления локус ADAM6 мыши присутствует в пределах приблизительно 30 т.п.н. от 3' конца вставленного генного сегмента VH человека. Согласно конкретному варианту осуществления локус ADAM6 мыши присутствует в пределах приблизительно 30184 п. н. от 3' конца вставленного генного сегмента VH человека.

Согласно конкретному варианту осуществления замещение включает в себя генные сегменты VH1-69 и DH1-1 человека, и локус ADAM6 мыши присутствует ниже генного сегмента VH1-69 и выше генного сегмента DH1-1. Согласно конкретному варианту осуществления локус ADAM6 мыши присутствует между генным сегментом VH1-69 человека и генным сегментом DH1-1 человека, причем 5' конец локуса ADAM6 мыши расположен на расстоянии приблизительно 258 п.н. от 3' конца генного сегмента VH1-69 человека и 3' конец локуса ADAM6 расположен на расстоянии приблизительно 3263 п.н. 5' относительно генного сегмента DH1-1 человека. Согласно конкретному варианту осуществления локус ADAM6 мыши содержит SEQ ID NO: 3 или ее фрагмент, который обеспечивает функцию ADAM6 в клетках мыши. Согласно конкретному варианту осуществления локус ADAM6 мыши содержит SEQ ID NO: 73 или ее фрагмент, который обеспечивает функцию ADAM6 в клетках мыши. Согласно конкретному варианту осуществления локус ADAM6 мыши содержит SEQ ID NO: 77 или ее фрагмент, который обеспечивает функцию ADAM6 в клетках мыши. Согласно конкретному варианту осуществления после этого расположение генных сегментов человека является следующим (сверху вниз относительно направления транскрипции генных сегментов человека): VH1-69 человека - локус ADAM6 мыши - DH1-1 человека. Согласно одному варианту осуществления ориентация одного или нескольких из ADAM6a мыши и ADAM6b мыши локуса ADAM6 мыши противоположна относительно направления транскрипции по сравнению с ориентацией генных сегментов человека. Альтернативно, локус ADAM6 мыши присутствует 5', или выше, единственного генного сегмента VH человека.

Согласно конкретному варианту осуществления замещение включает в себя генные сегменты VH1-2 и DH1-1 человека, и локус ADAM6 мыши присутствует выше генного сегмента VH1-2 и выше генного сегмента DH1-1. Согласно конкретному варианту осуществления локус ADAM6 мыши присутствует выше, или 5', относительно генного сегмента VH1-2 человека и генного сегмента DH1-1 человека, причем 5' конец локуса ADAM6 мыши расположен на расстоянии приблизительно 32833 п.н. от 5' конца генного сегмента VH1-2 человека, и 3' конец локуса ADAM6 расположен на расстоянии приблизительно 18078 п.н. от 5' конца генного сегмента VH1-2 человека. Согласно конкретному варианту осуществления локус ADAM6 мыши содержит SEQ ID NO: 3 или ее фрагмент, который обеспечивает функцию ADAM6 в клетках мыши. Согласно конкретному варианту осуществления локус ADAM6 мыши содержит SEQ ID NO: 73 или ее фрагмент, который обеспечивает функцию ADAM6 в клетках мыши. Согласно конкретному варианту осуществления локус ADAM6 мыши содержит SEQ ID NO: 77 или ее фрагмент, который обеспечивает функцию ADAM6 в клетках мыши. Согласно конкретному варианту осуществления после этого расположение генных сегментов человека является следующим (сверху вниз относительно направления транскрипции генных сегментов человека): локус ADAM6 мыши - VH1-2 человека - DH1-1 человека.. Согласно одному варианту осуществления ориентация одного или нескольких из ADAM6a мыши и ADAM6b мыши локуса ADAM6 мыши противоположна относительно направления транскрипции по сравнению с ориентацией генных сегментов человека. Альтернативно, локус ADAM6 мыши присутствует 3', или ниже, единственного генного сегмента VH человека.

Аналогично, мышь, модифицированная с помощью одного или нескольких генных сегментов VL человека (например, сегментов Vκ или Vλ), замещающих все или по существу все эндогенные VH генные сегменты мыши, может быть модифицирована так, чтобы или сохранять эндогенный локус ADAM6 мыши, как описано выше, например, путем использования нацеливающего вектора, характеризующегося расположенным ниже гомологичным плечом, которое содержит локус ADAM6 мыши или его функциональный фрагмент, или замещать поврежденный локус ADAM6 мыши эктопической последовательностью, расположенной между двумя генными сегментами VL человека или между генными сегментами VL человека и генным сегментом DH (либо человека, либо мыши, например, Vλ+m/hDH), или генным сегментом J (либо человека, либо мыши, например, Vκ+JH). Согласно одному варианту осуществления замещение предусматривает два или более генных сегментов VL человека, и локус ADAM6 мыши или его функциональный фрагмент расположен между двумя наиболее 3' генными сегментами VL. Согласно конкретному варианту осуществления расположение генных сегментов VL человека после этого является следующим (сверху вниз относительно направления транскрипции генных сегментов человека): VL3'-1 человека - локус ADAM6 мыши - VL3' человека. Согласно одному варианту осуществления ориентация одного или нескольких из мышиного ADAM6a и мышиного ADAM6b локуса ADAM6 мыши является противоположной относительно направления транскрипции по сравнению с ориентацией VL генных сегментов человека. Альтернативно, локус ADAM6 мыши расположен в межгенной области между наиболее 3' генным сегментом VL человека и наиболее 5' генным сегментом DH. Это может происходить независимо от того, относится ли расположенный наиболее 5' сегмент DH к мыши или человеку.

Согласно одному аспекту предусматривается мышь с замещением одного или нескольких эндогенных генных сегментов VH мыши, и которая содержит по меньшей мере один эндогенный генный сегмент DH мыши. У такой мыши модификация эндогенных генных сегментов VH мыши может содержать модификацию одного или нескольких из расположенных наиболее 3' генных сегментов VH, но не расположенный наиболее 5' генный сегмент DH, причем нужно быть внимательным, чтобы модификация одного или нескольких расположенных наиболее 3' VH генных сегментов не разрушила эндогенный локус ADAM6 мыши или не сделала его нефункциональным. Например, согласно одному варианту осуществления мышь содержит замещение всех или по существу всех эндогенных VH генных сегментов мыши единственным генным сегментом VH человека, и мышь содержит один или несколько эндогенных генных сегментов DH и функциональный эндогенный локус ADAM6 мыши.

Согласно другому варианту осуществления мышь содержит модификацию эндогенных наиболее 3' генных сегментов VH мыши, и модификацию одного или нескольких эндогенных генных сегментов DH мыши, и модификацию проводят так, чтобы сохранить целостность эндогенного локуса ADAM6 мыши до такой степени, чтобы эндогенный ADAM6 локус оставался функциональным. Согласно одному примеру такую модификацию выполняют в две стадии: (1) замещение наиболее 3' эндогенных генных сегментов VH мыши единственным генным сегментом VH человека с использованием нацеливающего вектора с вышележащим гомологичным плечом и нижележащим гомологичным плечом, причем нижележащее гомологичное плечо содержит весь или часть функционального локуса ADAM6 мыши; (2) затем замещение и эндогенного генного сегмента DH мыши с помощью нацеливающего вектора, содержащего вышележащее гомологичное плечо, которое содержит весь или функциональную часть локуса ADAM6 мыши.

Согласно различным аспектам использование мышей, которые содержат эктопическую последовательность, которая кодирует белок ADAM6 мыши или его ортолог или гомолог или функциональные гомолог, является применимым, если модификации нарушают функцию эндогенного ADAM6 мыши. Вероятность разрушения функции эндогенного ADAM6 мыши является высокой при осуществлении модификаций в отношении локусов иммуноглобулина мыши, в частности, при модификации вариабельных областей тяжелой цепи иммуноглобулина мыши и окружающих последовательностей. Следовательно, такие мыши представляют конкретное преимущество при получении мышей с локусами тяжелой цепи иммуноглобулина, которые подвергнуты делеции полностью или частично, которые являются гуманизированными полностью или частично или замещенными (например, Vκ или Vλ последовательностями) полностью или частично. Способы получения генетических модификаций, описанных для мышей, описанных ниже, известны специалистам в настоящей области техники.

Мыши, содержащие эктопическую последовательность, кодирующую белок ADAM6 мыши или по существу идентичный или сходный белок, который обеспечивает улучшения фертильности белка ADAM6 мыши, являются особенно применимыми в связи с модификациями относительно вариабельной генного локуса тяжелой цепи иммуноглобулина мыши, которые разрушают или подвергают делеции эндогенную последовательность ADAM6 мыши. Несмотря на то, что изначально описаны в связи с мышами, которые экспрессируют антитела с вариабельными областями человека и константными областями мыши, такие мыши применимы в отношении любых генетических модификаций, которые нарушают эндогенные гены ADAM6 мыши. Специалистам в настоящей области понятно, что это охватывает широкое разнообразие генетически модифицированных мышей, которые содержат модификации вариабельных генных локусов тяжелой цепи иммуноглобулина мыши. Они предусматривают, например, мышей с делецией или замещением всех или части генных сегментов тяжелой цепи иммуноглобулина мыши, независимо от других модификаций. Не ограничивающие примеры описаны ниже.

Согласно некоторым аспектам предусмотрены генетически модифицированные мыши, которые содержат эктопический ген ADAM6 мыши, грызуна или другого животного (или ортолог или гомолог или фрагмент), функциональный у мыши, и один или несколько генных сегментов вариабельной и/или константной области иммуноглобулина человека. Согласно различным вариантам осуществления другие ортологи или гомологи или фрагменты гена ADAM6, функциональные у мыши, могут включать в себя последовательности от коров, собак, примата, кролика или другие не относящиеся к человеку последовательности.

Согласно одному аспекту предусмотрена мышь, которая содержит эктопическую последовательность ADAM6, которая кодирует функциональный белок ADAM6, замещение всех или по существу всех генных сегментов VH мыши единственным генным сегментом VH человека; замещение всех или по существу всех генных сегментов DH мыши одним или несколькими генными сегментами DH человека; и замещение всех или по существу всех генных сегментов JH мыши одним или несколькими генными сегментами JH человека.

Согласно одному варианту осуществления мышь дополнительно содержит замещение нуклеотидной последовательности CH1 мыши нуклеотидной последовательностью CH1 человека. Согласно одному варианту осуществления мышь дополнительно содержит замещение шарнирной нуклеотидной последовательности мыши шарнирной нуклеотидной последовательностью человека. Согласно одному варианту осуществления мышь дополнительно содержит замещение вариабельного локуса легкой цепи иммуноглобулина (VL и JL) вариабельным локусом легкой цепи иммуноглобулина человека. Согласно одному варианту осуществления мышь дополнительно содержит замещение нуклеотидной последовательности константной области легкой цепи иммуноглобулина мыши нуклеотидной последовательностью константной области легкой цепи иммуноглобулина человека. Согласно конкретному варианту осуществления VL, JL и CL представляют собой последовательности κ легкой цепи иммуноглобулина. Согласно конкретному варианту осуществления мышь содержит последовательность константной области иммуноглобулина CH2 мыши и CH3 мыши, слитую с шарнирной последовательностью человека и последовательностью CH1 человека, так что локусы иммуноглобулина мыши реаранжируются для образования гена, который кодирует связывающий белок, содержащий (а) тяжелую цепь, которая содержит вариабельную область человека, область CH1 человека, шарнирную область человека и область CH2 мыши и область CH3 мыши; и (b) ген, который кодирует легкую цепь иммуноглобулина, которая содержит вариабельный домен человека и константную область человека.

Согласно одному аспекту предусмотрена мышь, которая содержит эктопическую последовательность ADAM6, которая кодирует функциональный белок ADAM6, замещение всех или по существу всех генных сегментов VH мыши одним или несколькими генными сегментами VL человека, и необязательно замещение всех или по существу всех генных сегментов DH и/или генных сегментов JH одним или несколькими генными сегментами DH человека и/или генными сегментами JH человека, или необязательно замещение всех или по существу всех генных сегментов DH и генных сегментов JH одним или несколькими генными сегментами JL человека.

Согласно одному варианту осуществления мышь содержит замещение всех или по существу всех генных сегментов VH, DH и JH мыши одним или несколькими VL, одним или несколькими DH и одним или несколькими генными сегментами J (например, Jκ или Jλ), причем генные сегменты функционально связаны с эндогенной шарнирной областью мыши, причем мышь образует реаранжированный ген цепи иммуноглобулина, который содержит, от 5' к 3' в направлении транскрипции, VL человека -DH человека или мыши -J человека или мыши - шарнир мыши -CH2 мыши -CH3 мыши. Согласно одному варианту осуществления J область представляет собой Jκ область человека. Согласно одному варианту осуществления J область представляет собой JH область человека. Согласно одному варианту осуществления J область представляет собой Jλ область человека. Согласно одному варианту осуществления VL область человека выбрана из Vλ области человека и Vκ области человека.

Согласно конкретным вариантам осуществления мышь экспрессирует антитело с одним вариабельным доменом, содержащее константную область мыши или человека и вариабельную область, происходящую из Vκ человека, DH человека и Jκ человека; Vκ человека, DH человека и JH человека; Vλ человека, DH человека и Jλ человека; Vλ человека, DH человека и JH человека; Vκ человека, DH человека и Jλ человека; Vλ человека, DH человека и Jκ человека. Согласно конкретному варианту осуществления последовательности распознавания рекомбинации модифицируют так, чтобы обеспечить осуществление продуктивных реаранжировок между указанными генными сегментами V, D и J или между указанными генными сегментами V и J.

Согласно одному аспекту предусмотрена мышь, которая содержит эктопическую последовательность ADAM6, которая кодирует функциональный белок ADAM6 (или его ортолог или гомолог или функциональный фрагмент), замещение всех или по существу всех генных сегментов VH мыши одним или несколькими VL генными сегментами человека, замещение всех или по существу всех генных сегментов DH и генных сегментов JH мыши генными сегментами JL человека; причем у мыши отсутствует CH1 и/или шарнирная область.

Согласно одному варианту осуществления у мыши отсутствует последовательность, кодирующая домен CH1. Согласно одному варианту осуществления у мыши отсутствует последовательность, кодирующая шарнирную область. Согласно одному варианту осуществления у мыши отсутствует последовательность, кодирующая домен CH1 и шарнирную область.

Согласно конкретному варианту осуществления мышь экспрессирует связывающий белок, который содержит вариабельный домен легкой цепи (λ или κ) иммуноглобулина человека, слитый с доменом CH2 мыши, который прикреплен к домену CH3 мыши.

Согласно одному аспекту предусмотрена мышь, которая содержит эктопическую последовательность ADAM6, которая кодирует функциональный белок ADAM6 (или его ортолог или гомолог или функциональный фрагмент), замещение всех или по существу всех генных сегментов VH мыши одним или несколькими генными сегментами VL человека, замещение всех или по существу всех генных сегментов DH и JH мыши генными сегментами JL человека.

Согласно одному варианту осуществления мышь содержит делецию генной последовательности константной области тяжелой цепи иммуноглобулина, кодирующей область CH1, шарнирную область, CH1 и шарнирную область или область CH1 и шарнирную область и область CH2.

Согласно одному варианту осуществления мышь образует связывающий один белок вариабельного домена, содержащий гомодимер, выбранный из следующего: (а) VL человека - CH1 мыши - CH2 мыши - CH3 мыши; (b) VL человека - шарнир мыши - CH2 мыши - CH3 мыши; (с) VL человека - CH2 мыши - CH3 мыши.

Согласно одному аспекту предусмотрена мышь с недееспособным эндогенным локусом тяжелой цепи иммуноглобулин, содержащим недееспособный или удаленный эндогенный локус ADAM6 мыши, причем мышь содержит последовательность нуклеиновой кислоты, которая экспрессирует относящееся к человеку или мыши или относящееся к человеку/мыши или другое химерное антитело. Согласно одному варианту осуществления последовательность нуклеиновой кислоты присутствует на интегрированном трансгене, который случайным образом интегрирован в мышиный геном. Согласно одному варианту осуществления последовательность нуклеиновой кислоты находится на эписоме (например, хромосоме), не встречающейся у мыши дикого типа.

Согласно одному варианту осуществления мышь дополнительно содержит недееспособный эндогенный локус легкой цепи иммуноглобулина. Согласно конкретному варианту осуществления эндогенный локус легкой цепи иммуноглобулина выбран из локуса каппа (κ) и лямбда (λ) легкой цепи. Согласно конкретному варианту осуществления мышь содержит недееспособный эндогенный локус κ легкой цепи и недееспособный локус λ легкой цепи, причем мышь экспрессирует антитело, которое содержит вариабельный домен тяжелой цепи иммуноглобулина человека и домен легкой цепи иммуноглобулина человека. Согласно одному варианту осуществления домен легкой цепи иммуноглобулина человека выбран из домена κ легкой цепи человека и домена λ легкой цепи человека.

Согласно одному аспекту предусмотрено генетически модифицированное животное, которое экспрессирует химерное антитело и экспрессирует белок ADAM6 или его ортолог или гомолог, который является функциональным у генетически модифицированного животного.

Согласно одному варианту осуществления генетически модифицированное животное выбрано из мыши и крысы. Согласно одному варианту осуществления генетически модифицированное животное представляет собой мышь, и белок ADAM6 или его ортолог или гомолог получен от линии мыши, которая представляет собой линию, отличную от линии генетически модифицированного животного. Согласно одному варианту осуществления генетически модифицированное животное представляет собой грызуна семейства Cricetidae (например, хомяк, крыса и мышь Нового Света, полевка), и ортолог или гомолог белка ADAM6 получен от грызуна семейства Muridae (например, настоящая мышь и крыса, карликовая песчанка, иглистая мышь, косматый хомяк). Согласно одному варианту осуществления генетически модифицированное животное представляет собой грызуна семейства Muridae, и ортолог или гомолог белка ADAM6 получен от грызуна семейства Cricetidae.

Согласно одному варианту осуществления химерное антитело содержит вариабельный домен человека и последовательность константной области грызуна. Согласно одному варианту осуществления грызун выбран из грызуна семейства Cricetidae и грызуна семейства Muridae. Согласно конкретному варианту осуществления грызун семейства Cricetidae и семейства Muridae представляет собой мышь. Согласно конкретному варианту осуществления грызун семейства Cricetidae и семейства Muridae представляет собой крысу. Согласно одному варианту осуществления химерное антитело содержит вариабельный домен человека и константный домен от животного, выбранного из мыши или крысы; согласно конкретному варианту осуществления мышь или крыса выбрана из семейства Cricetidae и семейства Muridae. Согласно одному варианту осуществления химерное антитело содержит вариабельный домен тяжелой цепи человека, вариабельный домен легкой цепи человека и последовательность константной области, происходящую от грызуна, выбранного из мыши и крысы, причем вариабельный домен тяжелой цепи человека и легкая цепь человека являются когнатными. Согласно конкретному варианту осуществления термин "когнатный" включает в себя, что вариабельные домены тяжелой цепи человека и легкой цепи человека происходят из одной В-клетки, которая экспрессирует вариабельный домен легкой цепи человека и вариабельный домен тяжелой цепи человека вместе и представляет вариабельные домены вместе на поверхности отдельной В-клетки.

Согласно одному варианту осуществления химерное антитело экспрессируется из локуса иммуноглобулина. Согласно одному варианту осуществления вариабельный домен тяжелой цепи химерного антитела экспрессируется из реаранжированного эндогенного локуса тяжелой цепи иммуноглобулина. Согласно одному варианту осуществления вариабельный домен легкой цепи химерного антитела экспрессируется из реаранжированного эндогенного локуса легкой цепи иммуноглобулина. Согласно одному варианту осуществления вариабельный домен тяжелой цепи химерного антитела и/или вариабельный домен легкой цепи химерного антитела экспрессируется из реаранжированного трансгена (например, реаранжированной последовательности нуклеиновой кислоты, происходящей из нереаранжированной последовательности нуклеиновой кислоты, интегрированной в геном животного на локусе, отличном от эндогенного локуса иммуноглобулина). Согласно одному варианту осуществления вариабельный домен легкой цепи химерного антитела экспрессируется из реаранжированного трансгена (например, реаранжированной последовательности нуклеиновой кислоты, происходящей из нереаранжированной последовательности нуклеиновой кислоты, интегрированной в геном животного на локусе, отличном от эндогенного локуса иммуноглобулина).

Согласно конкретному варианту осуществления трансген экспрессируется из транскрипционально активного локуса, например, локуса ROSA26, например, мышиного (например, относящегося к мыши) локуса ROSA26.

Согласно одному аспекту предусмотрено не относящееся к человеку животное, содержащее гуманизированный локус тяжелой цепи иммуноглобулина, причем гуманизированный локус тяжелой цепи иммуноглобулина содержит не относящуюся к человеку последовательность ADAM6 или ее ортолог или гомолог.

Согласно одному варианту осуществления не относящийся к человеку ортолог или гомолог ADAM6 представляет собой последовательность, которая является ортологичной и/или гомологичной последовательности ADAM6 мыши, причем ортолог или гомолог является функциональным у не относящегося к человеку животного.

Согласно одному варианту осуществления не относящееся к человеку животное представляет собой грызуна, выбранного из мыши, крысы и хомяка.

Согласно одному варианту осуществления не относящееся к человеку животное выбрано из мыши, крысы и хомяка, и ортолог или гомолог ADAM6 происходит от не относящегося к человеку животного, выбранного из мыши, крысы и хомяка. Согласно конкретному варианту осуществления не относящееся к человеку животное представляет собой мышь, и ортолог или гомолог ADAM6 происходит от животного, которое выбрано из другого вида мыши, крысы и хомяка. Согласно конкретному варианту осуществления не относящееся к человеку животное представляет собой крысу, и ортолог или гомолог ADAM6 происходит от грызуна, который выбран из другого вида крысы, мыши и хомяка. Согласно конкретному варианту осуществления не относящееся к человеку животное представляет собой хомяка, и ортолог или гомолог ADAM6 происходит от грызуна, который выбран из другого вида хомяка, мыши и крысы.

Согласно конкретному варианту осуществления не относящееся к человеку животное происходит из подотряда Myomorpha, и последовательность ADAM6 происходит от животного, выбранного из грызуна надсемейства Dipodoidea и грызуна надсемейства Muroidea. Согласно конкретному варианту осуществления грызун представляет собой мышь надсемейства Muroidea, и ортолог или гомолог ADAM6 происходит от мыши или крысы или хомяка надсемейства Muroidea.

Согласно одному варианту осуществления гуманизированный локус тяжелой цепи содержит единственный генный сегмент VH человека, один или несколько генных сегментов DH человека и один или несколько генных сегментов JH человека. Согласно конкретному варианту осуществления генный сегмент VH человека, один или несколько генных сегментов DH человека и один или несколько генных сегментов JH человека функционально связаны с одним или несколькими относящимися к человеку, химерными и/или относящимися к грызуну (например, мыши или крысе) генами константной области. Согласно одному варианту осуществления гены константной области относятся к мыши. Согласно одному варианту осуществления гены константной области относятся к крысе. Согласно одному варианту осуществления гены константной области относятся к хомяку. Согласно одному варианту осуществления гены константной области содержат последовательность, выбранную из шарнира, CH2, CH3 и их комбинации. Согласно конкретному варианту осуществления гены константной области содержат последовательность шарнира, CH2 и CH3.

Согласно одному варианту осуществления не относящаяся к человеку последовательность ADAM6 является смежной с последовательностью тяжелой цепи иммуноглобулина человека. Согласно одному варианту осуществления не относящаяся к человеку последовательность ADAM6 расположена в пределах последовательности тяжелой цепи иммуноглобулина человека. Согласно конкретному варианту осуществления последовательность тяжелой цепи иммуноглобулина человека содержит генный сегмент V, D и/или J.

Согласно одному варианту осуществления не относящаяся к человеку последовательность ADAM6 расположена погранично с генным сегментом V. Согласно одному варианту осуществления не относящаяся к человеку последовательность ADAM6 расположена между двумя генными сегментами V. Согласно одному варианту осуществления не относящаяся к человеку последовательность ADAM6 расположена погранично между генным сегментом V и генным сегментом D. Согласно одному варианту осуществления последовательность ADAM6 мыши расположена между генным сегментом V и генным сегментом J. Согласно одному варианту осуществления последовательность ADAM6 мыши расположена погранично между генным сегментом D и генным сегментом J.

Согласно одному аспекту предусмотрено генетически модифицированное не относящееся к человеку животное, содержащее В-клетку, которая экспрессирует домен VH человека, когнатный домену VL человека из локуса иммуноглобулина, причем не относящееся к человеку животное экспрессирует не относящийся к иммуноглобулину не относящийся к человеку белок из локуса иммуноглобулина. Согласно одному варианту осуществления не относящийся к иммуноглобулину не относящийся к человеку белок представляет собой белок ADAM. Согласно конкретному варианту осуществления белок ADAM представляет собой белок ADAM6 или его гомолог или ортолог или функциональный фрагмент.

Согласно одному варианту осуществления не относящееся к человеку животное представляет собой грызуна (например, мышь или крысу). Согласно одному варианту осуществления грызун происходит из семейства Muridae. Согласно одному варианту осуществления грызун происходит из подсемейства Murinae. Согласно конкретному варианту осуществления грызун подсемейства Murinae выбран из мыши и крысы.

Согласно одному варианту осуществления не относящийся к иммуноглобулину не относящийся к человеку белок представляет собой белок грызуна. Согласно одному варианту осуществления грызун происходит из семейства Muridae. Согласно одному варианту осуществления грызун происходит из подсемейства Murinae. Согласно конкретному варианту осуществления грызун выбран из мыши, крысы и хомяка.

Согласно одному варианту осуществления домены VH и VL человека прикреплены напрямую или через линкер к последовательности константного домена иммуноглобулина. Согласно конкретному варианту осуществления последовательность константного домена содержит последовательность, выбранную из шарнира, CH2, CH3 и их комбинации. Согласно конкретному варианту осуществления домен VL человека выбран из домена Vκ или Vλ.

Согласно одному аспекту предусмотрено генетически модифицированное не относящееся к человеку животное, содержащее в своей зародышевой линии последовательность иммуноглобулина человека, причем сперма самца не относящегося к человеку животного характеризуется нарушением миграции in vivo. Согласно одному варианту осуществления нарушение миграции in vivo предусматривает неспособность спермы самца не относящегося к человеку животного мигрировать из матки через яйцевод самки не относящегося к человеку животного того же вида. Согласно одному варианту осуществления не относящееся к человеку животное не содержит нуклеотидную последовательность, которая кодирует белок ADAM6 или его функциональный фрагмент. Согласно конкретному варианту осуществления белок ADAM6 или его функциональный фрагмент включает в себя белок ADAM6a и/или ADAM6b или его функциональный фрагменты. Согласно одному варианту осуществления не относящееся к человеку животное представляет собой грызуна. Согласно конкретному варианту осуществления грызун выбран из мыши, крысы и хомяка.

Согласно одному аспекту предусмотрено не относящееся к человеку животное, содержащее последовательность иммуноглобулина человека, смежную с не относящейся к человеку последовательностью, которая кодирует белок ADAM6 или его ортолог или гомолог или функциональный фрагмент. Согласно одному варианту осуществления не относящееся к человеку животное представляет собой грызуна. Согласно конкретному варианту осуществления грызун выбран из мыши, крысы и хомяка.

Согласно одному варианту осуществления последовательность иммуноглобулина человека представляет собой последовательность тяжелой цепи иммуноглобулина. Согласно одному варианту осуществления последовательность иммуноглобулина содержит единственные генные сегменты VH. Согласно одному варианту осуществления последовательность иммуноглобулина человека содержит один или несколько генных сегментов DH. Согласно одному варианту осуществления последовательность иммуноглобулина человека содержит один или несколько генных сегментов JH. Согласно одному варианту осуществления последовательность иммуноглобулина человека содержит единственные генные сегменты VH, один или несколько генных сегментов DH и один или несколько генных сегментов JH.

Согласно одному варианту осуществления последовательность иммуноглобулина содержит единственный генный сегмент VH, который связан с полиморфизмом в природных репертуарах человека. Согласно конкретному варианту осуществления единственный генный сегмент VH выбран из VH1-2, VH1-69, VH2-26, VH2-70 или VH3-23 человека. Согласно другому конкретному варианту осуществления единственный генный сегмент VH представляет собой VH1-2. Согласно другому конкретному варианту осуществления единственный генный сегмент VH представляет собой VH1-69.

Согласно одному варианту осуществления последовательность иммуноглобулина содержит единственный генный сегмент VH, который связан с множественным числом копий в природных репертуарах человека. Согласно конкретному варианту осуществления единственный генный сегмент VH выбран из VH1-2, VH1-69, VH2-26, VH2-70 или VH3-23 человека. Согласно другому конкретному варианту осуществления единственный генный сегмент VH представляет собой VH1-2. Согласно другому конкретному варианту осуществления единственный генный сегмент VH представляет собой VH1-69.

Согласно различным вариантам осуществления генный сегмент VH выбран из VH6-1, VH1-2, VH1-3, VH2-5, VH3-7, VH1-8, VH3-9, VH3-11, VH3-13, VH3-15, VH3-16, VH1-18, VH3-20, VH3-21, VH3-23, VH1-24, VH2-26, VH4-28, VH3-30, VH4-31, VH3-33, VH4-34, VH3-35, VH3-38, VH4-39, VH3-43, VH1-45, VH1-46, VH3-48, VH3-49, VH5-51, VH3-53, VH1-58, VH4-59, VH4-61, VH3-64, VH3-66, VH1-69, VH2-70, VH3-72, VH3-73 и VH3-74.

Согласно различным вариантам осуществления генный сегмент VH выбран из таблицы 1 и представлен в природных репертуарах человека пятью или более аллелями. Согласно конкретному варианту осуществления ген VH выбран из VH1-2, VH1-69, VH2-5, VH2-70, VH3-15, VH3-23, VH3-30, VH3-33, VH3-49, VH3-64, VH4-4, VH4-28, VH4-30-2, VH4-30-4, VH4-31, VH4-34, VH4-39, VH4-59, VH4-61, VH5-51 и VH7-4-1.

Согласно одному варианту осуществления не относящееся к человеку животное представляет собой мышь, и мышь содержит замещение эндогенных генных сегментов VH мыши единственными генными сегментами VH человека, причем генный сегмент VH человека функционально связан с геном области CH мыши так, что мышь реаранжирует генный сегмент VH человека и экспрессирует обратную химерную тяжелую цепь иммуноглобулина, которая содержит домен VH человека и CH мыши. Согласно одному варианту осуществления 90-100% нереаранжированных генных сегментов VH мыши замещают одним нереаранжированным генным сегментом VH человека. Согласно конкретному варианту осуществления все или по существу все эндогенные генные сегменты VH мыши замещают одним нереаранжированным генным сегментом VH человека. Согласно одному варианту осуществления замещение осуществляют нереаранжированным генным сегментом VH1-69 человека. Согласно одному варианту осуществления замещение осуществляют нереаранжированным генным сегментом VH1-2 человека. Согласно одному варианту осуществления замещение осуществляют нереаранжированным генным сегментом VH2-26 человека. Согласно одному варианту осуществления замещение осуществляют нереаранжированным генным сегментом VH2-70 человека. Согласно одному варианту осуществления замещение осуществляют нереаранжированным генным сегментом VH3-23 человека.

Согласно одному варианту осуществления мышь содержит замещение всех сегментов DH и JH мыши по меньшей мере одним нереаранжированным сегментом DH человека и по меньшей мере одним нереаранжированным сегментом JH человека. Согласно одному варианту осуществления по меньшей мере один нереаранжированный сегмент DH человека выбран из 1-1, 1-7, 1-26, 2-8, 2-15, 3-3, 3-10, 3-16, 3-22, 5-5, 5-12, 6-6, 6-13, 7-27 и их комбинации. Согласно одному варианту осуществления по меньшей мере один нереаранжированный сегмент JH человека выбран из 1, 2, 3, 4, 5, 6 и их комбинации.

Согласно различным вариантам осуществления последовательность иммуноглобулина человека функционально связана с константной областью в зародышевой линии не относящегося к человеку животного (например, грызуна, например, мыши, крысы или хомяка). Согласно одному варианту осуществления константная область представляет собой константную область человека, химерную относящуюся к человеку/мыши или химерную относящуюся к человеку/крысе или химерную относящуюся к человеку/хомяку, относящуюся к мыши, крысе или хомяку константную область. Согласно одному варианту осуществления константная область представляет собой константную область грызуна (например, мыши или крысы или хомяка). Согласно конкретному варианту осуществления грызун представляет собой мышь или крысу. Согласно различным вариантам осуществления константная область содержит по меньшей мере домен CH2 и домен CH3.

Согласно одному варианту осуществления последовательность тяжелой цепи иммуноглобулина человека расположена на локусе тяжелой цепи иммуноглобулина в зародышевой линии не относящегося к человеку животного (например, грызуна, например, мыши или крысы или хомяка). Согласно одному варианту осуществления последовательность тяжелой цепи иммуноглобулина человека расположена на не относящемся к тяжелой цепи иммуноглобулина локусе в зародышевой линии не относящегося к человеку животного, причем не относящийся к тяжелой цепи локус представляет собой транскрипционально активный локус. Согласно конкретному варианту осуществления не относящийся к тяжелой цепи локус представляет собой локус ROSA26.

Согласно различным аспектам не относящееся к человеку животное дополнительно содержит последовательность легкой цепи иммуноглобулина человека (например, одну или несколько нереаранжированных последовательностей легкой цепи V и J, или одну или несколько реаранжированных последовательностей VJ) в зародышевой линии не относящегося к человеку животного. Согласно конкретному варианту осуществления последовательность легкой цепи иммуноглобулина представляет собой последовательность κ легкой цепи иммуноглобулин. Согласно одному варианту осуществления последовательность легкой цепи иммуноглобулина человека содержит один или несколько генных сегментов VL. Согласно одному варианту осуществления последовательность легкой цепи иммуноглобулина человека содержит один или несколько генных сегментов JL. Согласно одному варианту осуществления последовательность легкой цепи иммуноглобулина человека содержит один или несколько генных сегментов VL и один или несколько генных сегментов JL. Согласно конкретному варианту осуществления последовательность легкой цепи иммуноглобулина человека содержит по меньшей мере 16 генных сегментов Vκ и пять генных сегментов Jκ. Согласно конкретному варианту осуществления последовательность легкой цепи иммуноглобулина человека содержит по меньшей мере 30 генных сегментов Vκ и пять генных сегментов Jκ. Согласно конкретному варианту осуществления последовательность легкой цепи иммуноглобулина человека содержит по меньшей мере 40 генных сегментов Vκ и пять генных сегментов Jκ. Согласно различным вариантам осуществления последовательность легкой цепи иммуноглобулина человека функционально связана с константной областью в зародышевой линии не относящегося к человеку животного (например, грызуна, например, мыши или крысы или хомяка). Согласно одному варианту осуществления константная область представляет собой константную область человека, химерную относящуюся к человеку/грызуну константную область, относящуюся к мыши, крысе или хомяку константную область. Согласно конкретному варианту осуществления константная область представляет собой константную область мыши или крысы. Согласно конкретному варианту осуществления константная область представляет собой константную область мыши κ (mCκ) или константную область крысы κ (rCκ).

Согласно одному варианту осуществления не относящееся к человеку животное представляет собой мышь, и мышь содержит замещение всех или по существу всех генных сегментов Vκ и Jκ по меньшей мере шестью генными сегментами Vκ человека и по меньшей мере одним генным сегментом Jκ. Согласно одному варианту осуществления все или по существу все генные сегменты Vκ и Jκ замещают по меньшей мере 16 генными сегментами Vκ человека (Vκ человека) и по меньшей мере одним генным сегментом Jκ. Согласно одному варианту осуществления все или по существу все генные сегменты Vκ и Jκ замещают по меньшей мере 30 генными сегментами Vκ человека и по меньшей мере одним генным сегментом Jκ. Согласно одному варианту осуществления все или по существу все генные сегменты Vκ и Jκ замещают по меньшей мере 40 генными сегментами Vκ человека и по меньшей мере одним генным сегментом Jκ. Согласно одному варианту осуществления по меньшей мере один генный сегмент Jκ содержит два, три, четыре или пять генных сегментов Jκ человека.

Согласно одному варианту осуществления генные сегменты Vκ человека содержат Vκ4-1, Vκ5-2, Vκ7-3, Vκ2-4, Vκ1-5 и Vκ1-6. Согласно одному варианту осуществления генные сегменты Vκ содержат Vκ3-7, Vκ1-8, Vκ1-9, Vκ2-10, Vκ3-11, Vκ1-12, Vκ1-13, Vκ2-14, Vκ3-15 и Vκ1-16. Согласно одному варианту осуществления генные сегменты Vκ человека содержат Vκ1-17, Vκ2-18, Vκ2-19, Vκ3-20, Vκ6-21, Vκ1-22, Vκ1-23, Vκ2-24, Vκ3-25, Vκ2-26, Vκ1-27, Vκ2-28, Vκ2-29 и Vκ2-30. Согласно одному варианту осуществления генные сегменты Vκ человека содержат Vκ3-31, Vκ1-32, Vκ1-33, Vκ3-34, Vκ1-35, Vκ2-36, Vκ1-37, Vκ2-38, Vκ1-39 и Vκ2-40.

Согласно конкретному варианту осуществления генные сегменты Vκ содержат смежные генные сегменты κ иммуноглобулина человека, охватывающие локус κ легкой цепи иммуноглобулина человека от Vκ4-1 до Vκ2-40, и генные сегменты Jκ содержат смежные генные сегменты, охватывающие локус κ легкой цепи иммуноглобулина человека от Jκ 1 до Jκ 5.

Согласно одному варианту осуществления последовательность легкой цепи иммуноглобулина человека расположена на локусе легкой цепи иммуноглобулина в зародышевой линии не относящегося к человеку животного. Согласно конкретному варианту осуществления локус легкой цепи иммуноглобулина в зародышевой линии не относящегося к человеку животного представляет собой локус κ легкой цепи иммуноглобулина. Согласно одному варианту осуществления последовательность легкой цепи иммуноглобулина человека расположена на не относящемся κ легкой цепи иммуноглобулина локусе в зародышевой линии не относящегося к человеку животного, который является транскрипционально активным. Согласно конкретному варианту осуществления не относящийся к иммуноглобулину локус представляет собой локус ROSA26.

Согласно одному аспекту предусмотрен способ получения антитела человека, причем антитело человека содержит вариабельные домены, происходящие из одной или нескольких последовательностей нуклеиновой кислоты вариабельной области, кодируемых в клетке описанного в настоящем документе не относящегося к человеку животного.

Согласно одному аспекту предусмотрен способ получения антиидиотипического антитела, причем антиидиотипическое антитело содержит вариабельные домены, происходящие из одной или нескольких последовательностей нуклеиновой кислоты вариабельной области, кодируемых в клетке описанного в настоящем документе не относящегося к человеку животного, причем способ предусматривает воздействие на описанное в настоящем документе не относящееся к человеку животное антитела, содержащего вариабельные домены человека. Согласно одному варианту осуществления антиидиотипическое антитело является специфическим в отношении вариабельного домена тяжелой цепи человека или способно с ним связаться. Согласно одному варианту осуществления антитело является специфическим в отношении вариабельного домена легкой цепи человека или способно с ним связаться.

Согласно конкретному варианту осуществления антиидиотипическое антитело является специфическим в отношении вариабельного домена тяжелой цепи человека или способно с ним связаться, причем вариабельный домен тяжелой цепи человека содержит реаранжированный генный сегмент VH человека, выбранный из VH6-1, VH1-2, VH1-3, VH2-5, VH3-7, VH1-8, VH3-9, VH3-11, VH3-13, VH3-15, VH3-16, VH1-18, VH3-20, VH3-21, VH3-23, VH1-24, VH2-26, VH4-28, VH3-30, VH4-31, VH3-33, VH4-34, VH3-35, VH3-38, VH4-39, VH3-43, VH1-45, VH1-46, VH3-48, VH3-49, VH5-51, VH3-53, VH1-58, VH4-59, VH4-61, VH3-64, VH3-66, VH1-69, VH2-70, VH3-72, VH3-73 и VH3-74.

Согласно конкретному варианту осуществления антиидиотипическое антитело является специфическим в отношении вариабельного домена тяжелой цепи человека или способно с ним связаться, причем вариабельный домен тяжелой цепи человека содержит реаранжированный генный сегмент VH человека, выбранный из VH1-2, VH1-69, VH2-5, VH2-70, VH3-15, VH3-23, VH3-30, VH3-33, VH3-49, VH3-64, VH4-4, VH4-28, VH4-30-2, VH4-30-4, VH4-31, VH4-34, VH4-39, VH4-59, VH4-61, VH5-51 и VH7-4-1.

Согласно конкретному варианту осуществления антиидиотипическое антитело является специфическим в отношении вариабельного домена легкой цепи человека или способно с ним связаться, причем вариабельный домен легкой цепи человека содержит реаранжированный генный сегмент Vκ человека, выбранный из Vκ4-1, Vκ5-2, Vκ7-3, Vκ2-4, Vκ1-5, Vκ1-6, Vκ3-7, Vκ1-8, Vκ1-9, Vκ2-10, Vκ3-11, Vκ1-12, Vκ1-13, Vκ2-14, Vκ3-15, Vκ1-16, Vκ1-17, Vκ2-18, Vκ2-19, Vκ3-20, Vκ6-21, Vκ1-22, Vκ1-23, Vκ2-24, Vκ3-25, Vκ2-26, Vκ1-27, Vκ2-28, Vκ2-29, Vκ2-30, Vκ3-31, Vκ1-32, Vκ1-33, Vκ3-34, Vκ1-35, Vκ2-36, Vκ1-37, Vκ2-38, Vκ1-39 и Vκ2-40.

Согласно конкретному варианту осуществления антиидиотипическое антитело является специфическим в отношении вариабельного домена легкой цепи человека или способно с ним связаться, причем вариабельный домен легкой цепи человека содержит реаранжированный генный сегмент Vκ1-39 человека.

Согласно конкретному варианту осуществления антиидиотипическое антитело является специфическим в отношении вариабельного домена легкой цепи человека или способно с ним связаться, причем вариабельный домен легкой цепи человека содержит реаранжированный генный сегмент Vλ человека, выбранный из Vλ3-1, Vλ4-3, Vλ2-8, Vλ3-9, Vλ3-10, Vλ2-11, Vλ3-12, Vλ2-11, Vλ3-16, Vλ2-18, Vλ3-19, Vλ3-21, Vλ3-22, Vλ2-23, Vλ3-25, Vλ3-27, Vλ3-32, Vλ2-33, Vλ2-34, Vλ1-36, Vλ1-40, Vλ1-43, Vλ1-44, Vλ5-45, Vλ7-46, Vλ1-47, Vλ5-48, Vλ9-49, Vλ1-50, Vλ1-51, Vλ5-52, Vλ10-54, Vλ11-55, Vλ6-57, Vλ4-60, Vλ8-61 и Vλ4-69.

Согласно одному варианту осуществления предусмотрен способ получения антиидиотипического антитела, причем антиидиотипическое антитело содержит вариабельные домены, происходящие из одной или нескольких последовательностей нуклеиновой кислоты вариабельной области, кодируемых в клетке не относящегося к человеку животного, которое содержит ограниченный локус тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащий единственный генный сегмент VH человека, 27 генных сегментов DH и шесть генных сегментов JH, и причем антиидиотипическое антитело является специфическим в отношении вариабельного домена тяжелой цепи человека или способно связаться с вариабельным доменом тяжелой цепи человека, содержащим реаранжированный генный сегмент VH1-69 человека, причем способ предусматривает воздействие на не относящегося к человеку животное антитела, содержащего реаранжированный генный сегмент VH1-69 человека, и выделение антиидиотипического антитела из не относящегося к человеку животного. Согласно конкретному варианту осуществления единственный генный сегмент VH человека выбран из генного сегмента VH1-2 человека и генного сегмента VH1-69 человека.

Согласно одному варианту осуществления предусмотрен способ получения антиидиотипического антитела, причем антиидиотипическое антитело содержит вариабельные домены, происходящие из одной или нескольких последовательностей нуклеиновой кислоты вариабельной области, кодируемых в клетке не относящегося к человеку животного, которое содержит ограниченный локус тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащий единственный генный сегмент VH человека, 27 генных сегментов DH и шесть генных сегментов JH, и причем антиидиотипическое антитело является специфическим в отношении вариабельного домена легкой цепи человека или способно связаться с вариабельным доменом легкой цепи человека, содержащим реаранжированный генный сегмент Vκ1-39 человека, причем способ предусматривает воздействие на не относящееся к человеку животное антитела, содержащего генный сегмент Vκ1-39 человека, и выделение антитела из не относящегося к человеку животного. Согласно конкретному варианту осуществления единственный генный сегмент VH человека выбран из генного сегмента VH1-2 человека и генного сегмента VH1-69 человека.

Согласно одному аспекту предусмотрена фармацевтическая композиция, содержащая полипептид, который содержит антитело или фрагмент антитела, который происходит из одной или нескольких последовательностей нуклеиновой кислоты вариабельной области, выделенных из описанного в настоящем документе не относящегося к человеку животного. Согласно одному варианту осуществления полипептид представляет собой антитело. Согласно одному варианту осуществления полипептид представляет собой антитело только к тяжелой цепью. Согласно одному варианту осуществления полипептид представляет собой одноцепочечный вариабельный фрагмент (например, scFv).

Согласно одному аспекту предусмотрено применение описанного в настоящем документе не относящегося к человеку животного для получения антитела. Согласно различным вариантам осуществления антитело содержит один или несколько вариабельных доменов, которые происходят из одной или нескольких последовательностей нуклеиновой кислоты вариабельной области, выделенных из не относящегося к человеку животного. Согласно конкретному варианту осуществления последовательности нуклеиновой кислоты вариабельной области содержат генные сегменты тяжелой цепи иммуноглобулина. Согласно конкретному варианту осуществления последовательности нуклеиновой кислоты вариабельной области содержат генные сегменты легкой цепи иммуноглобулина.

ПРИМЕРЫ

Предусмотрены следующие примеры, чтобы описать специалистам в настоящей области техники, как производить и применять способы и композиции согласно настоящему изобретению, и не предназначены для ограничения объема того, что авторы настоящего изобретения считают своим изобретением. Если не указано иное, температура указана в градусах Цельсия, а давление равно или близко к атмосферному.

Пример 1

Конструирование ограниченного гуманизированного локуса IgH

Уникально сконструированный локус тяжелой цепи человека, содержащий единственный генный сегмент VH человека, расположенный выше всех генных сегментов DH и JH человека, можно сконструировать с помощью гомологичной рекомбинации с использованием ДНК бактериальной искусственной хромосомы (ВАС). Иллюстративные генные сегменты VH человека, используемые для конструирования такого локуса тяжелой цепи иммуноглобулина, включают в себя полиморфные генные сегменты VH и/или генные сегменты VH, связанные с изменчивостью в числе копий, такие как, например VH1-2, VH1-69, VH2-26, VH2-70 и VH3-23. Технологию генной инженерии VELOCIGENE® можно использовать для создания единственного содержащего VH локуса тяжелой цепи с применением нескольких нацеливающих конструктов (смотрите, например, патент США №6586251 и Valenzuela, D.M. et al., 2003, High-throughput engineering of the mouse genome coupled with high-resolution expression analysis. Nature Biotechnology 21(6): 652-659).

Иллюстративная стратегия для конструирования ограниченного локуса IgH VH1-69 человека (фиг. 1). На первой стадии модифицированную ВАС человека, содержащую множественные дистальные (5') генные сегменты VH человека, включая в себя VH1-69, вышележащую кассету селекции (например, гигромициновую) и 5' гомологичное плечо мыши нацеливали с помощью гомологичной рекомбинации с помощью второй кассеты селекции (например, спектиномициновой), которая также содержала модифицированную сигнальную последовательность рекомбинации (стадия 1, фиг. 1). Указанная модифицированная сигнальная последовательность рекомбинации (RSS) вводила две точечные мутации (Т на А и G на А) в 3' RSS область гена VH1-69 человека, заменяя нонамер RSS на оптимальную консенсусную последовательность. Таким образом, стадия 1 давала в результате геномный фрагмент человека, содержащий генный сегмент VH1-69 человека с модифицированной 3' RSS, уникальным сайтом рестрикции AsiSI приблизительно 180 п.н. ниже относительно RSS и спектиномициновой кассетой.

Стадия 2 включала в себя применение неомициновой (Neo) кассетой, фланкированной сайтами Frt для делеции кассеты селекции (гигромицин) и дополнительных вышележащих (5') генных сегментов VH человека. Указанная модификация была нацелена, с помощью гомологичной рекомбинации, на 5' относительно генного сегмента VH1-69 человека, чтобы оставить интактными приблизительно 8,2 т.п.н. промоторной области VH1-69 человека и 5' гомологичное плечо мыши.

Стадия 3 включала в себя другую кассету селекции (спектиномициновую), фланкированную уникально сконструированными сайтами рестрикции (например, PI-SceI и AsiSI), нацеленную с помощью гомологичной рекомбинации на геномный фрагмент человека, содержащий первые три функциональных генных сегмента VH человека и все генные сегменты DH и JH человека (фиг. 1). Геномный фрагмент человека предварительно подвергали нацеленному воздействию с помощью гомологичной рекомбинации с помощью неомициновой кассеты, и он содержал 5' и 3' гомологичные плечи, содержащие геномную последовательность мыши 5' и 3' относительно эндогенного локуса тяжелой цепи, включая в себя 3' интронный энхансер и ген IgM. Указанная модификация удаляла 5' геномную последовательность мыши и генные сегменты VH человека, оставляя приблизительно 3.3 т.п.н. межгенной области VH-DH выше относительно генного сегмента DH1-1 человека, все сегменты DH и JH человека и 3' геномный фрагмент мыши, содержащий 3' интронный энхансер и ген IgM (фиг. 1).

Стадию 4 осуществляли с использованием уникальных сайтов рестрикции (описанных выше) для разрезания с последующим лигированием двух модифицированных ВАС из стадии 2 и стадии 3, что давало в результате конечный нацеливающий конструкт. Конечный нацеливающий конструкт для создания модифицированного локуса тяжелой цепи, содержащий генный сегмент VH1-69 человека, все генные сегменты DH человека и все генные сегменты JH человека в ES клетках, содержал, в направлении 5'-3', 5' гомологичное плечо, содержащее приблизительно 20 т.п.н. геномной последовательности мыши выше относительно эндогенного локуса тяжелой цепи, 5' Frt сайт, неомициновую кассету, 3' Frt сайт, приблизительно 8,2 т.п.н. промотора VH1-69 человека, генный сегмент VH1-69 человека с модифицированной 3' RSS, 27 генных сегментов DH человека, шесть сегментов JH человека и 3' гомологичное плечо, содержащее приблизительно 8 т.п.н. геномной последовательности мыши ниже относительно генных сегментов JH мыши, включая в себя 3'' интронный энхансер и ген IgM (фиг. 1).

Иллюстративная стратегия для конструирования ограниченного локуса IgH VH1-2 человека (фиг. 2). Аналогичным образом, другие полиморфные генные сегменты VH, связанные с константными областями тяжелой цепи мыши, используют для конструкции серии мышей, содержащих ограниченное число сегментов V тяжелой цепи иммуноглобулина (например, 1, 2, 3, 4 или 5), причем сегменты V представляют собой полиморфные варианты представителя семейства генов V. Иллюстративные полиморфные генные сегменты VH происходят от генных сегментов VH человека включая в себя, например, VH1-2, VH2-26, VH2-70 и VH3-23. Такие генные сегменты VH человека получают, например, путем синтез de novo (например, технология Blue Heron, Bothell, WA) с использованием последовательности, доступные из опубликованных баз данных. Таким образом, фрагменты ДНК, кодирующие каждый ген VH, согласно некоторым вариантам осуществления получают независимо для включения в описанный в настоящем документе нацеливающий вектор. Таким образом, множественные модифицированные локусы тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащие ограниченное число генных сегментов VH, конструируют связанными с константными областями тяжелой цепи мыши. Иллюстративная стратегия нацеливания для создания ограниченного гуманизированного локуса тяжелой цепи, содержащего генный сегмент VH1-2 человека, 27 генных сегментов DH человека и шесть генных сегментов JH человека, показана на фиг. 2.

Вкратце, модифицированный клон ВАС человека, содержащий три генных сегмента VH человека (VH6-1, VH1-2, VH1-3), 27 генных сегментов DH человека и шесть генных сегментов JH человека (смотрите USSN 13/404075; поданный 24 февраля 2012), используют для создания ограниченного гуманизированного локуса тяжелой цепи, содержащего генный сегмент VHI-2 человека. Этот модифицированный клон ВАС функционально связывает вышеупомянутые генные сегменты тяжелой цепи человека с интронным энхансером мыши и константной областью IgM. Ограниченный локус тяжелой цепи на основе VH1-2 человека получают с помощью двух гомологичных рекомбинаций с использованием описанного выше модифицированного клона ВАС человека. В первой гомологичной рекомбинации, 205 п.о. генного сегмента VH6-1 человека (от приблизительно 10 п.о. выше по ходу транскрипции (5') от стартового кодона VH6-1 в экзоне 1 до приблизительно 63 п.о. ниже по ходу транскрипции (3') от начала экзона 2) в модифицированном клоне ВАС человека удаляют с помощью бактериальной гомологичной рекомбинации с использованием спектиномициновой (aadA) кассеты, окруженной уникальными сайтами рестрикции PI-SceI (фиг. 2, BHR 1). Это позволяет впоследствии удалять кассету aadA, не нарушая другие генные сегменты человека в ограниченном локусе тяжелой цепи. Во второй гомологичной рекомбинации, 5' конец модифицированного клона ВАС человека, включая в себя весь генный сегмент VH1-3 человека и около 60 п.о. ниже по ходу транскрипции (3') от генного сегмента, удаляют с помощью гомологичной рекомбинации с использованием гигромициновой кассеты, содержащей окруженные 5' AsiSI и 3' AscI сайты рестрикции (фиг. 2, BHR 2). Как описано выше, спектиномициновую кассету необязательно удаляют после подтверждения финального нацеливающего вектора, включая удаление двух генных сегментов VH человека, окружающих генный сегмент VH1-2 человека (фиг. 2, внизу). Иллюстративный нацеливающий вектор VH1-2 человека представлен в SEQ ID NO: 75.

Использование полиморфных генных сегментов VH в ограниченном локусе тяжелой цепи иммуноглобулина представляет собой новый подход к получению антител, популяции антител и популяции В-клеток, которые экспрессируют антитела, содержащие тяжелые цепи с различными CDR, полученными из единственного генного сегмента VH человека. Использование комплекса соматической гипермутации животного-хозяина вместе с комбинаторной ассоциацией с реаранжированными вариабельными доменами легкой цепи иммуноглобулина человека приводит к конструированию уникальных тяжелых цепей и уникальных пар VH/VL, которые расширяют иммунный репертуар генетически модифицированных животных и повышают их применимость в качестве платформы для создания нейтрализующих антител, специфичных к патогенам человека.

На основании структуры конечного требуемого локуса один из генных сегментов VH человека можно заменить аналогичным образом, используя клоны ВАС человека, содержащие требуемый генный сегмент VH человека. Таким образом, использование описанной выше стратегии для включения дополнительных и/или других полиморфных генных сегментов VH в локус тяжелой цепи иммуноглобулина мышь позволяет производить новые репертуары антител для использования в нейтрализации человеческих патогенов, которые могли бы эффективно ускользать от иммунной системы хозяина.

Описанные выше нацеленные ES клетки использовали в качестве доноров ES клеток и вводили в 8-клеточный эмбрион мыши с помощью способа VELOCIMOUSE® (смотрите выше). Мышей, несущих гуманизированный локус тяжелой цепи, содержащий единственный генный сегмент VH человека, все генных сегментов DH и JH человеческий, функционально связанные с генами константной области иммуноглобулина мыши, определяли путем генотипирования с использованием модификации анализа аллелей (Valenzuela et al., смотрите выше), который обнаружил присутствие неомициновой кассеты, генного сегмента VH человека и области в генных сегментах DH и JH человека, а также эндогенные последовательности тяжелой цепи. В таблице 43 представлены праймеры и зонды, используемые для подтверждения мышей, несущих ограниченный локус тяжелой цепи, содержащий единственный генный сегмент VH1-69 человека, 27 генных сегментов DH человека и шесть генных сегментов JH человека.

Мыши, несущие сконструированный локус тяжелой цепи, который содержит единственный генный сегмент VH человека, могут быть отнесены к линии FLPe делеторных мышей (смотрите, например, Rodriguez, C.I. et al. (2000) High-efficiency deleter mice show that FLPe is an alternative to Cre-loxP. Nature Genetics 25:139-140) для того, чтобы удалить любую неомициновую кассету, фланкированную сайтами Frt, введенную нацеливающим вектором, который не удаляют, например, на стадии ES клеток или в зародыше. Необязательно, неомициновая кассета остается в мышах.

Потомство является генотипированным, и выбирают детеныша, гетерозиготного по гуманизированному локусу тяжелой цепи, содержащей единственный генный сегмент VH человека, все сегменты DH и JH человека, функционально связанные с эндогенными константными генами иммуноглобулина мыши, для характеристики репертуара тяжелой цепи иммуноглобулина.

Пример 2

Реконструирование генов ADAM в ограниченный гуманизированный локус IgH

Мыши с гуманизированными локусами тяжелой цепи иммуноглобулина, у которых эндогенные генные сегменты вариабельной области (VDJ) подвергли замещению и/или делеции, не характеризуются экспрессией эндогенных генов ADAM6. В частности, самцы мышей, содержащие такие гуманизированные локусы тяжелой цепи иммуноглобулина, демонстрируют снижение фертильности. Таким образом, способность экспрессировать ADAM6 восстанавливали у мышей с гуманизированными, все еще ограниченными, локусами тяжелой цепи для сохранения модифицированных линий мышей с использованием способов нормального скрещивания.

Реконструирование генов ADAM6 в ограниченный локус VH1-69 IgH человека (фиг. 3). Ограниченный локус тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащий единственный генный сегмент VH1-69 человека, расположенный выше всех генных сегментов DH и JH человека, реконструировали так, чтобы он содержал геномный фрагмент, кодирующий ADAM6a и ADAM6b мыши (SEQ ID NO: 77) с помощью гомологичной рекомбинации с использованием ДНК ВАС. Это осуществляли с помощью технологии генной инженерии VELOCIGENE® (выше) в серии из шести стадий, которые включали в себя модификацию ДНК ВАС, содержащей последовательности мыши и человека, которая давала в результате конечный нацеливающий вектор, содержащий ограниченный гуманизированный локус тяжелой цепи, смежный с константными областями тяжелой цепи мыши и генами ADAM6 мыши.

Во-первых, получали геномный фрагмент мыши, который кодировал ADAM6a и ADAM6b мыши, для вставки в гуманизированный локус тяжелой цепи, содержащий единственные генные сегменты VH, с помощью серии из трех бактериальных гомологичных рекомбинаций, включающих в себя различные кассеты селекции для уникального расположения сайтов рестрикции вокруг генов ADAM6 мыши (фиг. 3, стадии 1-3). На первой стадии ДНК ВАС мыши, содержащую часть локуса тяжелой цепи иммуноглобулина мыши, подвергали нацеленному воздействию с помощью неомициновой кассеты, фланкированной сайтами рекомбинации, которую сконструировали так, чтобы она содержала уникальные сайты рестрикции AsiSI. На второй стадии модифицированный фрагмент мыши, содержащий гены ADAM6 мыши и неомициновую кассету, затем подвергали нацеленному воздействию для удаления генных сегментов DH и JH мыши и замещения их спектиномициновой кассетой, которая содержала уникальный сайт рестрикции AscI, расположенный 5' относительно гена селекции. На третьей стадии дважды модифицированный фрагмент мыши, содержащий неомициновую кассету, расположенную между генами ADAM6 мыши, и спектиномициновую кассету подвергали нацеленному воздействию для переключения неомициновой кассеты на гигромициновую кассету. Это проводили так, чтобы модифицированный геномный фрагмент мыши, содержащий гены ADAM6, мог быть введен путем лигирования совместимых геномных фрагментов в гуманизированный локус тяжелой цепи, содержащий единственный генный сегмент VH.

На четвертой стадии гуманизированный локус тяжелой цепи, содержащий генный сегмент VH1-69 человека, 27 генных сегментов DH человека и шесть генных сегментов JH человека отдельно подвергали нацеленному воздействию с помощью бактериальной гомологичной рекомбинации с помощью спектиномициновой кассеты, содержащей уникальные сайты рестрикции I-CeuI и AscI в положениях 5' и 3' в кассете, соответственно (фиг. 3, вверху слева). После указанной стадии модифицированный геномный фрагмент, содержащий ограниченный гуманизированный локус тяжелой цепи, неомициновую и спектиномициновую кассеты и модифицированный фрагмент мыши, содержащий гены ADAM6, гигромициновую и спектиномициновую кассеты, отдельно обрабатывали с помощью ферментов рестрикции I-CeuI и AscI для создания модифицированных геномных фрагментов для лигирования (фиг. 3, средняя часть). На пятой стадии соответствующие обработанные геномные фрагменты очищали и лигировали вместе для получения реконструированного гуманизированного локуса тяжелой цепи, содержащего единственный генный сегмент VH человека, 27 генных сегментов DH человека, шесть генных сегментов JH человека и интегрированный геномный фрагмент мыши, кодирующий ADAM6a и ADAM6b с устойчивостью к неомицину и гигромицину. На последней стадии (стадии 6) гигромициновую кассету удаляли с помощью обработки AsiSI с последующим повторным лигированием совместимых концов.

На этой стадии получали конечный нацеливающий вектор для повторной вставки последовательностей ADAM6a и ADAM6b мыши в ограниченный гуманизированный локус тяжелой цепи, который содержал, в направлении 5'-3', 5' гомологичное плечо, содержащее приблизительно 20 т.п.н. геномной последовательности мыши выше эндогенного локуса тяжелой цепи, 5' сайт Frt, неомициновую кассету, 3' сайт Frt, приблизительно 8,2 т.п.н. промотора VH1-69 человека, генный сегмент VH1-69 человека с модифицированной 3' RSS, геномный фрагмент мыши, содержащий приблизительно 17711 п.н. геномной последовательности мыши, включая в себя гены ADAM6a и ADAM6b мыши (SEQ ID NO: 77), геномный фрагмент человека, содержащий 27 генных сегментов DH человека и шесть генных сегментов JH человека, и 3' гомологичное плечо, содержащее приблизительно 8 т.п.н. геномной последовательности мыши ниже эндогенного локуса тяжелой цепи, включая в себя интронный энхансер и ген константной области IgM (нацеливающий вектор VH1-69/A6 человека, SEQ ID NO: 74; фиг. 3, нижняя часть).

Реконструирование генов ADAM6 в ограниченный локус IgH VH1-2 человека (фиг. 4).

Ограниченный локус тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащий единственный генный сегмент VH1-2 человека, расположенный выше всех генных сегментов DH и JH человека, реконструируют так, чтобы он содержал геномный фрагмент, кодирующий ADAM6a и ADAM6b мыши (SEQ ID NO: 73) с помощью гомологичной рекомбинации с использованием ДНК ВАС. Это осуществляли с помощью технологии генной инженерии VELOCIGENE® (выше) в серии стадий, которые включали в себя модификацию ДНК ВАС, содержащей последовательности мыши и человека, которая давала в результате конечный нацеливающий вектор, содержащий ограниченный гуманизированный локус тяжелой цепи, смежный с константными областями тяжелой цепи мыши и генами ADAM6 мыши.

Модифицированный клон ВАС человека, содержащий единственный генный сегмент VH1-2 человека, фланкированной 5' гигромициновой и 3' спектиномициновой кассетами, 27 генных сегментов DH человека, шесть генных сегментов JH человека, интронный энхансер тяжелой цепи мыши и константную область IgM мыши (описанную выше в примере 1), модифицировали так, чтобы он содержал геномный фрагмент, кодирующий гены ADAM6 мыши. Это осуществляют с помощью модифицированного способа изотермической сборки ДНК, который в настоящем документе называют олиго-опорседованная изотермическая сборка, которая основана на способе, описанном в Gibson et al. (2009, Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases, Nature Methods 6(5):343-345). Указанный модифицированный способ не требует идентичности последовательностей между лигируемыми фрагментами. Вместо этого, на идентичность последовательностей оказывает влияние олигонуклеотид, который служит для соединения двух фрагментов. Кроме того, олигонуклеотид служит в качестве матрицы, которая добавляет идентичность последовательностей к концу одного из фрагментов. Увеличенный фрагмент обеспечивает возможность гибридизации со вторым фрагментом. В частности, олиго-опосредованную изотермическую сборку использовали для замещения гигромициновой кассеты фрагментом NotI-AscI, содержащим 20 т.п.н. дистальное гомологичное плечо IgH мыши, ген ADAM6a мыши, неомициновую кассету, фланкированную сайтами Frt, и ген ADAM6b мыши.

Катко, модифицированный клон ВАС человека, содержащий ограниченный локус тяжелой цепи VH1-2 человека (фиг. 4, вверху слева) обрабатывают с помощью AsiSI и AscI для удаления гигромициновой кассеты, и модифицированную ВАС мыши, содержащую гены ADAM6 мышь (фиг. 4, вверху справа) обрабатывают с помощью NotI и AscI для удаления фрагмента, содержащего 5' плечо мыши, и высвобождения генов ADAM6 мыши, фланкирующих неомициновую кассету. Два обработанных фрагмента ВАС впоследствии смешивают вместе с 5' и 3' соединительными олигонуклеотидами и инкубируют в течение 1 часа при 50°С в реакционной смеси для сборки (Т5 экзонуклеаза, ДНК полимераза Phusion, ДНК лигаза Taq, 10 мМ DTT, 5% PEG8000 (масс./объем), 1 мМ NAD, 0,2 мМ dNTP, 10 мМ MgCl2 и 100 мМ трис-HCl). 5' соединительный олигонуклеотид содержит 38 п.н. перекрывание с последовательностью 5' сайта AsiSI модифицированного клона ВАС человека, содержащего VH1-2 человека, и 30 п.н. перекрывание с сайтом NotI и прилежащей 3' последовательностью модифицированного клона ВАС мыши, содержащего гены ADAM6. 3' соединительный олигонуклеотид содержит 26 п.н. перекрывание с последовательностью 5' относительно сайта AscI модифицированного клона ВАС мыши, содержащего гены ADAM6, сайт AscI, и 35 п.н. перекрывание с последовательность 3' относительно сайта AscI модифицированного клона ВАС человека, содержащего VH1-2 человека. Реакцию сборки трансформируют в Е. coli и правильный продукт выбирают с помощью селекции в отношении канамицина и спектиномицина. Для создания конечного нацеливающего вектора спектиномициновую кассету удаляют путем обработки с помощью PI-SceI с последующим повторным лигированием.

Конечный нацеливающий вектор содержит, в направлении 5'-3', 20 т.п.н. дистальное гомологичное плечо IgH мыши, ген ADAM6a мыши, сайт 5' Frt, неомициновую кассету, 3' сайт Frt, ген ADAM6b мыши, ~18 т.п.н. геномный фрагмент человека, генный сегмент VH1-2 человека, ~46.6 т.п.н. геномный фрагмент человека, инактивированный генный сегмент VH6-1 человека, 27 генных сегментов DH человека, шесть генных сегментов JH человека и 8 т.п.н. 3' гомологичное плечо мыши, содержащее интронный энхансер IgH мыши и константную область IgM (SEQ ID NO: 76).

Каждый из конечных нацеливающих векторов (описанных выше) использовали для электропорации ES клеток мыши, которые содержали удаленный эндогенный локус тяжелой цепи для создания модифицированных ES клеток, содержащих эктопически расположенную геномную последовательность мыши, которая содержит последовательности ADAM6a и ADAM6b мыши в пределах ограниченного гуманизированного локуса тяжелой цепи. Положительные ES клетки, содержащие эктопический геномный фрагмент мыши в пределах гуманизированного локуса тяжелой цепи, идентифицировали с помощью количественного анализа ПЦР с использованием зондов TAQMAN™ (Lie and Petropoulos, 1998, Advances in quantitative PCR technology: 5' nuclease assays, Curr Opin Biotechnol 9(1):43-48).

Описанные выше нацеленные ES клетки использовали в качестве донорных ES клеток и вводили в мышиный эмбрион на стадии 8 клеток с помощью способа генной инженерии мышей VELOCIMOUSE® (смотрите, например, патенты США №№76598442, 7576259, 7294754). Мышей, содержащих гуманизированный локус тяжелой цепи, содержащий ограниченное число генных сегментов человека и эктопическую геномную последовательность мыши, содержащую последовательности ADAM6a и ADAM6b мыши, идентифицировали путем генотипирования с использованием модификации аллельного анализа (Valenzuela et al., 2003), который обнаруживал присутствие генов ADAM6a и ADAM6b мыши в пределах ограниченного гуманизированного локуса тяжелой цепи, а также последовательности тяжелой цепи человека.

Детенышей генотипировали и детеныша, гетерозиготного в отношении ограниченного гуманизированного локуса тяжелой цепи, содержащего эктопический геномный фрагмент мыши, который содержит последовательности ADAM6a и ADAM6b мыши, выбирали для определения характеристик экспрессии гена ADAM6 мыши и фертильности.

1. Мышь для получения последовательностей вариабельной области иммуноглобулина человека, содержащая в своей зародышевой линии:

(a) нереаранжированную геномную последовательность человека, содержащую единственный генный сегмент VH человека, один или несколько генных сегментов DH человека и один или несколько генных сегментов JH человека, функционально связанных с константной областью тяжелой цепи иммуноглобулина мыши в эндогенном локусе тяжелой цепи иммуноглобулина мыши, при этом единственный генный сегмент VH человека представляет собой VH1-2, VH1-69 или их полиморфный вариант; и

(b) вставленную последовательность, которая кодирует белок ADAM6a мыши и белок ADAM6b мыши, которые являются функциональными у самца мыши, причем последовательность, которая кодирует белок ADAM6a мыши и белок ADAM6b мыши, расположена смежно с единственным генным сегментом VH человека.

2. Мышь по п. 1, у которой единственный генный сегмент VH человека представляет собой полиморфный генный сегмент VH.

3. Мышь по п. 1, у которой нереаранжированная геномная последовательность человека и вставленная последовательность, которая кодирует белок ADAM6a мыши и белок ADAM6b мыши, присутствуют в эндогенном локусе тяжелой цепи иммуноглобулина.

4. Мышь по п. 1, у которой нереаранжированная геномная последовательность человека присутствует в эндогенном локусе тяжелой цепи иммуноглобулина и вставленная последовательность, которая кодирует белок ADAM6a мыши и белок ADAM6b мыши, присутствует в положении в геноме мыши, отличном от эндогенного локуса тяжелой цепи иммуноглобулина.

5. Мышь по п. 1, у которой единственный генный сегмент VH человека представляет собой VH1-69.

6. Мышь по п. 1, у которой единственный генный сегмент VH человека представляет собой VH1-2.

7. Мышь по п. 1, у которой нереаранжированная геномная последовательность человека содержит генный сегмент VH1-69 человека, 27 генных сегментов DH человека и шесть генных сегментов JH человека.

8. Мышь по п. 1, у которой нереаранжированная геномная последовательность человека содержит генный сегмент VH1-2 человека, 27 генных сегментов DH человека и шесть генных сегментов JH человека.

9. Мышь по п. 1, дополнительно содержащая один или несколько генных сегментов Vκ человека и один или несколько генных сегментов Jκ человека.

10. Мышь по п. 9, у которой один или несколько генных сегментов Vκ человека и один или несколько генных сегментов Jκ человека присутствуют в эндогенном локусе легкой цепи иммуноглобулина.

11. Выделенная клетка для получения последовательностей вариабельной области иммуноглобулина человека, полученная от мыши по любому из пп. 1-10, при этом выделенная клетка содержит в своем геноме:

(i) нереаранжированную геномную последовательность человека, содержащую единственный генный сегмент VH человека, один или несколько генных сегментов DH человека и один или несколько генных сегментов JH человека, при этом единственный генный сегмент VH человека представляет собой VH1-2, VH1-69 или их полиморфный вариант; или

(ii) реаранжированную геномную последовательность человека, содержащую единственный генный сегмент VH, один из одного или нескольких генных сегментов DH человека и один из одного или нескольких генных сегментов JH человека нереаранжированной геномной последовательности человека, при этом единственный генный сегмент VH человека представляет собой VH1-2, VH1-69 или их полиморфный вариант.

12. Способ получения реаранжированной последовательности вариабельной области тяжелой цепи иммуноглобулина человека, которая кодирует вариабельный домен тяжелой цепи иммуноглобулина человека, причем способ включает:

(a) иммунизацию мыши по любому из пп. 1-10 представляющим интерес антигеном;

(b) предоставление указанной мыши возможности развить иммунный ответ на представляющий интерес антиген; и

(c) идентификацию или выделение из мыши реаранжированной последовательности вариабельной области тяжелой цепи иммуноглобулина человека, которая кодирует вариабельный домен тяжелой цепи антитела, которое связывает представляющий интерес антиген.

13. Способ по п. 12, при котором реаранжированная последовательность вариабельной области тяжелой цепи иммуноглобулина человека включает генный сегмент VH, который кодирует аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95% или по меньшей мере на 98% идентична SEQ ID NO: 5.

14. Способ по п. 12 или 13, при котором реаранжированная последовательность вариабельной области тяжелой цепи иммуноглобулина человека содержит генный сегмент VH, который кодирует аминокислотную последовательность, идентичную SEQ ID NO: 5.

15. Способ по п. 12, при котором реаранжированная последовательность вариабельной области тяжелой цепи иммуноглобулина человека содержит генный сегмент VH, который кодирует аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95% или по меньшей мере на 98% идентична SEQ ID NO: 64.

16. Способ по п. 12 или 15, при котором реаранжированная последовательность вариабельной области тяжелой цепи иммуноглобулина человека содержит генный сегмент VH, который кодирует аминокислотную последовательность, идентичную SEQ ID NO: 64.

17. Способ модификации локуса тяжелой цепи иммуноглобулина мыши, включающий:

(a) получение первой модификации, которая содержит вставку одной или нескольких нереаранжированных генных последовательностей иммуноглобулина человека в локус тяжелой цепи иммуноглобулина мыши, включающей единственный генный сегмент VH человека, один или несколько генных сегментов DH человека и один или несколько генных сегментов JH человека, при этом генный сегмент VH человека, один или несколько генных сегментов DH человека и один или несколько генных сегментов JH человека функционально связаны с константной областью тяжелой цепи иммуноглобулина мыши в эндогенном локусе тяжелой цепи иммуноглобулина мыши, при этом единственный генный сегмент VH человека представляет собой VH1-2, VH1-69 или их полиморфный вариант, и при этом первая модификация приводит к снижению или устранению эндогенной активности ADAM6 мыши у самца мыши; и

(b) получение второй модификации, которая включает помещение последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей белок ADAM6a мыши и белок ADAM6b мыши, в положение, смежное с единственным генным сегментом VH человека, при этом вторая модификация восстанавливает активность ADAM6 у мыши.

18. Способ по п. 17, при котором первая модификация включает замещение одной или нескольких эндогенных последовательностей в локусе тяжелой цепи иммуноглобулина мыши одной или несколькими переаранжированными генными последовательностями иммуноглобулина человека в локусе тяжелой цепи иммуноглобулина мыши.

19. Способ по п. 18, при котором первая модификация включает замещение одного или нескольких эндогенных генных сегментов VH единственным генным сегментом VH человека в локусе тяжелой цепи иммуноглобулина мыши.

20. Способ по п. 18, при котором первая модификация включает замещение эндогенной вариабельной генной последовательности тяжелой цепи вариабельной генной последовательностью тяжелой цепи человека, включающей единственный генный сегмент VH, в локусе тяжелой цепи иммуноглобулина мыши.

21. Способ по любому из пп. 17-20, при котором первую и вторую модификацию осуществляют одновременно.

22. Способ получения антитела, специфического в отношении антигена, включающий следующие стадии:

(a) иммунизация мыши по любому из пп. 1-10 антигеном;

(b) выделение по меньшей мере одной клетки из мыши, производящей антитело, специфическое в отношении антигена; и

(c) культивирование по меньшей мере одной производящей антитело клетки согласно стадии (b) и получение указанного антитела.

23. Способ по п. 22, при котором культивирование на стадии (с) проводят по меньшей мере на одной гибридомной клетке, полученной по меньшей мере из одной клетки, полученной на стадии (b).

24. Способ по п. 22 или 23, при котором по меньшей мере одна клетка, полученная на стадии (b), происходит из селезенки, лимфатического узла или костного мозга мыши согласно стадии (а).

25. Способ по п. 22 или 23, при котором иммунизацию антигеном на стадии (а) проводят с помощью белка, ДНК, комбинации ДНК и белка или экспрессирующих антиген клеток.

26. Способ получения антигенсвязывающего белка человека, включающий следующие этапы:

(a) воздействие на мышь по любому из пп. 1-10 представляющим интерес антигеном;

(b) предоставление мыши возможности развить иммунный ответ на антиген;

(c) получение от мыши последовательности нуклеиновой кислоты вариабельной области тяжелой цепи, кодирующей вариабельный домен тяжелой цепи антитела человека, которое специфически связывает представляющий интерес антиген; и

(d) идентификация у мыши антигенсвязывающего белка человека.

27. Способ по п. 26, дополнительно включающий этап (e) слияние последовательности нуклеиновой кислоты вариабельной области тяжелой цепи человека с последовательностью нуклеиновой кислоты константной области человека, кодирующей константный домен тяжелой цепи человека.

28. Способ по п. 27, дополнительно включающий этап (f) экспрессия в клетке млекопитающего антитела, содержащего последовательность нуклеиновой кислоты вариабельной области тяжелой цепи человека и последовательность нуклеиновой кислоты константной области тяжелой цепи человека.



 

Похожие патенты:

Группа изобретений относится к области биотехнологии. Предложены рекомбинантная плазмидная ДНК pBiPr-ABIgA1FI6-ht, кодирующая человеческое антитело к гемагглютинину вируса гриппа А человека изотипа IgA1, и способ получения указанного человеческого антитела, а также линия эукариотических клеток, содержащая указанную рекомбинантную плазмидную ДНК, и способ получения указанной линии клеток.

Изобретение относится к биотехнологии. Описаны конструкции гетеромультимера с уменьшенной или подавленной эффекторной функцией.

Изобретение относится к области биохимии, в частности к способу получения биспецифического антитела, который включает получение первого и второго половинных антител, доведение значения рН первого и второго половинных антител до рН 5-9; смешивание первого и второго половинных антител с образованием смеси для сборки белка, в которую добавляют избыток глутатиона, и инкубацию полученной смеси для сборки белка с образованием биспецифического антитела.

Изобретение относится к области биохимии, в частности к водной композиции для лечения TNFα-ассоциированного заболевания у млекопитающего, включающей эффективное количество антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, специфически связывающегося с человеческим TNFα, а также к способу лечения TNFα-ассоциированного заболевания у млекопитающего с ее использованием.

Изобретение относится к биотехнологии. Описано биспецифическое антитело, которое специфично связывается с HER2 человека или яванского макака и HER3, включающее: вариабельный домен тяжелой цепи VHH, который специфично связывается с HER3, где вариабельный домен тяжелой цепи VHH содержит аминокислотные последовательности, по меньшей мере на 75% гомологичные последовательностям SEQ ID NO: 1-3, и антитело или его антигенсвязывающий домен, которые специфично связываются с HER2 человека или яванского макака.

Изобретение относится к биохимии и биотехнологии. Описан фрагмент антитела для использования в качестве терапевтического средства, содержащий один из следующих повышающих растворимость мотивов в аминокислотных положениях 12, 103 и 144 тяжелой цепи (АНо нумерация): Серин (S) в аминокислотном положении 12 тяжелой цепи; Серин (S) в аминокислотном положении 103 тяжелой цепи; и Треонин (Т) в аминокислотном положении 144 тяжелой цепи; или Серин (S) в аминокислотном положении 12 тяжелой цепи; Треонин (Т) в аминокислотном положении 103 тяжелой цепи; и Серин (S) в аминокислотном положении 144 тяжелой цепи; или Серин (S) в аминокислотном положении 12 тяжелой цепи; Треонин (Т) в аминокислотном положении 103 тяжелой цепи; и Треонин (Т) в аминокислотном положении 144 тяжелой цепи.

Данное изобретение относится к области биотехнологии. Предложены способы продуцирования антитела против альфа-цепи рецептора интрелейкина-7 (IL-7Rα).

Данное изобретение относится к способам, включающим применение гидроксиапатитной хроматографии для выделения биспецифического антитела из раствора, который также содержит один или более чем один побочный продукт, характерный для производства биспецифических антител.

Изобретение относится к биотехнологии. Описана иммуносвязывающая молекула, содержащая: CDR1, CDR2 и CDR3 легкой цепи из донорной иммуносвязывающей молекулы зайцеобразного и CDR1, CDR2 и CDR3 тяжелой цепи из донорной иммуносвязывающей молекулы зайцеобразного, каркас вариабельной области легкой цепи человека и каркас вариабельной области тяжелой цепи человека, содержащий по меньшей мере четыре следующих аминокислоты: треонин (T) в положении 24, аланин (A) или глицин (G) в положении 56, треонин (T) в положении 84, валин (V) в положении 89 и аргинин (R) в положении 108 (нумерация AHo).

Изобретение относится к области молекулярной иммунологии, биотехнологии и медицины, конкретно к получению антител, специфически блокирующих опухолеассоциированный MUC1, и может быть использовано в медицине.

Изобретение относится к области биохимии, в частности к генетически модифицированному грызуну, который продуцирует человеческий или гуманизированный белок IL-7. Также раскрыта нуклеиновая кислота, кодирующая человеческий или гуманизированный белок IL-7, ES-клетка, указанного грызуна, клетка, которая содержит гуманизированный ген IL-7, ткань, которая содержит гуманизированный ген IL-7.

Настоящее изобретение относится к биотехнологии и генетической инженерии, в частности к генетически модифицированным грызунам, таким как мышь и крыса, которые экспрессируют химерный человеческий/не относящийся к человеку полипептид МНС I и/или человеческий полипептид β2 микроглобулина, а также к клеткам таких грызунов.

Настоящее изобретение относится к генетической инженерии, в частности к трансгенному грызуну, мыши или крысе, которого используют для экспрессии человеческого белка DPP4.

Изобретение относится к области биотехнологии. Изобретение представляет собой способ отбора казахских лошадей жабе для селекционного процесса, включающий оценку животных по типу и происхождению, по живой массе и промерам тела - высота в холке, косая длина туловища, обхват груди, обхват пясти, по экстерьеру и молочности кобыл, где предварительную оценку животных осуществляют в 6-месячном возрасте и отбирают кобылок с живой массой как минимум 170 кг, а жеребчиков 175 кг, с промерами тела - высота в холке, косая длина туловища, обхват груди, обхват пясти, как минимум 115,0:110,0:121,0:15,0 см для кобылок и для жеребчиков 117,0:112,0:124,0:15,5 см соответственно, вторичный отбор животных осуществляют в 1,5 года, при этом кобылок отбирают с живой массой как минимум 280 кг, а жеребчиков как минимум 290 кг с промерами как минимум 127,0:127,0:148,0:16,0 см для кобылок и 130,0:130,0:150,0:17,0 см для жеребчиков, третичный обор животных осуществляют в 2,5 года, при этом кобылок отбирают с живой массой как минимум 350 кг, а жеребчиков как минимум 365 кг с промерами как минимум 137,0:138,0:160,0:17,0 см для кобылок и 140,0:140,0:165,0:18,0 см для жеребчиков, окончательно для селекции отбирают кобыл первой лактации с живой массой как минимум 430 кг, с промерами как минимум 142,0:148,0:178,0:18,5 см с чашевидной формой вымени, с сосками плоской формы, направленными вертикально вниз, и длиной от 2,5 до 5,5 см, с суточным удоем молока на третьем месяце лактации как минимум 7,1 кг, а жеребцов с живой массой как минимум 450 кг, с промерами как минимум 144,0:150,0:180,0:19,5 см.

Изобретение относится к пантовому оленеводству, в частности к способу оценки маралов-рогачей и перворожек по пантовой продуктивности. Способ осуществляется в период срезки пантов.

Настоящее изобретение относится к генетической инженерии, в частности к генетически модифицированным грызунам, а именно крысам и мышам. Указанные грызуны созданы для получения антител, содержащих лёгкую цепь иммуноглобулина с вариабельным доменом человека, в котором аминокислота гистидин кодируется замещенным или вставленным в зародышевый геном гистидиновым кодоном.

Изобретение относится к генетической инженерии, в частности к генетически модифицированной свинье, которая является резистентной к инфекции вирусом репродуктивно-респираторного синдрома свиней (ВРРСС).

Настоящее изобретение относится к генетической инженерии, в частности к генетически модифицированному иммунодефицитному грызуну, который экспрессирует полипептид M-CSF человека, полипептид IL-3 человека, полипептид GM-CSF человека, полипептид SIRPA человека и полипептид ТРО человека.

Изобретение относится к области ветеринарии. Изобретение представляет собой способ улучшения морфогенеза черепа самцов и самок американской норки окрасочного генотипа Standard (+/+ +/+), заключающийся в введении Биостила с кормом в дозе 0,5 мл/кг массы тела три раза в месяц 5-дневными курсами с интервалом 3 дня в течение пяти месяцев.

Изобретение относится к ветеринарии, в частности к способу коррекции воспроизводительной функции у коров. Способ включает внутримышечное введение иммуностимулятора.

Изобретение относится к области биохимии, в частности к генетически модифицированному грызуну, который продуцирует человеческий или гуманизированный белок IL-7. Также раскрыта нуклеиновая кислота, кодирующая человеческий или гуманизированный белок IL-7, ES-клетка, указанного грызуна, клетка, которая содержит гуманизированный ген IL-7, ткань, которая содержит гуманизированный ген IL-7.

Изобретение относится к области биохимии, в частности к мыши, содержащей в своей зародышевой линии нереаранжированную геномную последовательность человека, содержащую единственный генный сегмент VH человека, который представляет собой VH1-2, VH1-69, один или несколько генных сегментов DH человека и один или несколько генных сегментов JH человека, и вставленную последовательность, которая кодирует белок ADAM6a мыши и белок ADAM6b мыши, к клетке, полученной из нее, а также к способу получения реаранжированной последовательности вариабельной области тяжелой цепи иммуноглобулина человека, способу получения антитела и способу получения антигенсвязывающего белка человека с использованием вышеуказанной мыши. Также раскрыт способ модификации локуса тяжелой цепи иммуноглобулина мыши, предусматривающий вставку одной или нескольких нереаранжированных генных последовательностей иммуноглобулина человека в локус тяжелой цепи иммуноглобулина мыши, а также модификацию, которая восстанавливает активность ADAM6 у мыши. Изобретение позволяет эффективно получать последовательности вариабельной области иммуноглобулина человека. 6 н. и 22 з.п. ф-лы, 10 ил., 3 табл., 2 пр.

Наверх