Кохлеаты, полученные с использованием фосфатидилсерина сои
Владельцы патента RU 2659729:
РУТГЕРС, ЗЭ СТЭЙТ ЮНИВЕРСИТИ ОФ НЬЮ-ДЖЕРСИ (US)
МАТИНАС БИОФАРМА НАНОТЕКНОЛОДЖИС, ИНК. (US)
Изобретение относится к фармацевтической промышленности, а именно к кохлеату для доставки биологически активного агента. Кохлеат для доставки биологически активного агента, содержит фосфолипид на основе сои, который содержит 45% - 55% по массе фосфатидилсерина сои, мультивалентный катион и биологически активный агент. Также предложен способ получения кохлеатов из фосфатидилсерина сои/биологически активного агента. Способ лечения пациента с бактериальной инфекцией, согласно изобретению включает введение пациенту эффективного количества кохлеата, который содержит (i) фосфолипид на основе сои, включающий 45% - 55% по массе фосфатидилсерина сои, (ii) мультивалентный катион и (iii) антибиотический агент. Вышеописанный кохлеат эффективен для доставки биологически активного агента в организм пациента, обеспечивая высокую эффективность включения нагрузки в кохлеаты. 3 н. и 26 з.п. ф-лы, 11 ил., 4 табл., 10 пр.
РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ
Настоящая заявка испрашивает приоритет на основании предварительной заявки на патент США №61/677414, поданной 30 июля 2012 г. и предварительной заявки на патент США №61/835825, поданной 17 июня 2013 г., содержание которых полностью включено в настоящую заявку посредством ссылки.
ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ
Настоящее изобретение относится к возможности получать кохлеаты из неочищенного фосфатидилсерина (ФС) или фосфатидилсерина низкой степени чистоты (40-74% по массе), способам получения лекарственных кохлеатов с лекарственными средствами из ФС на основе сои и применению этих кохлеатов, нагруженных лекарственным средством, в качестве фармацевтического средства лечения.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
Средства доставки в форме кохлеатов являются универсальной технологией для доставки множества биологически активных терапевтических продуктов. Средства доставки в форме кохлеатов представляют собой стабильные фосфолипид-катионные преципитаты, состоящие из простых, встречающихся в естественных условиях веществ, например, фосфатидилсерина и кальция.
Двухслойная структура кохлеатов обеспечивает защиту от разрушения связанных или «включенных в кохлеаты» (encochleated) молекул. Так как структура кохлеата в целом представляет собой ряд твердых слоев, компоненты внутри структуры кохлеата остаются по существу ин, даже при том, что внешний слой кохлеата может подвергаться воздействию жестких условий окружающей среды или ферментов. Это включает защиту от расщепления в желудке.
Пользуясь этими уникальными свойствами, кохлеаты применяли в качестве посредника и для повышения биологической доступности при пероральном применении множества важных, но сложных в производстве биофармацевтических средств, в том числе соединений с плохой растворимостью в воде, белковых и пептидных лекарственных средств, а также крупных гидрофильных молекул. Например, с помощью кохлеатов осуществили пероральную доставку амфотерицина В, крупных ДНК-конструкций/плазмид для ДНК-вакцин и генной терапии, пептидных составов и антибиотиков, таких как клофазимин.
Кохлеаты можно хранить в катионсодержащем буфере или в виде лиофилизированного порошка, который хранят при комнатной температуре и растворяют в жидкости перед введением. Лиофилизация не оказывает негативного влияния на строение или функции кохлеата. Показано, что лекарственные средства в форме кохлеатов являются стабильным в течение более чем двух лет при 4°C в катион-содержащем буфере и в течение по меньшей мере одного года в виде лиофилизированного порошка при комнатной температуре.
Кохлеаты можно получать посредством нескольких способов, таких как способы захвата или гидрогелевые способы (публикация международной заявки № WO 03/082209, содержание которой полностью включено в настоящую заявку посредством ссылки).
ФС сои продают в магазинах здорового питания в качестве пищевой добавки. Неочищенный (40%) ФС используется и изучается в качестве пищевой добавки и в качестве компонента, который оказывает благотворное влияние на улучшение функций мозга у пожилых людей (Villardita С et al., Clin. Trials J. 24, 1987, 84-93).
Хотя неочищенный ФС сои (NSPS) продают и изучают на пациентах, NSPS (или ФС низкой степени чистоты) никогда не применяли для получения кохлеатов и для доставки лекарственных средств с применением данных кохлеатов. Как ранее сообщалось в WO 03/082209, NSPS не образует кохлеатов, и для увеличения содержания ФС в NSPS необходим процесс очистки до достижения по меньшей мере 75% по массе ФС, т.е. такого процентного содержания, которое позволяет образовывать кохлеаты.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Неожиданно было обнаружено, что NSPS или ФС сои низкой степени чистоты (40-74% по массе) обладают способностью образовывать кохлеаты.
Вкратце, согласно настоящему изобретению, получены улучшенные кохлеаты на основе липидов с применением неочищенного фосфатидилсерина сои или фосфатидилсерина сои низкой степени чистоты соевого в качестве источника липидов. Улучшенные кохлеаты содержат соевый фосфатидилсерин в количестве примерно 40%-74% (предпочтительно 45-70%, более предпочтительно 45-55%) по массе липида. Улучшенные кохлеаты могут быть пустыми или нагруженными. Нагруженные кохлеаты могут содержать любые биологически активные вещества или комбинации биологически активных веществ, таких как, например, белок, малый пептид, полинуклеотид, аминогликозид, противовирусный агент, анестетик, антибиотик, противогрибковый агент, противоопухолевый агент, иммуносупрессор, стероидное противовоспалительное средство, нестероидное противовоспалительное средство, транквилизатор, пищевая добавка, растительный продукт, витамин или сосудорасширяющий агент. Особый интерес для реализации настоящего изобретения на практике представляют кохлеаты на основе фосфатидилсерина сои, нагруженные противогрибковыми агентами или антибиотиками с получением экономичного и улучшенного противогрибкового лекарственного средства/антибиотика с пониженной токсичностью. Предпочтительные противогрибковые агенты включают амфотерицин В и нистатин. Предпочтительные антибиотики включают аминогликозид и амикацин.
Улучшенные кохлеаты на основе липидов согласно настоящему изобретению могут быть получены способом, включающим стадии: (а) приготовления липосом в водной среде, причем липосомы включают (i) липидный бислой, содержащий соевый фосфатидилсерин в количестве примерно 40%-74% (предпочтительно 45-70%, более предпочтительно 45-55%) по массе липидного бислоя и (ii) нагрузку из биологически активного агента; (b) добавления мультивалентного катиона к суспензии липосом из стадии (а) с получением кохлеатов из фосфатидилсерина сои/биологически активного агента; и (с) сбора кохлеатов из фосфатидилсерина сои/биологически активного агента.
Согласно настоящему изобретению кохлеаты из фосфатидилсерина сои/биологически активного агента можно вводить пациентам с грибковыми или с бактериальными инфекциями. Кохлеаты из фосфатидилсерина сои/биологически активного агента по изобретению удобно вводить перорально даже в случае лечения системных грибковых инфекций у пациентов с ослабленным иммунитетом. Кохлеаты из фосфатидилсерина/биологически активного агента по изобретению также вводят парентерально или посредством других средств введения. Предпочтительными биологически активными агентами являются амфотерицин В, куркумин и амикацин.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
На фигуре 1 показано исследование действия кохлеатов, с амикацином, in vitro против MAC 101 и MAC 109 на перитонеальных макрофагах мыши.
На фигуре 2 показана эффективность кохлеатов, с амикацином, in vivo при внутрибрюшинной доставке на модели инфекции MAC 101 мышей.
На фигуре 3 показана эффективность кохлеатов, с амикацином, in vivo при пероральной доставке на модели инфекции MAC 101 мышей.
На фигуре 4 показано включение гентамицина в кохлеат в зависимости от свойств ФС.
На фигуре 5 показана эффективность включения в кохлеат амикацина с солями желчных кислот, в зависимости от свойств ФС.
На фигуре 6 показана эффективность включения в кохлеат амикацина с солями желчных кислот в зависимости от свойств ФС.
На фигуре 7 показана эффективность включения в кохлеат гентамицина с солями желчных кислот в зависимости от свойств ФС.
На фигуре 8 показана эффективность включения в кохлеат гентамицина с солями желчных кислот в зависимости от свойств ФС.
На фигуре 9 показана эффективность включения в кохлеат паромомицина с солями желчных кислот в зависимости от свойств ФС.
На фигуре 10 показана эффективность включения в кохлеат паромомицина с солями желчных кислот в зависимости от свойств ФС.
На фигуре 11 показана эффективность включения в кохлеат паромомицина с солями желчных кислот в зависимости от свойств ФС.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Следующие термины при использовании в настоящем документе имеют определения, приведенные ниже.
«Кохлеат» представляет собой стабильный фосфолипид-катионный преципитат, который может быть как пустым, так и нагруженным.
«Пустой кохлеат» представляет собой кохлеат, который состоит только из фосфолипида и катионов.
«Нагруженный кохлеат» представляет собой кохлеат, который имеет одно или более биологически активных соединений внутри структуры фосфолипид-катион.
«Фосфатидилсерин сои» или «фосфатидилсерин на основе сои» представляет собой фосфатидилсерин, который был получен из композиции на основе сои.
В реализации настоящего изобретения на практике улучшенные кохлеаты на основе фосфолипида получают с применением фосфатидилсерина сои в количестве 40%-74% по массе липидного компонента кохлеатов. В качестве альтернативы, количество фосфатидилсерина сои может составлять примерно 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65% или 70% или любое значение выше указанных по массе липидного компонента кохлеатов. Предполагается, что все величины и диапазоны между данными величинами включены в настоящее изобретение. В предпочтительном варианте реализации настоящего изобретения фосфолипид содержит 45-70% фосфатидилсерина сои. В более предпочтительном варианте реализации настоящего изобретения фосфолипид содержит 45-55% фосфатидилсерина сои.
Фосфатидная кислота является предпочтительным фосфолипидом, в случае присутствия в улучшенных кохлеатах по изобретению дополнительного фосфолипида помимо фосфатидилсерина. Другие фосфолипиды в дополнение к фосфатидной кислоте, которые можно применять в улучшенных кохлеатах по изобретениию, включают фосфатидилхолин, фосфатидилинозитол и фосфатидилглицерин. Смеси дополнительных фосфолипидов можно также применять в сочетании с соевым фосфатидилсерином.
Исходный материал фосфатидилсерина сои является коммерчески доступным или может быть выделен из композиции фосфолипидов сои, которые представляют собой смеси нескольких фосфолипидов сои, в соответствии с хорошо известными и стандартными методами очистки.
Для осаждения кохлеатов из исходных липосомных материалов можно применять любое мультивалентное соединение. В предпочтительном случае мультивалентные соединения представляют собой двухвалентные катионы, такие как Са++, Zn++, Ва++ и Mg++. Предпочтительные источники данных катионов включают хлоридные соли кальция, цинка, бария и магния. CaCl2 является особенно предпочтительным источником двухвалентных катионов.
В одном варианте реализации настоящего изобретения данные кохлеаты из фосфатидилсерина сои могут дополнительно содержать соли желчных кислот. Массовое соотношение фосфолипида на основе сои к солям желчных кислот составляет от 20:1 до 0.5:1, предпочтительно от 10:1 до 3:1.
Соли желчных кислот представляют собой желчные кислоты, соединенные с катионом, обычно, натрия. Желчные кислоты представляют собой стероидные кислоты, которые обнаруживают преимущественно в желчи млекопитающих. Желчные кислоты являются коммерчески доступными (например, Sigma - Aldrich каталожный номер #48305 Fluka холевой кислоты натриевая соль, ~50% дезоксихолевой кислоты натриевая соль, ~50%).
Неожиданно было обнаружено, что добавление солей желчных кислот увеличивает эффективность включения в кохлеаты для кохлеатов из фосфатидилсерина сои. Например, при добавлении солей желчных кислот, кохлеаты из фосфатидилсерина сои согласно настоящему изобретению (например, при использовании 50% ФС сои) более эффективны при включении в кохлеат, чем кохлеаты, содержащие по меньшей мере 75% фосфатидилсерина сои.
В одном варианте реализации настоящего изобретения данные кохлеаты из фосфатидилсерина сои получают способом, который включает стадии:
a. приготовления липосом в водной среде, причем липосомы имеют (i) липидный бислой, содержащий соевый фосфатидилсерин в количестве примерно 40%-74% (предпочтительно 45-70%, более предпочтительно 45-55%) по массе липидного бислоя и (ii) наполнение из биологически активного агента;
b. добавления мультивалентного катиона к суспензии липосом из стадии (а) для получения кохлеатов из фосфатидилсерина сои/биологически активного агента; и
c. сбора кохлеатов из фосфатидилсерина сои/биологически активного агента.
В одном варианте реализации настоящего изобретения водная среда, содержащая суспензию липосом, представляет собой забуференную среду, с рН 6,5-7,5, и наполнение из биологически активного агента имеет рН 10 или выше перед добавлением к липосомам. В предпочтительном варианте реализации настоящего изобретения суспензия липосом забуферена фосфатом.
В другом варианте реализации настоящего изобретения способ дополнительно включает стадию добавления солей желчных кислот к суспензии липосом из стадии (а) перед стадией (b) или добавление солей желчных кислот к кохлеатам из фосфатидилсерина сои/биологически активного агента после стадии (b), причем массовое соотношение липидного бислоя к солям желчных кислот составляет от 20:1 до 0,5:1, предпочтительно от 10:1 до 3:1.
Согласно настоящему изобретению предложена композиция в форме полых частиц, которая содержит (1) липидный монослой, включающий фосфолипид на основе сои, содержащий примерно 40%-74% (предпочтительно 45-70%, более предпочтительно 45-55%) по массе фосфатидилсерина сои, расположенный вокруг гидрофобной области; и (2) липидную прослойку, размещенную около липидного монослоя, причем липидная прослойка содержит структуру чередующихся катионных слоев, включающих двухвалентный катион, и отрицательно заряженных пластинчатых липидных слоев; и вспомогательный фрагмент, связанный с гидрофобным доменом.
Международная публикация заявки № WO 2004/041247 включает способ получения указанной выше композиции в форме полых частиц, содержание которой полностью включено в настоящую заявку посредством ссылки.
Биологически активный агент/лекарственное средство (называемые как «наполнение» или лекарственное средство) может быть гидрофобным в водной среде, гидрофильным или амфифильным. Лекарственное средство может представлять собой, не ограничиваясь ими, белок, малый пептид, биологически активный полинуклеотид, противогрибковый агент, противовирусный агент, анестетик, противоинфекционный агент, противоопухолевый агент, иммуносупрессор, стероидное противовоспалительное средство, пищевую добавку, растительный продукт, витамин, нестероидное противовоспалительное средство, транквилизатор или сосудорасширяющее средство. Примеры включают амфотерицин В, ацикловир, адриамицин, витамин А, карбамазепин, мелфалан, нифедипин, индометацин, напроксен, эстрогены, тестостероны, стероиды, фенитоин, эрготамины, каннабиноиды, рапамицин, пропанидид, пропофол, альфадион, эхиномицин, миконазола нитрат, тенипозид, таксаны, паклитаксел и таксотер.
Лекарственное средство может представлять собой полипептид, такой как циклоспорин, ангиотензин I, II и III, энкефалины и их аналоги, адренокортикотропный гормон (АСТН), противовоспалительные пептиды I, II, III, брадикинин, кальцитонин, бета-эндорфин, динорфин, лейкокинин, рилизинг-фактор лютеинизирующего гормона (LHRH), инсулин, нейрокинины, соматостатин, субстанция Р, тиреотропин-рилизинг-гормон (TRH, ТРГ) и вазопрессин.
Лекарственное средство может представлять собой антиген, не ограничиваясь белковым антигеном. Антиген может также представлять собой углевод или ДНК. Примеры антигенных белков включают гликопротеины оболочки вирусов гриппа или Сендай, белки мембран клеток животных, белки мембран клеток растений, белки мембран бактерий и белки мембран паразитов.
Антиген экстрагируют из частиц, клеток, ткани или организма источника посредством известных способов. Нет необходимости поддерживать биологическую активность антигена. Однако, в некоторых случаях (например, когда белок является мембраносвязанным, или задействован в связывании лиганда, или образует комплекс, который распознается иммунной системой), необходимо поддерживать биологическую активность. В этих случаях применяют экстракционный буфер, содержащий детергент, который не нарушает биологическую активность белка мембраны. Подходящие детергенты включают ионные детергенты, такие как холаты, дезоксихолаты и им подобные или гетерогенные полиоксиэтиленовые детергенты, такие как Tween, BRIG или Triton.
Использование этого способа позволяет восстановить антигены, более конкретно белки, в липосомах с сохранением биологической активности и в конечном итоге осуществить эффективную ассоциацию с кохлеатами. Данный способ позволяет избежать применения органических растворителей, ультразвука или экстремальных рН, температуры или давления, каждый из которых может оказать негативное влияние на эффективное воссоздание антигена с сохранением биологически активной формы.
Улучшенные кохлеаты по изобретению могут включать нагрузку несколькими антигенными молекулами, биологически активными молекулами или лекарственными средствами в качестве подходящих компонентов.
Для выделения структур кохлеатов и для удаления раствора полимера преципитаты кохлеатов повторно промывают буфером, содержащим положительно заряженные молекулы, а более предпочтительно, двухвалентный катион. Добавление положительно заряженных молекул к промывочному буферу гарантирует сохранение структур кохлеатов в течение стадии промывки и их сохранение в форме преципитатов.
Среда, в которой суспендируют кохлеаты, может содержать соль, такую как хлорид натрия, сульфат натрия, сульфат калия, сульфат аммония, сульфат магния, карбонат натрия. Среда может содержать полимеры, такие как Tween 80 или BRIG или Triton. Лекарственные кохлеаты получают посредством разведения в соответствующем фармацевтически приемлемом носителе (например, в буфере, содержащем двухвалентный катион).
Частицы кохлеатов могут быть кишечнорастворимыми. Частицы кохлеатов можно помещать в желатиновые капсулы, данные капсулы могут быть покрыты кишечнорастворимой оболочкой.
Специалист в данной области может определить наиболее эффективные и терапевтические средства для осуществления лечения посредством реализации настоящего изобретения на практике. Также можно ссылаться на любой из многочисленных документов и ссылок, включая, например «Goodman & Gillman's, The Pharmaceutical Basis for Therapeutics» (6th Ed., Goodman et al., eds., MacMillan Publ. Co., New York, 1980).
Улучшенные кохлеаты из фосфатидилсерина сои согласно настоящему изобретению, содержащие биологически активный агент, удобно вводить пациентам перорально, в результате чего кохлеаты абсорбируются и попадают в кровоток, и биологически активное наполнение доставляется системно. Это является особым преимуществом для нерастворимых в воде лекарственных средств, таких как амфотерицин В и паклитаксел. Кроме того, токсичность многих гидрофобных лекарственных средств существенно снижается, как показано для кохлеатов из фосфатидилсерина сои, содержащих амфотерицин В в качестве наполнения.
Следующие примеры иллюстрируют практическое применение настоящего изобретения, но их не следует рассматривать как ограничивающие его объем.
ПРИМЕР 1. Состав, содержащий кристаллические кохлеаты, нагруженные Амфотерицином В
Методики получения кристаллического состава, содержащего Амфотерицин В, в лабораторном масштабе:
#1.1 Экспериментальный состав:
43 мг (точно 40 мг Амфотерицина В в пересчете на активное вещество с концентрацией 0,932 мг/мг) Амфотерицина В в 1,33 мл 0,1 н. NaOH перемешивали с 200 мг диолеоил фосфатидилсерина (DOPS, от Avanti или NOF Corporation) в 6,6 мл 50 мМ фосфатного буфера с рН 7,4 (липосомы фильтровали через 5 мкм фильтр) с получением липосом, содержащих Амфотерицин В. К полученной смеси затем добавляли 29,3 мг хлорида кальция с получением кристаллических кохлеатов. Для получения оптимальных кристаллических кохлеатов массовое соотношение липид : Амфотерицин В составляло примерно 5:1.
#1.2 Экспериментальный состав:
18 мг Амфотерицина В в 0,6 мл 0,1 н. NaOH затем перемешивали с 90 мг DOPS (от Avanti или NOF Corporation) в 3,0 мл 50 мМ фосфатного буфера с рН 7,4 (липосомы фильтровали через 5 мкм, 8 мкм и 4,5 мкм фильтр) с получением липосом, содержащих Амфотерицин В. К полученной смеси затем добавляли 0,33 мл 0,5 М раствора хлорида кальция с получением кристаллических кохлеатов, нагруженных Амфотерицином В. Для получения оптимальных кристаллических кохлеатов массовое соотношение липид : Амфотерицин В составляло примерно 5:1.
Методики получения кристаллических кохлеатов, нагруженных Амфотерицином В, (Амфотерицин В) в малом масштабе:
#1.3 Экспериментальный состав:
399 мг (точно 372 мг в пересчете на активное вещество с концентрацией 0,932 мг/мг) Амфотерицина В в 12,4 мл 0,1 н. раствора NaOH объединяли с 1,86 г 50% соевого ФС (American Lecithin Company или Lipoid LLC) в 62 мл 50 мМ фосфатного буфера с рН 7,4 (липосомы фильтровали через 5 мкм фильтр) с получением липосом, содержащих Амфотерицин В. Для того чтобы добавить антиоксидант к суспензии, к смеси липосом затем добавляли 372 мг витамина Е в 3,72 мл этилового спирта. К полученной смеси затем добавляли 520 мг хлорида кальция в виде порошка с получением кристаллических кохлеатов, нагруженных Амфотерицином В. Для получения оптимальных кристаллических кохлеатов, нагруженных Амфотерицином В, массовое соотношение липид : Амфотерицин В составляло примерно 5:1.
Методики получения кристаллического состава, содержащего Амфотерицин В, в масштабе до 4,5 л:
#1.4 Экспериментальный состав:
22,75 г Амфотерицина В (точно 21,2 г Амфотерицина В в пересчете на активное вещество с концентрацией 0,932 мг/мг) в 707 мл 0,1 н. раствора NaOH затем перемешивали с 106 г 50% соевого ФС в 3,533 л 50 мМ фосфатного буфера с рН 7,4 (липосомы фильтровали через 10 мкм фильтр) с получением липосом, содержащих Амфотерицин В. Для получения стабильной суспензии кохлеатов затем к смеси добавляли 372 мг витамина Е в 3,72 мл этилового спирта. К полученной смеси затем добавляли 194,8 мл 1М хлорида кальция с получением кристаллических кохлеатов. Конечный продукт в форме кохлеатов лиофилизировали с помощью лиофильной сушилки в течение нескольких дней. Для получения оптимальных кристаллических кохлеатов, нагруженных Амфотерицином В, массовое соотношение липид : лекарственное средство составляло примерно 5:1.
ПРИМЕР 2. Состав, содержащий кохлеаты в форме полых частиц, нагруженные Куркумином (гранулированным)
Методики получения кохлеатов в форме полых частиц, нагруженных Куркумином (гранулированным), в малом масштабе:
#2.1 Экспериментальный состав:
Сначала растворяли 50 мг куркумина в 1 г касторового масла и 4,0 мл этилового спирта, затем объединяли с 19 мг 75% соевого ФС (American Lecithin Company или Lipoid LLC) в 100 мл стерильной воды (липосомы фильтровали через 5 мкм фильтр) с получением липосом, содержащих куркумин. Для снижения клейкости суспензии и диффузии смеси, к смеси липосом затем добавляли 500 мг бычьего сывороточного альбумина («БСА» или казеина). К полученной смеси затем добавляли 16,9 мл 0,1 М хлорида кальция с получением кохлеатов в форме полых частиц, нагруженных куркумином. Конечный продукт в форме кохлеатов в форме полых частиц лиофилизировали с помощью лиофильной сушилки в течение нескольких дней. Для получения оптимальных кохлеатов в форме полых частиц, нагруженных куркумином, массовое соотношение липид : лекарственное средство составляло примерно 20:1.
#2.2 Экспериментальный состав:
100 мг 75% соевого ФС в 100 мг стерильной воды (липосомы фильтровали через 5 мкм фильтр) перемешивали с 500 мг казеина (или БСА) и затем перемешивали с 50 мг куркумина в 2,0 г касторового масла и 4,0 мл этилового спирта с получением липосом, содержащих куркумин. К полученной смеси затем добавляли 16,9 мл 0,1 М хлорида кальция с получением кохлеатов в форме полых частиц. Конечный продукт в форме кохлеатов в форме полых частиц лиофилизировали с помощью лиофильной сушилки в течение нескольких дней. Для получения оптимальных кохлеатов в форме полых частиц, нагруженных куркумином, массовое соотношение липид : лекарственное средство составляло примерно 20:1.
Методики получения кристаллического состава, содержащего Куркумин (гранулированный), в малом масштабе:
#2.3 Экспериментальный состав:
1000 мг 75% соевого ФС в 100 мл стерильной воды объединяли с 20 мг куркумина в 4,0 мл этилового спирта с получением липосом, содержащих куркумин (липосомы фильтровали через 5 мкм фильтр). Чтобы помочь стабилизации лекарственного средства в липидном бислое к суспензии липосом затем добавляли 500 мг казеина (или БСА). К полученной смеси затем добавляли 16,9 мл 0,1 М хлорида кальция с получением кристаллических кохлеатов. Конечный продукт в виде кристаллических кохлеатов лиофилизировали с помощью лиофильной сушилки в течение нескольких дней. Для получения оптимальных кристаллических кохлеатов массовое соотношение липид : куркумин составляло примерно 50:1.
#2.4 Экспериментальный состав:
1000 мг 75% соевого ФС в 100 мл стерильной воды объединяли с 20 мг куркумина в 4,0 мл этилового спирта с получением липосом, содержащих куркумин (липосомы фильтровали через 5 мкм фильтр). К полученной смеси затем добавляли 16,9 мл 0,1 М хлорида кальция с получением кристаллических кохлеатов. Чтобы помочь стабилизации лекарственного средства в липидном бислое к суспензии кохлеатов затем добавляли 500 мг казеина (или БСА). Конечный продукт в виде кристаллических кохлеатов лиофилизировали с помощью лиофильной сушилки в течение нескольких дней. Для получения оптимальных кристаллических кохлеатов массовое соотношение липид : куркумин составляло примерно 50:1.
ПРИМЕР 3. Состав в форме полых частиц, содержащий Амфотерицин В (Amphotericin В)
Методики получения состава в форме полых частиц, содержащего Амфотерицин В (Amphotericin В), в лабораторном масштабе:
#3.1 Экспериментальный состав:
7,5 мг Амфотерицина В (точно 7 мг в пересчете на активное вещество с концентрацией 0,932 мг/мг) в 0,2 мл 0,1 н. раствора NaOH перемешивали с 50 мг касторового масла и затем объединяли с 35 мг 50% соевого ФС в 1,75 мл стерильной воды (липосомы фильтровали через 5 мкм фильтр) с получением липосом в форме полых частиц, содержащих Амфотерицин В. Для предотвращения клейкости состава в форме полых частиц, содержащего Амфотерицин В, затем к смеси липосом в форме полых частиц, содержащих Амфотерицин В, добавляли 21 мг БСА или казеина. Для повышения стабильности состава в форме полых частиц, содержащего Амфотерицин В, затем к смеси липосом в форме полых частиц добавляли 7 мг витамина Е в 70 мкл этилового спирта. К полученной смеси затем добавляли 127 мкл 0,5 М хлорида кальция с получением кохлеатов в форме полых частиц, нагруженных Амфотерицином В. Для получения оптимальных кохлеатов в форме полых частиц, нагруженных Амфотерицином В, массовое соотношение липид : Амфотерицин В составляло примерно 5:1.
Методики получения состава в форме полых частиц, содержащего Амфотерицин В, в масштабе до 150 мл:
#3.2 Экспериментальный состав:
536 мг Амфотерицина В (точно 500 мг в пересчете на активное вещество с концентрацией 0,932 мг/мг) в 14,3 мл 0,1 н. раствора NaOH затем перемешивали с 3,57 г касторового масла и затем объединяли с 2,5 г 50% соевого ФС в 125 мл стерильной воды (липосомы фильтровали через 5 мкм фильтр) с получением липосом в форме полых частиц, содержащих Амфотерицин В. Для предотвращения клейкости состава в форме полых частиц, затем к смеси липосом в форме полых частиц добавляли 1,5 г БСА или казеина. Для повышения стабильности состава в форме полых частиц, содержащего Амфотерицин В, затем к смеси липосом в форме полых частиц добавляли 250 мг витамина Е в 2,5 мл этилового спирта. К полученной смеси затем добавляли 8,88 мл 0,5 М хлорида кальция с получением кохлеатов в форме полых частиц. рН конечной смеси доводили до нейтрального посредством 0,3 мл 1 н. HCl. Для получения оптимальных кохлеатов в форме полых частиц, нагруженных Амфотерицином В, массовое соотношение липид : Амфотерицин В составляло примерно 5:1.
#3.3 Экспериментальный состав:
2,5 г 50% соевого ФС в 125 мл стерильной воды (липосомы фильтровали через 5 мкм фильтр) перемешивали с 1,5 г БСА или казеина и затем объединяли с 536 мг Амфотерицина В (точно 500 мг в пересчете на активное вещество с концентрацией 0,932 мг/мг) в 14,3 мл 0,1 н. раствора NaOH с 3,57 г касторового масла с получением липосом, содержащих Амфотерицин В. Для получения стабильного состава в форме полых частиц затем к смеси липосом в форме полых частиц добавляли 250 мг витамина Е в 2,5 мл этилового спирта. рН конечной смеси доводили до нейтрального посредством 0,3 мл 1 н. HCl. К полученной смеси затем добавляли 8,88 мл 0,5 М хлорида кальция с получением кохлеатов в форме полых частиц. Кохлеаты в форме полых частиц затем концентрировали с применением лиофилизации для получения кохлеатов в форме полых частиц со стерильной водой в любых концентрациях (на основании требований эксперимента) с массовым соотношением липид : Амфотерицин В примерно 5:1.
ПРИМЕР 4. Состав, содержащий кристаллические кохлеаты, нагруженные Амикацином, для исследования in vitro
Методика получения состава, содержащего амикацин, для исследования in vitro:
#4.1 Экспериментальный состав:
2 мг амикацина в 1,0 мл дистиллированной деионизированной воды (D.D) фильтровали через 0,22 мкм фильтр и объединяли с 20 мг 50% соевого ФС в 2,0 мл стерильной воды (липосомы фильтровали через 5, 0,8 и 0,45 мкм фильтр) с получением липосом, содержащих амикацин. К полученной смеси затем добавляли 0,206 мл 0,1 М хлорида кальция с получением кохлеатов. Затем доводили концентрацию лекарственного средства амикацина в смеси до 0,5 мг/мл стерильной водой. Для получения оптимальных кристаллических кохлеатов, нагруженных амикацином, соотношение липид : лекарственное средство составляло примерно 10:1.
#4.2 Экспериментальный состав:
2 мг амикацина в 1,0 мл D.D воды фильтровали через 0,22 мкм фильтр и объединяли с 20 мг 50% соевого ФС в 2,0 мл стерильной воды (липосомы фильтровали через 5, 0,8 и 0,45 мкм фильтр) с получением липосом, содержащих амикацин. К полученной смеси затем добавляли 0,206 мл 0,1 М хлорида кальция с получением кохлеатов. Чтобы уменьшить размер агрегации кристаллических кохлеатов, к смеси кохлеатов затем добавляли 15 мг хлорида натрия в 52 мкл стерильной воды. Затем доводили концентрацию амикацина в смеси до 0,5 мг/мл стерильной водой. При этом конечный продукт содержал 0,066 М хлорида натрия. Для получения оптимальных кристаллических кохлеатов, нагруженных амикацином, соотношение липид : лекарственное средство составляло примерно 10:1.
#4.3 Экспериментальный состав:
2 мг амикацина в 1,0 мл D.D воды фильтровали через 0,22 мкм фильтр и объединяли с 20 мг 50% соевого ФС в 2,0 мл стерильной воды (липосомы фильтровали через 5, 0,8 и 0,45 мкм фильтр) с получением липосом, содержащих амикацин. К полученной смеси затем добавляли 0,206 мл 0,1 М хлорида кальция с получением кохлеатов. Чтобы уменьшить размер агрегации кристаллических кохлеатов, к смеси кохлеатов затем добавляли 76 мг хлорида натрия в 264 мкл стерильной воды. Затем доводили концентрацию амикацина в смеси до 0,5 мг/мл стерильной водой. При этом конечный продукт содержал 0,33 М хлорида натрия. Для получения оптимальных кристаллических кохлеатов, нагруженных амикацином, соотношение липид : лекарственное средство составляло примерно 10:1.
#4.4 Экспериментальный состав:
2 мг амикацина в 1,0 мл D.D воды фильтровали через 0,22 мкм фильтр и объединяли с 20 мг 50% соевого ФС в 2,0 мл стерильной воды (липосомы фильтровали через 5, 0,8 и 0,45 мкм фильтр) с получением липосом, содержащих амикацин. К полученной смеси затем добавляли 0,206 мл 0,1 М хлорида кальция с получением кохлеатов. Чтобы уменьшить размер агрегации кристаллических кохлеатов, к смеси кохлеатов затем добавляли 152 мг хлорида натрия в 524 мкл стерильной воды. Затем доводили концентрацию амикацина в смеси до 0,5 мг/мл стерильной водой. При этом конечный продукт содержал 0,66 М хлорида натрия. Для получения оптимальных кристаллических кохлеатов, нагруженных амикацином, соотношение липид : лекарственное средство составляло примерно 10:1.
ПРИМЕР 5. Состав, содержащий кристаллические кохлеаты, нагруженные Амикацином, для исследования in vivo
Методика получения состава, содержащего амикацин, для исследования in vivo:
#5.1 Экспериментальный состав:
200 мг амикацина в 20 мл D.D. воды фильтровали через 0,22 мкм фильтр и объединяли с 2000 мг 50% соевого ФС в 200 мл стерильной воды (липосомы фильтровали через 5, 0,8 и 0,45 мкм фильтр) с получением липосом, содержащих амикацин. К полученной смеси затем добавляли 17 мл 0,1 М хлорида кальция с получением кохлеатов. Кохлеаты затем концентрировали посредством лиофилизации с получением кристаллических кохлеатов (примерно 6,7 мг/мл) с соотношением липид : амикацин примерно 10:1.
#5.2 Экспериментальный состав:
200 мг амикацина в 20 мл D.D. воды фильтровали через 0,22 мкм фильтр и объединяли с 2000 мг 50% соевого ФС в 200 мл стерильной воды (липосомы фильтровали через 5, 0,8 и 0,45 мкм фильтр) с получением липосом, содержащих амикацин. К полученной смеси затем добавляли 17 мл 0,1 М хлорида кальция с получением кохлеатов. Чтобы уменьшить размер агрегации кристаллических кохлеатов, к смеси кохлеатов затем добавляли 1125,2 мг хлорида натрия в 3,88 мл стерильной воды. Кохлеаты затем концентрировали посредством лиофилизации с получением кристаллических кохлеатов (примерно 6,7 мг/мл и 0,66 М хлорида натрия) с соотношением липид : амикацин примерно 10:1.
ПРИМЕР 6. Исследование состава, содержащего кристаллические кохлеаты, нагруженные аминогликозидами, in vitro
Макрофаги и инфицирование
Клеточные линии: клеточная линия перитонеальных макрофагов мыши (Raw 246.7), и/или ТНР-1, клеточная линия макрофагов человека. Клетки культивировали в DMEM и RPMI-1640, соответственно, с добавлением 5% фетальной бычьей сыворотки, инактивированной нагреванием. Монослои макрофагов создавали добавлением 105 макрофагов в 24-луночный планшет для культивирования тканей. Через 24 часа монослои инфицировали, и инфицирование проводили в течение 1 часа, и затем экстрацеллюлярные бактерии удаляли посредством промывания. Содержимое нескольких лунок лизировали и высевали на агаровый планшет Middlebrook 7Н10 для определения внутриклеточного инокулята бактерий. Остальные лунки ежедневно обрабатывали кохлеатами, нагруженнымиразличными аминогликозидами, (например, амикацином, гентамицином и паромомицином), полученными в соответствии с заявленным способом. После обработки монослои клеток лизировали, и лизат высевали на 7Н10 агар для количественной оценки внутриклеточной нагрузки.
Как показано в Таблице 1, кохлеаты, нагруженные аминогликозидами, имеют повышенную эффективность против различных бактерий по сравнению с соответствующими свободными лекарственными средствами, не включенными в кохлеаты.
ПРИМЕР 7. Исследование состава, содержащего кристаллические кохлеаты с Амикацином in vitro
Способы: Как показано в примере 4, составы с амикацином, (Amkcch) оптимизировали по эффективности включения амикацина в кохлеат и размеру частиц посредством варьирования типа используемого ФС, соотношения ФС : биологически активный агент, соотношения ФС : Са++ и концентрации NaCl. Эффективность Amkcch против интрацеллюлярных Ма инфекций оценивали in vitro с использованием перитонеальных макрофагов мыши, инфицированных М. avium, штаммами MAC 101 или MAC 109. Клетки перитонеальных макрофагов мыши (Mo) Raw 264.7 высевали по 105 клеток/лунка. Монослои Мо инфицировали при соотношении 1:10 в течение 1 часа и удаляли экстрацеллюлярные бактерии. Монослои обрабатывали свободным амикацином и/или лекарственным средством в форме кохлеатов в течение 4 дней и определяли количество интрацеллюлярных бактерий. Количественное определение повторяли трижды.
Результаты: Необработанные контрольные Ма штаммы выросли в культуре клеток Мо от 3,8'105 до 4,9'106. Ма в клетках Мо, обработанных свободным амикацином (10 и 20 мг/мл), были элиминированы до 6,1 и 3,4'104 бактерий, соответственно. Оптимизированные Amkcch (10 и 20 мг/мл) продемонстрировали эффективность, повышенную более чем в 10 раз, уменьшение количества бактерий до 3,9 и 1,7'103 бактерий в клетках Мо (р<0,05 в сравнении со свободным амикацином).
Выводы: Как показано на фигуре 1, составы кохлеатов, нагруженных амикацином, являются в 10-50 раз более активными, чем свободный амикацин, против инфекции М. avium в макрофагах. Лекарственные средства в форме кохлеатов, нагруженных амикацином, показали значительную и увеличенную активность против Ма штаммов в макрофагах, из чего можно предположить, что кохлеаты достигают более высокой внутриклеточной концентрации и в течение более длительного времени, чем свободный амикацин.
ПРИМЕР 8. Исследование состава, содержащего кристаллические кохлеаты с Амикацином, in vivo
Разработана конструкция кохлеатов, включающих амикацин. Эффективность кохлеатов, нагруженных амикацином, in vivo против Mycobacterium avium complex (MAC) оценивали с применением линии черных мышей C57BL/6.
- Мышей, 12/группа, инфицировали М. avium 101 (8,1×107 бактерий/мышь) посредством инъекции в хвостовую вену.
- Через 7 дней отбирали 6 мышей и определяли количество MAC в селезенке для установления базового уровня бактериальной нагрузки (Время 0).
- Мышей обрабатывали различными кохлеатами, нагруженными амикацином, как показано на фигурах 2 и 3
- по 1,0 мг амикацина/день в течение 2 недель.
- Мышей отбирали на неделе 3 и через 2 дня (после 2 недель обработки), селезенки гомогенизировали и высевали на агар 7Н10.
- Подсчитывали колонии на планшетах и анализировали данные.
Как продемонстрировано на фигурах 2 и 3, кохлеаты, нагруженные амикацином, вводимые внутрибрюшинно или перорально, были активными, уменьшая количество бактериальной нагрузки в селезенке. Лекарственное средство в форме кохлеатов, включающих амикацин, с высокой концентрацией соли вводили перорально.
Вывод: Пероральное введение составов в форме кохлеатов, нагруженных амикацином, демонстрирует эффективность in vivo, аналогичную внутрибрюшинной доставке свободного амикацина.
ПРИМЕР 9. Способ получения составов с высоким содержанием соли, содержащих аминогликозиды, для исследования in vitro
#9.1 Экспериментальный состав:
2 мг аминогликозида в 1,0 мл D.D воды фильтровали через 0,22 мкм фильтр и объединяли с 20 мг 50% соевого ФС в 2,0 мл стерильной воды (липосомы фильтровали через 5, 0,8 и 0,45 мкм фильтр) с получением липосом, содержащих аминогликозид. К полученной смеси затем добавляли 0,206 мл 0,1 М хлорида кальция с получением кохлеатов. Затем доводили концентрацию лекарственного средства аминогликозида в смеси до 0,5 мг/мл стерильной водой. Для получения оптимальных кристаллических кохлеатов, нагруженных аминогликозидом, соотношение липид : лекарственное средство составляло примерно 10:1.
#9.2 Экспериментальный состав:
2 мг аминогликозида в 1,0 мл D.D воды фильтровали через 0,22 мкм фильтр и объединяли с 20 мг 50% соевого ФС в 2,0 мл стерильной воды (липосомы фильтровали через 5, 0,8 и 0,45 мкм фильтр) с получением липосом, содержащих аминогликозид. К полученной смеси затем добавляли 0,206 мл 0,1 М хлорида кальция с получением кохлеатов. Чтобы уменьшить размер агрегации кристаллических кохлеатов, к смеси кохлеатов затем добавляли 15 мг хлорида натрия в 52 мкл стерильной воды. Затем доводили концентрацию аминогликозида в смеси до 0,5 мг/мл стерильной водой. При этом конечный продукт содержал 0,066 М хлорида натрия. Для получения оптимальных кристаллических кохлеатов, нагруженных аминогликозидом, соотношение липид : лекарственное средство составляло примерно 10:1.
#9.3 Экспериментальный состав:
2 мг аминогликозида в 1,0 мл D.D воды фильтровали через 0,22 мкм фильтр и объединяли с 20 мг 50% соевого ФС в 2,0 мл стерильной воды (липосомы фильтровали через 5, 0,8 и 0,45 мкм фильтр) с получением липосом, содержащих аминогликозид. К полученной смеси затем добавляли 0,206 мл 0,1 М хлорида кальция с получением кохлеатов. Чтобы уменьшить размер агрегации кристаллических кохлеатов, к смеси кохлеатов затем добавляли 76 мг хлорида натрия в 264 мкл стерильной воды. Затем доводили концентрацию аминогликозида в смеси до 0,5 мг/мл стерильной водой. При этом конечный продукт содержал 0,33 М хлорида натрия. Для получения оптимальных кристаллических кохлеатов, нагруженных аминогликозидом, соотношение липид : лекарственное средство составляло примерно 10:1.
#9.4 Экспериментальный состав:
2 мг аминогликозида в 1,0 мл D.D воды фильтровали через 0,22 мкм фильтр и объединяли с 20 мг 50% соевого ФС в 2,0 мл стерильной воды (липосомы фильтровали через 5, 0,8 и 0,45 мкм фильтр) с получением липосом, содержащих аминогликозид. К полученной смеси затем добавляли 0,206 мл 0,1 М хлорида кальция с получением кохлеатов. Чтобы уменьшить размер агрегации кристаллических кохлеатов, к смеси кохлеатов затем добавляли 152 мг хлорида натрия в 524 мкл стерильной воды. Затем доводили концентрацию аминогликозида в смеси до 0,5 мг/мл стерильной водой. При этом конечный продукт содержал 0,66 М хлорида натрия. Для получения оптимальных кристаллических кохлеатов, нагруженных аминогликозидом, соотношение липид : лекарственное средство составляло примерно 10:1.
Процент включения в кохлеаты определяли посредством измерения количества амикацина в супернатанте (нингидриновый метод) после образования кохлеатов и последующего центрифугирования. Количество в супернатанте затем вычитали из общего количества в процессе включения в кохлеаты. Это обозначено в виде процентов в супернатанте. Чем ниже процент в супернатанте, тем выше эффективность включения в кохлеаты. Результаты, приведенные в таблице 2, четко демонстрируют, что 50% соевый ФС является более эффективным при включении в кохлеаты, чем 85% ФС.
Процент включения в кохлеаты определяли посредством измерения количества амикацина в супернатанте (нингидриновый метод) после образования кохлеатов и последующего центрифугирования. Количество в супернатанте затем вычитали из общего количества в процессе включения в кохлеаты. Это обозначено в виде процентов в супернатанте. Чем ниже процент в супернатанте, тем выше эффективность включения в кохлеаты. Результаты, приведенные в таблице 3, четко демонстрируют, что 50% соевый ФС является более эффективным при включении в кохлеаты, чем 85% ФС.
Процент включения в кохлеаты определяли посредством измерения количества амикацина в супернатанте (нингидриновый метод) после образования кохлеатов и последующего центрифугирования. Количество в супернатанте затем вычитали из общего количества в процессе включения в кохлеаты. Это обозначали в виде процентов в супернатанте. Чем ниже процент в супернатанте, тем выше эффективность включения в кохлеаты. Результаты, приведенные в таблице 4, четко демонстрируют, что 50% соевый ФС является более эффективным при включении в кохлеаты, чем 99,99% ФС.
На фигуре 4 показано включение в кохлеаты гентамицина в зависимости от свойств ФС. Аналогично таблицам 1-3, результаты, приведенные на фигуре 4, четко демонстрируют, что 50% соевый ФС является более эффективным при включении в кохлеаты гентамицина при низких концентрациях солей желчных кислот, чем 85% ФС или 99,99% ФС.
ПРИМЕР 10. Эффективность включения в кохлеаты Амикацина, Гентамицина и Паромомицина с солями желчных кислот
#10.1 Методика получения состава, содержащего аминогликозид, с солями желчных кислот (после кальция) для исследований in vitro.
Кристаллические кохлеаты для состава, содержащего аминогликозид, с различными количествами солей желчных кислот (Sigma - Aldrich каталожный номер #48305 Fluka холевой кислоты натриевая соль, ~50% дезоксихолевой кислоты натриевая соль, ~50%):
Аминогликозид, 2 мг в 0,2 мл стерильной воды фильтровали через 0,22 мкм фильтр и объединяли с 20 мг липосом 50% соевого ФС в 2,0 мл стерильной воды (липосомы соевого ФС сначала фильтровали через 5, 0,8, 0,45 мкм фильтры) с получением липосом, содержащих аминогликозид. К полученной смеси затем добавляли 0,159 мл 0,1 М хлорида кальция при интенсивном перемешивании с получением кохлеатов, нагруженных аминогликозидом. Для того чтобы уменьшить размер частиц кохлеатов, включающих аминогликозид, к смеси кохлеатов, нагруженных аминогликозидом, затем добавляли 20,4 мг солей желчных кислот. Затем концентрацию лекарственного средства аминогликозида в смеси доводили тем же буфером, что и суспензию, до 0,5 мг/мл. Конечные составы кохлеатов, нагруженных аминогликозидом, содержали 11,3 мМ.
Аминогликозид, 2 мг в 0,2 мл стерильной воды фильтровали через 0,22 мкм фильтр и объединяли с 20 мг липосом 50% соевого ФС в 2,0 мл стерильной воды (липосомы соевого ФС сначала фильтровали через 5, 0,8, 0,45 мкм фильтры) с получением липосом, содержащих аминогликозид. К полученной смеси затем добавляли 0,159 мл 0,1 М хлорида кальция при интенсивном перемешивании с получением кохлеатов, нагруженных аминогликозидом. Для того чтобы уменьшить размер частиц кохлеатов, включающих аминогликозид, к смеси кохлеатов, нагруженных аминогликозидом затем добавляли 13,6 мг солей желчных кислот. Затем концентрацию лекарственного средства аминогликозида в смеси доводили тем же буфером, что и суспензию, до 0,5 мг/мл. Конечные составы кохлеатов, нагруженных аминогликозидом, содержали 7,8 мМ.
Аминогликозид, 2 мг в 0,2 мл стерильной воды фильтровали через 0,22 мкм фильтр и объединяли с 20 мг липосом 50% соевого ФС в 2,0 мл стерильной воды (липосомы соевого ФС сначала фильтровали через 5, 0,8, 0,45 мкм фильтры) с получением липосом, содержащих аминогликозид. К полученной смеси затем добавляли 0,159 мл 0,1 М хлорида кальция при интенсивном перемешивании с получением кохлеатов, нагруженных аминогликозидом. Для того чтобы уменьшить размер частиц кохлеатов, включающих аминогликозид, к смеси кохлеатов, нагруженных аминогликозидом, затем добавляли 6,8 мг солей желчных кислот. Затем концентрацию лекарственного средства аминогликозида в смеси доводили тем же буфером, что и суспензию, до 0,5 мг/мл. Конечные составы кохлеатов, нагруженных аминогликозидом, содержали 3,9 мМ.
Аминогликозид, 2 мг в 0,2 мл стерильной воды фильтровали через 0,22 мкм фильтр и объединяли с 20 мг липосом 50% соевого ФС в 2,0 мл стерильной воды (липосомы соевого ФС сначала фильтровали через 5, 0,8, 0,45 мкм фильтры) с получением липосом, содержащих аминогликозид. К полученной смеси затем добавляли 0,159 мл 0,1 М хлорида кальция при интенсивном перемешивании с получением кохлеатов, нагруженных аминогликозидом. Для того чтобы уменьшить размер частиц кохлеатов, включающих аминогликозид, к смеси кохлеатов, нагруженных аминогликозидом, затем добавляли 3,4 мг солей желчных кислот. Затем концентрацию лекарственного средства аминогликозида в смеси доводили тем же буфером, что и суспензию, до 0,5 мг/мл. Конечные составы кохлеатов, нагруженных аминогликозидом, содержали 1,95 мМ.
Аминогликозид, 2 мг в 0,2 мл стерильной воды фильтровали через 0,22 мкм фильтр и объединяли с 20 мг липосом 50% соевого ФС в 2,0 мл стерильной воды (липосомы соевого ФС сначала фильтровали через 5, 0,8, 0,45 мкм фильтры) с получением липосом, содержащих аминогликозид. К полученной смеси затем добавляли 0,159 мл 0,1 М хлорида кальция при интенсивном перемешивании с получением кохлеатов, нагруженных аминогликозидом. Для того чтобы уменьшить размер частиц кохлеатов, включающих аминогликозид, к смеси кохлеатов, нагруженных аминогликозидом, затем добавляли 1,7 мг солей желчных кислот. Затем концентрацию лекарственного средства аминогликозида в смеси доводили тем же буфером, что и суспензию, до 0,5 мг/мл. Конечные составы кохлеатов, нагруженных аминогликозидом, содержали 0,97 мМ.
#10.2 Методика получения состава, содержащего аминогликозид, с солями желчных кислот (до кальция) для исследований in vitro.
Аминогликозид, 2 мг в 0,2 мл стерильной воды фильтровали через 0,22 мкм фильтр и объединяли с 20 мг липосом 50% соевого ФС в 2,0 мл стерильной воды (липосомы соевого ФС сначала фильтровали через 5, 0,8, 0,45 мкм фильтры) с получением липосом, содержащих аминогликозид. Для того чтобы уменьшить размер частиц кохлеатов, включающих аминогликозид, к смеси липосом, содержащих аминогликозид, затем добавляли 20,4 мг солей желчных кислот. К полученной смеси затем добавляли 0,159 мл 0,1 М хлорида кальция при интенсивном перемешивании с получением кохлеатов, нагруженных аминогликозидом. Затем концентрацию лекарственного средства аминогликозида в смеси доводили тем же буфером, что и суспензию, до 0,5 мг/мл. Конечные составы кохлеатов, нагруженных аминогликозидом, содержали 11,3 мМ.
Аминогликозид, 2 мг в 0,2 мл стерильной воды фильтровали через 0,22 мкм фильтр и объединяли с 20 мг липосом 50% соевого ФС в 2,0 мл стерильной воды (липосомы соевого ФС сначала фильтровали через 5, 0,8, 0,45 мкм фильтры) с получением липосом, содержащих аминогликозид. Для того чтобы уменьшить размер частиц кохлеатов, включающих аминогликозид, к смеси липосом, содержащих аминогликозид, затем добавляли 13,6 мг солей желчных кислот. К полученной смеси затем добавляли 0,159 мл 0,1 М хлорида кальция при интенсивном перемешивании с получением кохлеатов, нагруженных аминогликозидом. Затем концентрацию лекарственного средства аминогликозида в смеси доводили тем же буфером, что и суспензию, до 0,5 мг/мл. Конечные составы кохлеатов, нагруженных аминогликозидом, содержали 7,8 мМ.
Аминогликозид, 2 мг в 0,2 мл стерильной воды фильтровали через 0,22 мкм фильтр и объединяли с 20 мг липосом 50%» соевого ФС в 2,0 мл стерильной воды (липосомы соевого ФС сначала фильтровали через 5, 0,8, 0,45 мкм фильтры) с получением липосом, содержащих аминогликозид. Для того чтобы уменьшить размер частиц кохлеатов, включающих аминогликозид, к смеси липосом, содержащих аминогликозид, затем добавляли 6,8 мг солей желчных кислот. К полученной смеси затем добавляли 0,159 мл 0,1 М хлорида кальция при интенсивном перемешивании с получением кохлеатов, нагруженных аминогликозидом. Затем концентрацию лекарственного средства аминогликозида в смеси доводили тем же буфером, что и суспензию, до 0,5 мг/мл. Конечные составы кохлеатов, нагруженных аминогликозидом, содержали 3,9 мМ.
Аминогликозид, 2 мг в 0,2 мл стерильной воды фильтровали через 0,22 мкм фильтр и объединяли с 20 мг липосом 50% соевого ФС в 2,0 мл стерильной воды (липосомы соевого ФС сначала фильтровали через 5, 0,8, 0,45 мкм фильтры) с получением липосом, содержащих аминогликозид. Для того чтобы уменьшить размер частиц кохлеатов, включающих аминогликозид, к смеси липосом, содержащих аминогликозид, затем добавляли 3,4 мг солей желчных кислот. К полученной смеси затем добавляли 0,159 мл 0,1 М хлорида кальция при интенсивном перемешивании с получением кохлеатов, нагруженных аминогликозидом. Затем концентрацию лекарственного средства аминогликозида в смеси доводили тем же буфером, что и суспензию, до 0,5 мг/мл. Конечные составы кохлеатов, нагруженных аминогликозидом, содержали 1,95 мМ.
Аминогликозид, 2 мг в 0,2 мл стерильной воды фильтровали через 0,22 мкм фильтр и объединяли с 20 мг липосом 50% соевого ФС в 2,0 мл стерильной воды (липосомы соевого ФС сначала фильтровали через 5, 0,8, 0,45 мкм фильтры) с получением липосом, содержащих аминогликозид. Для того чтобы уменьшить размер частиц кохлеатов, включающих аминогликозид, к смеси липосом, содержащих аминогликозид, затем добавляли 1,7 мг солей желчных кислот. К полученной смеси затем добавляли 0,159 мл 0,1 М хлорида кальция при интенсивном перемешивании с получением кохлеатов, нагруженных аминогликозидом. Затем концентрацию лекарственного средства аминогликозида в смеси доводили тем же буфером, что и суспензию, до 0,5 мг/мл. Конечные составы кохлеатов, нагруженных аминогликозидом, содержали 0,97 мМ.
На фигурах 5-11 показана эффективность включения в кохлеаты аминогликозидов с солями желчных кислот, включая амикацин с солями желчных кислот, гентамицин с солями желчных кислот и паромомицин с солями желчных кислот.
Процент включения в кохлеаты определяли посредством измерения количества аминогликозида с солями желчных кислот в супернатанте (нингидриновый метод) после образования кохлеатов и последующего центрифугирования. Количество в супернатанте затем вычитали из общего количества в процессе включения в кохлеаты. Данные результаты четко демонстрируют, что 50% соевый ФС является более эффективным при включении в кохлеаты при более низких концентрациях солей желчных кислот, чем 75% ФС или 99,99% ФС. А - соли желчных кислот, добавленные после включения в кохлеаты. В - соли желчных кислот, добавленные до включения в кохлеаты.
1. Кохлеат для доставки биологически активного агента, содержащий:
фосфолипид на основе сои, который содержит 45% - 55% по массе фосфатидилсерина сои,
мультивалентный катион и
биологически активный агент.
2. Кохлеат по п. 1, отличающийся тем, что фосфолипид на основе сои представляет собой смесь, состоящую из по меньшей мере фосфатидилсерина сои и фосфатидной кислоты.
3. Кохлеат по п. 1, отличающийся тем, что биологически активный агент представляет собой по меньшей мере один агент, выбранный из группы, состоящей из белка, малого пептида, полинуклеотида, аминогликозида, противовирусного агента, анестетика, антибиотика, противогрибкового агента, противоопухолевого агента, иммуносупрессора, стероидного противовоспалительного агента, нестероидного противовоспалительного агента, транквилизатора, пищевой добавки, растительного продукта, витамина или сосудорасширяющего средства.
4. Кохлеат по п. 3, отличающийся тем, что биологически активный агент представляет собой по меньшей мере один агент, выбранный из группы, состоящей из аминогликозида, амфотерицина В, ацикловира, адриамицина, карбамазепина, куркумина, мелфалана, нифедипина, индометацина, напроксена, эстрогенов, тестостеронов, стероидов, фенитоина, эрготаминов, каннабиноидов, рапамицина, пропанидида, пропофола, альфадиона, эхиномицина, миконазола нитрата, тенипозида, таксана, паклитаксела и таксотера.
5. Кохлеат по любому из пп. 1-4, отличающийся тем, что мультивалентный катион представляет собой Са++, Zn++, Ва++ или Mg++.
6. Кохлеат по любому из пп. 1-4, отличающийся тем, что мультивалентный катион представляет собой Са++.
7. Кохлеат по любому из пп. 1-4, отличающийся тем, что биологически активный агент представляет собой амфотерицин В.
8. Кохлеат по любому из пп. 1-4, отличающийся тем, что биологически активный агент представляет собой куркумин.
9. Кохлеат по любому из пп. 1-4, отличающийся тем, что биологически активный агент представляет собой аминогликозид.
10. Кохлеат по любому из пп. 1-4, отличающийся тем, что биологически активный агент представляет собой амикацин.
11. Кохлеат по любому из пп. 1-4, отличающийся тем, что кохлеат дополнительно содержит соли желчных кислот.
12. Кохлеат по п. 11, отличающийся тем, что массовое соотношение фосфолипида на основе сои к солям желчных кислот составляет от 20:1 до 0,5:1 или от 10:1 до 3:1.
13. Способ получения кохлеатов из фосфатидилсерина на основе сои/биологически активного агента, который включает стадии:
a. получения липосом в водной среде, причем липосомы включают (i) липидный бислой, содержащий фосфатидилсерин сои в количестве 45% - 55% по массе липидного бислоя и (ii) нагрузку из биологически активного агента;
b. добавления мультивалентного катиона к суспензии липосом из стадии (а) с образованием кохлеатов из фосфатидилсерина сои/биологически активного агента; и
c. сбора кохлеатов из фосфатидилсерина на основе сои/биологически активного агента.
14. Способ по п. 13, отличающийся тем, что водная среда из стадии (а), содержащая суспензию липосом, представляет собой забуференную среду с рН 6,5-7,5, и нагрузка из биологически активного агента имеет рН 10 или выше перед добавлением к липосомам.
15. Способ по п. 14, отличающийся тем, что суспензия липосом забуферена фосфатом.
16. Способ по любому из пп. 13-15, отличающийся тем, что биологически активный агент представляет собой по меньшей мере один агент, выбранный из группы, состоящей из белка, малого пептида, полинуклеотида, противовирусного агента, анестетика, антибиотика, противогрибкового агента, противоопухолевого агента, иммуносупрессора, стероидного противовоспалительного агента, нестероидного противовоспалительного агента, транквилизатора, пищевой добавки, растительного продукта, витамина или сосудорасширяющего средства.
17. Способ по п. 16, отличающийся тем, что биологически активный агент представляет собой по меньшей мере один агент, выбранный из группы, состоящей из аминогликозида, амфотерицина В, ацикловира, адриамицина, карбамазепина, куркумина, мелфалана, нифедипина, индометацина, напроксена, эстрогенов, тестостеронов, стероидов, фенитоина, эрготаминов, каннабиноидов, рапамицина, пропанидида, пропофола, альфадиона, эхиномицина, миконазола нитрата, тенипозида, таксана, паклитаксела и таксотера.
18. Способ по любому из пп. 13-15, отличающийся тем, что мультивалентный катион представляет собой Са++, Zn++, Ва++ или Mg++.
19. Способ по любому из пп. 13-15, отличающийся тем, что мультивалентный катион представляет собой Са++.
20. Способ по любому из пп. 13-15, отличающийся тем, что биологически активный агент представляет собой амфотерицин В.
21. Способ по любому из пп. 13-15, отличающийся тем, что биологически активный агент представляет собой куркумин.
22. Способ по любому из пп. 13-15, отличающийся тем, что биологически активный агент представляет собой амикацин.
23. Способ по любому из пп. 13-15, отличающийся тем, что массовое соотношение липидного бислоя к биологически активному агенту составляет от примерно 3:1 до примерно 20:1.
24. Способ по любому из пп. 13-15, дополнительно включающий стадию добавления солей желчных кислот к суспензии липосом из стадии (а) перед стадией (b) или добавление солей желчных кислот к кохлеатам из фосфатидилсерина сои/биологически активного агента после стадии (b), причем массовое соотношение липидного бислоя к солям желчных кислот составляет от 20:1 до 0,5:1.
25. Способ по п. 24, в котором массовое соотношение липидного бислоя к солям желчных кислот составляет от 10:1 до 3:1.
26. Способ лечения пациента с грибковой инфекцией, который включает введение пациенту эффективного количества кохлеата, который содержит (i) фосфолипид на основе сои, включающий 45% - 55% по массе фосфатидилсерина сои, (ii) мультивалентный катион и (iii) противогрибковый агент.
27. Способ по п. 26, отличающийся тем, что противогрибковый агент представляет собой амфотерицин В.
28. Способ лечения пациента с бактериальной инфекцией, который включает введение пациенту эффективного количества кохлеата, который содержит (i) фосфолипид на основе сои, включающий 45% - 55% по массе фосфатидилсерина сои, (ii) мультивалентный катион и (iii) антибиотический агент.
29. Способ по п. 28, отличающийся тем, что антибиотический агент представляет собой амикацин.
