Способ оценки агрегационной активности тромбоцитов

Изобретение относится к области медицины, а именно к области лабораторной диагностики, кардиологии, онкологии, терапии, и может быть использовано для оценки агрегационной активности тромбоцитов. Способ включает забор пробы крови, добавление индуктора агрегации к исследуемой пробе с последующим определением величины агрегации, тест проводят с цельной стабилизированной кровью с помощью низкочастотной пьезотромбоэластографии (НПТЭГ), для этого в кювету с пробой крови в объеме 0,38 мл добавляют 0,07 мл индуктора агрегации тромбоцитов АДФ, затем в течение 10 минут регистрируют кривую интенсивности агрегации тромбоцитов, причем запись проводят дважды: исходную до назначения препарата и контрольную после приема антиагрегантного препарата, далее определяют площадь сектора (S), ограниченного с одной стороны кривой, с другой - осью абсциссы. При превышении значения площади (S) относительно площади сектора (S1), рассчитанной по референтным значениям контрольной группы условно здоровых лиц, равной 200-550 о.е., определяют повышение агрегационной активности тромбоцитов, а при снижении значения площади сектора (S) относительно площади сектора (S1) определяют снижение агрегационной активности тромбоцитов. Изобретение обеспечивает сокращение времени подготовки образца крови для тестирования, повышение точности способа, возможность количественной оценки агрегационной активности тромбоцитов. 5 ил., 1 табл., 2 пр.

 

Изобретение относится к области медицины, а именно к области лабораторной диагностики, кардиологии, онкологии, терапии, и может быть использовано для оценки агрегационной активности тромбоцитов.

Тромбоциты выполняют множество функций в поддержании гомеостаза организма, однако основной их функцией выступает участие в гемостазе, обусловленное ангиотрофической и адгезивно-агрегационной функциями [Балуда В.П. и др., 1980].

Под воздействием факторов, стимулирующих активацию тромбоцитов (тромбин, коллаген, АДФ, адреналин и т.д.), происходит их активация, функционально проявляющаяся изменением формы и экспонированием вторичных рецепторов, ключевыми из которых является GP IIb/IIIa. Помимо этого в процессе активации тромбоцита происходит экстернализация фосфатидилсерина с внутреннего слоя мембраны на наружный, результатом перемещения которого служит образование поверхности, на которой протекают гемокоагуляционные реакции [Кузник Б.И., 2010]. Являясь одним из основных составляющих тромбинового каскада, в условиях повышения агрегационной активности тромбоциты становятся первичным звеном, инициирующим фибриногенез. Это происходит за счет ряда причин, среди которых: изменение регионального кровотока, снижение тромборезистентности эндотелия (увеличение уровня эндотелина, тромбоксана А2 и т.д.) и др. [Бойцов С.А. 2004; Мазуров А.В., 2011].

В связи с вышеописанным, для предотвращения тромботических осложнений как при кардиологических заболеваниях, так и при других нозологиях, большое значение уделяется антиагрегантной терапии, составляющими которой являются ингибиторы ЦОГ-1 тромбоцитов, блокаторы P2Y12-рецепторов, антагонисты GPIIb/IIIa-рецепторов, ингибиторы фосфодиэстеразы и т.д., применяемые в виде монотерапии, а также в виде двойной антиагрегантной терапии. Множество из проводимых исследований выявляют не только резистентность к получаемой антиагрегантной терапии, но также и извращенный ответ, проявляющийся повышением функциональной активности форменных элементов крови после приема антиагреганта.

Вышеперечисленное диктует необходимость мониторинга эффективности применения антиагрегантов для профилактики развития тромботических осложнений на фоне длительной, а зачастую пожизненной терапии.

Известен способ определения агрегационной активности тромбоцитов методом низкочастотной контактной кондуктометрии. Суть метода заключается в измерении электропроводности цельной венозной нестабилизированной крови пропусканием через нее переменным током с частотой 200 Гц. Пробу крови помещают в термостатированную ячейку, погружают в нее пластинчатые электроды, соединенные с частотным генератором и блоком регистрации. За счет динамического изменения электрического сопротивления исследуемого образца крови, возникающего при коагуляции, происходит изменение проводимости, по которому оценивают наличие гипо- или гиперкоагуляционного состояния [Патент РФ №2282855, опубл. 27.08.2006]. Однако данный метод обладает рядом недостатков, среди которых: дороговизна измерительной ячейки, возникновение поляризационных явлений, приводящих к погрешности, и разрушение электродов за счет электролиза, возникающего за счет прямого контакта электродов с исследуемым образцом.

Наиболее близким к предлагаемому является способ оценки агрегации тромбоцитов турбидиметрическим методом (по Борну), на данный момент времени считающийся «золотым стандартом». Данный метод заключается в регистрации изменений светопропускания обогащенной тромбоцитами плазмы, произошедших в результате добавления индуктора агрегации тромбоцитов (АДФ, арахидоновая кислота и др.). При этом агрегация тромбоцитов отображается графически регистрируемым снижением оптической плотности и повышением светопропускания плазмой крови [Harrison Р. Platelet function analysis // Blood Reviews, 2005. Vol. 19. P. 111-123].

Основными недостатками данного метода являются: многоэтапный длительный преаналитический период пробоподготовки [Moffat K.A., Hayward С.Р., Raby A. Platelet Function Testing Performed by Light Transmittance Aggregometry // Hematology-coagulation. 2009. C. 1-8.], недостаточная точность измерений, обусловленная тем, что используют обогащенную тромбоцитами плазму, что исключает присутствие физиологического окружения тромбоцитов другими форменными элементами крови и т.д. в исследуемом образце, при этом не учитывается вклад, который вносит их взаимодействие с тромбоцитами. Также недостатком является невозможность осуществления количественной оценки агрегационной активности тромбоцитов.

Новым техническим результатом изобретения является сокращение времени подготовки образца крови для тестирования (отсутствие многоэтапного длительного преаналитического периода пробоподготовки), повышение точности способа за счет сохранения физиологического окружения тромбоцитов, возможность количественной оценки агрегационной активности тромбоцитов.

Для достижения нового технического результата в способе оценки агрегационной активности тромбоцитов, включающем забор пробы крови, добавление индуктора агрегации к исследуемой пробе с последующим определением величины агрегации, отличающемся тем, что тест проводят с цельной стабилизированной кровью с помощью низкочастотной пьезотромбоэластографии, для этого в кювету с пробой крови в объеме 0,38 мл добавляют 0,07 мл индуктора агрегации тромбоцитов, затем в течение 10 минут регистрируют кривую интенсивности агрегации тромбоцитов, далее определяют площадь сектора (S), ограниченного с одной стороны кривой, с другой - осью абсциссы, и при превышении значения площади (S) относительно площади сектора (S1), рассчитанного по референтным значениям контрольной группы условно здоровых лиц, определяют повышение агрегационной активности тромбоцитов, а при снижении значения площади (S2) относительно площади сектора (S1) определяют снижение агрегационной активности тромбоцитов.

Способ осуществляют следующим образом. У пациента из кубитальной вены, без наложения жгута, трехкомпонентным силиконированным шприцем, объемом 1 мл, производят забор цельной венозной крови. В течение 10 секунд от момента забора, кровь помещают в кювету, располагающуюся в термостате аппаратно-программного комплекса для клинико-диагностических исследований реологических свойств крови (АРП-01 М «Меднорд», Россия. Регистрационное свидетельство № ФСР 2010/09767 от 30 декабря 2010 года). В кювету помещают кровь в объеме 0,38 мл и добавляют 0,07 мл индуктора агрегации тромбоцитов. Интенсивность агрегации тромбоцитов регистрируют в виде кривой на экране персонального компьютера в течение 10 минут, под которой рассчитывают площадь (S). С помощью программы ИКС-ГЕМО 3-М и при превышении значения площади (S) относительно площади сектора (S1), рассчитанной по референтным значениям контрольной группы условно здоровых лиц, определяют повышение агрегационной активности тромбоцитов, а при снижении значения площади (S2) относительно площади сектора (S1) определяют снижение агрегационной активности тромбоцитов.

Способ основан на результатах анализа данных клинических исследований, проведенных у двух групп. Первую группу составили пациенты, нуждающиеся в назначении антиагрегантной терапии (n=10), вторую группу составили условно здоровые добровольцы (n=10), чьи показатели площади (S1) были определены как референтные значения агрегационной активности тромбоцитов, при наличии информированного согласия исследуемых обеих групп. У пациентов 1-ой группы была проведена сравнительная оценка динамики показателей «S» и «степень агрегации». Определение показателя «степень агрегации» производили методом исследования агрегации тромбоцитов по Борну на анализаторе агрегации «АЛАТ-2» БИОЛА (НПФ БИОЛА, Россия). Запись НПТЭГ проводилась дважды - исходная запись, до назначения препарата, и контрольная, после приема антиагрегантного препарата. Количественные данные представлены в виде Me [LQ; UQ], где Me - медиана, LQ - нижний квартиль, UQ - верхний квартиль, р - достигнутый уровень (Табл. 1 Приложения).

Референтные значения агрегационной активности тромбоцитов условно здоровых добровольцев, выражаемые показателем S1, по результатам проведенных исследований составили: 324 о.е. [200; 550].

Пример №1

20.07.2016. Здоровый доброволец Д., 36 лет. После получения информированного согласия произведена оценка агрегационной активности тромбоцитов до и после приема клопидогрела (150 мг).

10:00. Проведено обследование: уровень систолического артериального давления - 120, диастолического - 85 мм рт.ст, частота сердечных сокращений 71/мин.

Из кубитальной вены правой руки, без наложения жгута, с использованием иглы от трехкомпонентного силиконированного шприца, производили забор венозной крови в две одноразовые стерильные вакуумные пробирки для взятия крови (BD Vacutainer®), объемом 4,5 мл каждая, содержащие буферный раствор цитрата натрия (соотношение кровь:цитрат 9:1). 0,38 мл крови, взятых из первой пробирки, помещали в стандартную кювету, объемом 0,45 мл, находящуюся в термостате АРП-01 М «Меднорд». После этого в кювету добавляли индуктор АДФ, объемом 0,07 мл в концентрации 2,5×10-5 моль/л. На фиг. 1 представлена НПТЭГ, отображающая исходную агрегационную активность форменных элементов крови. Значение агрегационной активности тромбоцитов, определяемое методом НПТЭГ, находилось в пределах референтных значений (S=324 о.е.).

Параллельно с проводимым исследованием НПТЭГ проводили исследование агрегационной активности по методу Борна с использованием индуктора АДФ в концентрации 2,5×10-5 моль/л на обогащенной тромбоцитами плазме. Для получения обогащенной тромбоцитами плазмы использовали центрифугу LABOFUGE 200 (Германия). Содержимое второй пробирки центрифугировали на 3500 оборотах в течение 6 минут. После этого производили запись агрегатограммы с использованием агрегометра Биола АЛАТ-2 (Россия). На фиг. 2 представлена исходная агрегатограмма. Агрегационная активность тромбоцитов находилась в пределах референтных значений (степень агрегации 25%)

10:30. Прием 150 мг клопидогрела.

13:00. По стандартной методике производили забор крови венозной крови в две одноразовые стерильные вакуумные пробирки для взятия крови (BD Vacutainer®), объемом 4,5 мл каждая, содержащие буферный раствор цитрата натрия (соотношение кровь:цитрат 9:1). 0,38 мл крови, взятых из первой пробирки, помещали в стандартную кювету, объемом 0,45 мл, находящуюся в термостате АРП-01М «Меднорд». После этого в кювету добавляли индуктор АДФ, объемом 0,07 мл в концентрации 2,5×10-5 моль/л. На фиг. 1 приведена НПТЭГ после проведения пробы. Агрегационная активность тромбоцитов (S) составила 56,7 о.е. Параллельно по вышеописанной методике проводили исследование агрегационной активности тромбоцитов с индуктором АДФ в концентрации 2,5×10-5 моль/л на обогащенной тромбоцитами плазме (Биола АЛАТ-2, Россия). На фиг. 2 представлена агрегатограмма после приема 150 мг клопидогрела. Агрегационная активность тромбоцитов при проведении индуцированной агрегации по Борну составила 5%.

В ответ на фармакологическую нагрузку (Клопидогрел, 150 мг) регистрировали снижение агрегационной активности тромбоцитов (S) на 82,5%. Агрегационная активность тромбоцитов по данным агрегатометрии (по Борну) после приема 150 мг клопидогрела снизилась на 80%.

Вывод: оценка изменения агрегационной активности тромбоцитов, при сохранении их физиологического окружения, с помощью предлагаемого способа демонстрирует возможность его применения в клинической практике. При этом отпадает необходимость длительного этапа пробоподготовки с целью получения плазмы, насыщенной тромбоцитами, что существенно способствует оптимизации временного ресурса теста.

Пример №2

21.07.2016. Здоровый доброволец Л. 27 лет. После получения информированного согласия произведена оценка агрегационной активности тромбоцитов до и после приема клопидогрела (150 мг).

10:00. Проведено обследование: уровень систолического артериального давления - 118, диастолического - 75 мм рт.ст, частота сердечных сокращений 84/мин. Из кубитальной вены правой руки, без наложения жгута, с использованием иглы от трехкомпонентного силиконированного шприца, производили забор венозной крови в две одноразовые стерильные вакуумные пробирки для взятия крови (BD Vacutainer®), объемом 4,5 мл каждая, содержащие буферный раствор цитрата натрия (соотношение кровь:цитрат 9:1). 0,38 мл крови, взятых из первой пробирки, помещали в кювету, объемом 0,45 мл, находящуюся в термостате АРП-01 М «Меднорд». После этого в кювету добавляли индуктор АДФ, объемом 0,07 мл в концентрации 2,5×10-5 моль/л. На фиг. 3 представлена НПТЭГ, отображающая исходную агрегационную активность форменных элементов крови. Значение агрегационной активности тромбоцитов, определяемое методом НПТЭГ, находилось в пределах референтных значений условно здоровых лиц (S=200 о.е.). Параллельно, по вышеописанной методике проводили исследование агрегационной активности тромбоцитов с индуктором АДФ в концентрации 2,5×10-5 моль/л на обогащенной тромбоцитами плазме (Биола АЛАТ-2, Россия). На фиг. 4 представлена исходная агрегатограмма. Агрегационная активность тромбоцитов достигла 60%.

10:30. Прием 150 мг клопидогрела.

13:00. По стандартной методике производили забор крови венозной крови в две одноразовые стерильные вакуумные пробирки для взятия крови (BD Vacutainer®), объемом 4,5 мл каждая, содержащие буферный раствор цитрата натрия (соотношение кровь:цитрат 9:1). 0,38 мл крови, взятых из первой пробирки, помещали в стандартную кювету, объемом 0,45 мл, находящуюся в термостате АРП-01М «Меднорд». После этого в кювету добавляли индуктор АДФ, объемом 0,07 мл в концентрации 2,5×10-5 моль/л. На фиг. 3 приведена НПТЭГ после проведения пробы. Агрегационная активность тромбоцитов (S) составила 35 о.е. Параллельно по вышеописанной методике проводили исследование агрегационной активности тромбоцитов с индуктором АДФ в концентрации 2,5×10-5 моль/л на обогащенной тромбоцитами плазме (Биола АЛАТ-2, Россия). На фиг. 4 представлена агрегатограмма после приема 150 мг клопидогрела. Агрегационная активность тромбоцитов при проведении индуцированной агрегации по Борну составила 0%.

В ответ на фармакологическую нагрузку (Клопидогрел, 150 мг) регистрировали снижение агрегационной активности тромбоцитов (S) на 82,5%. Агрегационная активность тромбоцитов по данным агрегатометрии (по Борну) после приема 150 мг клопидогрела снизилась на 100%.

Вывод: оценка агрегационной активности тромбоцитов с помощью НПТЭГ с использованием пробы стабилизированной крови, в которой сохранено физиологическое окружение тромбоцитов, позволяет выполнить более объективную оценку их агрегационной активности, что открывает возможность применения предлагаемого способа в клинической практике. Также во время пробоподготовки для получения плазмы, обогащенной тромбоцитами по способу Борна, оказывается физическое воздействие на тромбоциты, что также снижает точность измерений и увеличивает его временной ресурс.

Приложение

Таблица 1. Показатель S1 здоровых добровольцев, рассчитанный методом НПТЭГ, в о.е.

Фиг. 1. Измерение агрегационной активности тромбоцитов с помощью НПТЭГ (Пример 1):

А1 - кривая исходного уровня агрегационной активности тромбоцитов;

В1 - кривая уровня агрегационной активности тромбоцитов через 2,5 часа от момента приема 150 мг клопидогрела.

Фиг. 2. Измерение агрегационной активности тромбоцитов по методу Борна (Пример 1):

А2 - кривая исходного уровня агрегационной активности тромбоцитов;

В2 - кривая уровня агрегационной активности тромбоцитов через 2,5 часа от момента приема 150 мг клопидогрела.

Фиг. 3. Измерение агрегационной активности тромбоцитов с помощью НПТЭГ (Пример 2):

A3 - кривая уровня агрегационной активности тромбоцитов;

B3 - кривая уровня агрегационной активности тромбоцитов через 2,5 часа от момента приема 150 мг клопидогрела.

Фиг. 4. Измерение агрегации тромбоцитов по методу Борна (Пример 2):

A4 - кривая исходного уровня агрегационной активности тромбоцитов;

В4-кривая уровня агрегационной активности тромбоцитов через 2,5 часа от момента приема 150 мг клопидогрела.

Фиг. 5. Измерение активности агрегации по предлагаемому способу (общая схема): (S) площадь сектора ОАХ, ограниченного с одной стороны кривой А, рассчитанной по показателям, характеризующим повышенную активность агрегации тромбоцитов, а с другой - осью абсциссы ОХ;

(S1) площадь сектора ОА11Х, ограниченного с одной стороны кривой А11, рассчитанной по референтным значениям контрольной группы условно здоровых лиц, а с другой - осью абсциссы ОХ;

(S2) площадь сектора ОА12Х, ограниченного с одной стороны кривой А12, рассчитанной по показателям, характеризующим пониженную активность агрегации тромбоцитов, а с другой - осью абсциссы ОХ.

Способ оценки агрегационной активности тромбоцитов, включающий забор пробы крови, добавление индуктора агрегации к исследуемой пробе с последующим определением величины агрегации, отличающийся тем, что тест проводят с цельной стабилизированной кровью с помощью низкочастотной пьезотромбоэластографии (НПТЭГ), для этого в кювету с пробой крови в объеме 0,38 мл добавляют 0,07 мл индуктора агрегации тромбоцитов АДФ, затем в течение 10 минут регистрируют кривую интенсивности агрегации тромбоцитов, причем запись проводят дважды: исходную до назначения препарата и контрольную после приема антиагрегантного препарата, далее определяют площадь сектора (S), ограниченного с одной стороны кривой, с другой - осью абсциссы, и при превышении значения площади (S) относительно площади сектора (S1), рассчитанной по референтным значениям контрольной группы условно здоровых лиц, равной 200-550 о.е., определяют повышение агрегационной активности тромбоцитов, а при снижении значения площади сектора (S) относительно площади сектора (S1) определяют снижение агрегационной активности тромбоцитов.



 

Похожие патенты:
Изобретение относится к лабораторной диагностике, в частности к способам определения контактного пути коагуляции плазмы крови человека. Скрининг-тест определения контактного пути коагуляции включает смешивание цитратной плазмы крови с хлоридом кальция и последующую фотометрическую регистрацию свертывания.

Изобретение относится к области медицины, а именно к гемостазиологии, и предназначено для определения степени активации тромбоцитов на момент исследования, адгезии, агрегации и ретракции тромбоцитов с помощью низкочастотной пьезотромбоэластографии на аппаратно-программном комплексе для клинико-диагностических исследований реологических свойств крови АРП-01М «Меднорд».

Изобретение относится к медицине, а именно к гемокоагулогии. Способ определения функционального состояния системы гемостаза, заключающийся в том, что проводят измерение амплитуды записи процесса свертывания крови в его начале, определяют показатели начала и конца процесса свертывания электрокоагулограммы крови и сравнивают их с одноименными показателями процесса свертывания крови в норме и при разнонаправленных отклонениях диагностируют нарушения функционального состояния системы гемостаза, отличается тем, что определяют предельное напряжение по калибровочной характеристике, калибровку проводят априори для двух измеренных и известных значений верхней и нижней границ адаптивного диапазона, калибровочной характеристикой служит функция постоянной времени, компенсирующая неопределенность предельного напряжения, выбранного произвольно, и связывающая эталонную и измеренную характеристики за счет нормирования измеренных значений известными, по калибровочной характеристике находят действительные значения постоянной времени и предельного напряжения крови, по которым последовательно строят калибровочную характеристику постоянной времени, эталонную характеристику и определяют показатели начала и конца процесса свертывания крови.

Изобретение относится к медицинской технике, а именно к устройствам для регистрации процесса свертывания крови, преимущественно к тромбоэластографам. Анализатор коагуляции - тромбоэластограф - содержит кювету 1 с исследуемой жидкостью 2, погруженный в кювету поплавок 3, установленный на штоке с возможностью совершения возвратно-поворотного перемещения, жестко связанные со штоком поплавка датчики вращающего момента 4 и угла поворота 5, последовательно соединенные усилитель 6, фазовый детектор 7 и регистрирующее устройство 8, а также генератор синусоидальных колебаний 9, связанный с датчиком угла поворота 5 и фазовым детектором 7.

Изобретение относится к применению коагулирующих композиций, содержащих в основном выделенные или по меньшей мере частично очищенный активатор протромбина змеиного яда, а также к контейнерам, содержащим указанные коагулирующие композиции, и к родственным способам применения.9 н.

Изобретение относится к практической медицине и клинико-лабораторной диагностике и касается способа индивидуального прогнозирования клинической эффективности двойной антитромбоцитарной терапии у больных острым коронарным синдромом.

Изобретение относится к области медицины и предназначено для прогнозирования преэклампсии (ПЭ) у беременных при носительстве генотипов G/A и А/А гена фактора V Лейдена (FVL) 1691.

Изобретение относится к области биотехнологии и медицины. Описан способ химической модификации антитромбинового аптамера и к получения нового антитромбинового аптамера, обладающего антикоагулянтными свойствами и пролонгированной антитромботической активностью.

Изобретение относится к медицине, а именно к способу прогнозирования исхода беременности при угрожающих преждевременных родах. Способ прогнозирования исхода беременности при угрожающих преждевременных родах путем исследования периферической венозной крови до начала сохраняющей терапии у беременных женщин с клиническими признаками угрожающих преждевременных родов в сроках гестации 24-34 недели, заключающийся в том, что в плазме крови определяют показатель резистентности активного V фактора свертывания крови к активированному протеину С и при его значении, равном 0,94 или менее, прогнозируют преждевременные роды.

Изобретение относится к определению времени свертывания жидкой среды, такой как кровь или плазма. Способ определения времени свертывания в жидкой среде, такой как кровь или плазма, включает получение микрожидкостного устройства, введение в него образца, непрерывный контроль положения фронта жидкости как функции времени L(t) и получение теоретического значения распространения фронта жидкой среды как функции времени перед свертыванием.

Изобретение относится к области медицины, а именно к области лабораторной диагностики, кардиологии, онкологии, терапии, и может быть использовано для оценки агрегационной активности тромбоцитов. Способ включает забор пробы крови, добавление индуктора агрегации к исследуемой пробе с последующим определением величины агрегации, тест проводят с цельной стабилизированной кровью с помощью низкочастотной пьезотромбоэластографии, для этого в кювету с пробой крови в объеме 0,38 мл добавляют 0,07 мл индуктора агрегации тромбоцитов АДФ, затем в течение 10 минут регистрируют кривую интенсивности агрегации тромбоцитов, причем запись проводят дважды: исходную до назначения препарата и контрольную после приема антиагрегантного препарата, далее определяют площадь сектора, ограниченного с одной стороны кривой, с другой - осью абсциссы. При превышении значения площади относительно площади сектора, рассчитанной по референтным значениям контрольной группы условно здоровых лиц, равной 200-550 о.е., определяют повышение агрегационной активности тромбоцитов, а при снижении значения площади сектора относительно площади сектора определяют снижение агрегационной активности тромбоцитов. Изобретение обеспечивает сокращение времени подготовки образца крови для тестирования, повышение точности способа, возможность количественной оценки агрегационной активности тромбоцитов. 5 ил., 1 табл., 2 пр.

Наверх