Способ получения комплекса биологически активных пептидов, восстанавливающих функцию предстательной железы

Изобретение относится к химико-фармацевтической промышленности и представляет собой способ получения комплекса биологически активных пептидов из предстательной железы убойных животных, бычков или быков, включающий операции измельчения и гомогенизации замороженной ткани, экстракции гомогената раствором кислоты уксусной, обработки надосадочной жидкости ацетоном, промывки образовавшегося осадка ацетоном, высушивания осадка, экстракции пептидов из высушенного порошка водой для инъекций, отличающийся тем, что экстракцию гомогената проводят раствором 3% кислоты уксусной, содержащим хлористый цинк в концентрации 1,2 г/л, на стадии экстракции пептидов, из высушенного порошка, добавляют фермент - сериновую эндопротеазу до концентрации 0,3%, выдерживают при температуре 65°C при постоянном перемешивании в течение 3 часов, инактивируют фермент при температуре 90°C в течение 30 минут, охлаждают до комнатной температуры, сепарируют или фильтруют и лиофилизируют. Изобретение позволяет увеличить выход и качество целевого продукта. 3 табл., 3 пр.

 

Изобретение относится к медицине, а именно к технологии получения биологически активных средств животного происхождения из предстательной железы забойных половозрелых быков и/или бычков и последующего использования при изготовлении лекарственных препаратов для лечения больных с нарушенной функцией предстательной железы. Выделенный целевой продукт представляет комплекс биологически активных пептидов обладающий органотропным действием на предстательную железу.

Биологически активные пептиды полученные из предстательной железы животных широко и успешно используется в медицине в качестве лекарственных препаратов для профилактики и лечения хронического простатита и осложнений после операций на предстательной железе. Способствуют уменьшению отека, лейкоцитарной инфильтрации и тромбоза венул предстательной железы, нормализует секреторную функцию эпителиальных клеток, увеличивают количество лецитиновых зерен в секрете ацинусов, стимулирует мышечный тонус мочевого пузыря. Уменьшают тромбообразование, обладают антиагрегантной активностью.

Изобретение может использоваться при получении пептидных препаратов из ткани предстательной железы животных в промышленных масштабах.

Известно несколько способов получения биологически активного пептидов из предстательной железы. Все они предусматривают операции гомогенизации ткани, кислотную экстракцию, отделение осадка и выделение из него целевого продукта (cм. RU №64985, опубл. 2004.03.15, RU №2413525 С2, опубл 2011.03.10). Способы различаются условиями проведения технологических операций и веществами применяемые на данных стадиях. Известные способы не позволяют получать биологически активные пептиды из предстательной в достаточном количестве и высокого качества, а так же являются слишком сложными и длительными.

Наиболее близким решением к предлагаемому изобретению являются способ получения комплекса пептидов из предстательной железы по патенту Российской Федерации №1417244. В соответствии с патентом исходное количество замороженной представленной железы убойных животных, измельчают на волчке и помещают в реактор с охлаждением и мешалкой. Сырье заливают раствором 5%-ной уксусной кислоты до pН 4,0, добавляют 1 г на 1 л хлористого цинка и включают реактор. Экстракцию проводят при 18оС в течение 48 ч при постоянном перемешивании. По окончании экстракции сырье сливают и центрифугируют 15 мин со скоростью 3000 об/мин. Надосадочную жидкость декантируют, к ней добавляют 5 частей ацетона на 1 часть экстракта при -5°С, перемешивают и формируют осадок 20 ч, после чего перемешивают и фильтруют. Полученный на фильтре осадок обрабатывают ацетоном (10 объемов). Осадок в количестве 30 г высушивают, измельчают и растворяют в дистиллированной воде из расчета 0,2 кг осадка на 10 кг воды. В течение 2 ч при 18°С перемешивают и удаляют балластные белки фильтрованием. В отфильтрованном растворе устанавливают pН 4,5, стерильно фильтруют через пластины EKS, разливают в флаконы, лиофилизируют, получают в каждом флаконе по 10 мг порошка. Выход активного вещества составляет 12 г из 1 кг сырья. Целевой продукт представляет собой лиофилизированный порошок белого или белого с желтоватым оттенком цвета, содержит комплекс биологически активных пептидов.

В результате многочисленных экспериментов были выявлены недостатки данного способа, устранение которых позволило повысить процент выхода биологически активной субстанции и повысить ее качество.

Задача настоящего изобретения состоит в разработке способа получения биологически активного целевого продукта, обеспечивающий высокий процент выхода и качества, что делает его наиболее предпочтительными при использовании в промышленных масштабах.

Техническим результатом настоящего изобретения является: увеличение выхода и качества целевого продукта.

Для достижения указанного технического результата предложен способ, который включает в себя следующие стадии:

Предстательную железу животных замораживают, замороженную ткань измельчают, гомогенизируют и проводят экстракцию 3% раствором уксусной кислоты, содержащей хлористый цинк в концентрации 1,2 г/л при массовом соотношении гомогената и раствора уксусной кислоты 1:5. Значение рН раствора должно быть pН 3,5. Для экстракции гомогенат выдерживают при температуре не выше +20°С при постоянном перемешивании в течение 48 часов. По окончании экстракции гомогенат сепарируют, отделяют твердую и жидкую фазы. К надосадочной жидкости добавляют охлажденный ацетона (температура не выше +5°С) в соотношении 1:5. Смесь перемешивают в течение 4 часов при температуре +5°С. Образовавшийся осадок отделяют на центрифуге и несколько раз промывают охлажденным ацетоном. Полученный влажный осадок сушат в вакуум-сушильном шкафу. Получают ацетоновый порошок. Ацетоновый порошок растворяют в воде для инъекций и устанавливают рН 7,0. Добавляют фермент - сериновую эндопротеазу, до конечной концентрации 0,3%, выдерживают при постоянном перемешивании при температуре +65°С в течении 3 часов. Для инактивации фермента температуру реакционной массы увеличивают до +90°С и выдерживают в течение 30 минут. Затем охлаждают до комнатной температуры, сепарируют или фильтруют. Далее проводят стерилизующую фильтрацию путем пропускания раствора через мембрану с диаметром пор 0,22 мм. Раствор разливают в емкости, замораживают и лиофилизируют. Целевой продукт представляет лиофилизированный порошок белого или белого с желтоватым оттенком цвета и содержит комплекс биологически активных пептидов.

Применение протеолитического фермента сериновой эндопротеазы, обладающей широкой субстрат - специфичностью, при высокой ионной силе, способствует более полному высвобождению и накоплению биологически активных пептидов из ацетонового порошка. Оптимальная конечная концентрация фермента при ферментативном гидролизе составляет 0,3%. Проведенными нами исследованиями, по кинетике высвобождения пептидов из ацетонового порошка при ферментативном гидролизе, установлено, что максимальное количество пептидов накапливается в гидролизате в течение 3 часов. В течении данного времени интенсивно протекает протеолиз и происходит максимальное накопление продуктов промежуточного гидролиза белково-пептидных субстратов. Применение ограниченного ферментативного гидролиза способствует полному удалению высокомолекулярных белковых примесей из целевого продукта, которые могут вызывать негативные последствия, такие как аллергические реакции и прионные заболевания. В данном случае ферментативный гидролиз можно рассматривать, как альтернативный вариант методу ультрафильтрации с целью удаления белковых веществ проявляющих побочные свойства. Отсутствие белковых примесей в целевом продукте подтверждено методами ВЭЖХ и электрофореза по Леммли (Остерман Л.А. Хроматография белков и нуклеиновых кислот. - М.: Наука, 1985. 536 с., Остерман Л.А. Методы исследования белков и нуклеиновых кислот, Электрофорез и ультрацентрифугирование (практическое пособие). - М.: Наука, 1981. 288 с.).

Согласно литературным данным при ограниченном протеолизе белков происходит высвобождение низкомолекулярных пептидов, которые обладают выраженными биологически активными свойствами. Например, при протеолизе казеина (белок содержащийся в молоке) высвобождаются пептиды, которые обладают анальгетическими свойствами - казоморфины, при протеолизе иммуноглобулинов, в частности иммуноглобулинов G, образуются иммуномодулируюшие пептиды - тафцин, ригин, пептиды коллагена и фибронектина участвующие в тканевом и клеточном гомеостазе (Структурные основы действия пептидных и белковых иммунорегуляторов. под ред. Чипенса Г.И. Рига: Зинатне, 1990. 324 с., Jinsmaa Y, Yoshikawa М, 1999; «Enzymatic release of neocasomorphin and beta-casomorphinfrom bovine beta-casein»; Peptides 20:957-962). Использование ацетона на одной из стадий технологического процесса позволяет не только удалить липиды пигменты и полисахариды, но и значительно сократить содержание уксусной кислоты и цинка хлористого в готовом продукте. Необходимо подчеркнуть, что из ацетонового порошка в основном извлекаются водорастворимые полипептиды и белки, что особенно важно при учете их фармакокинетики и биодоступности.

Сопоставимый анализ предлагаемого способа показал, что определяющим отличием заявляемого технического решения от прототипа является то, что биологически активные водорастворимые пептиды выделяют на стадии экстракции из ацетонового порошка при ферментативном гидролизе, при этом значительно повышается выход и качество целевого продукта (таблица 1). Выход биологически активного целевого продукта увеличивается более чем в два раза.

Изобретение иллюстрируется примером конкретного выполнения способа: Замороженное сырье, предстательная железа бычков или быков, в количестве 21 кг подвергают измельчению и гомогенизации до получения гомогенной массы с помощью измельчителя. Далее проводят экстракцию 3% раствором кислоты уксусной при pН 3,5, содержащим цинк хлористый в концентрации 1,2 г/л при массовом соотношении измельченной массы и экстракционного раствора 1:5. Экстракцию проводят при постоянном перемешивании в течение 48 часов при температуре не более +20°С. По окончании процесса экстракции проводят отделение жидкой и твердой части экстракционной смеси при помощи сепаратора. Режим сепарации 2000-3000 об/мин.

Отфильтрованный раствор экстракта охлаждается при перемешивании в течение 24 часов, после чего начинается процесс осаждения. К охлажденному экстракту добавляют в соотношении 1:5 охлажденного ацетона при температуре не выше +5°С. Далее смесь перемешивают и выдерживают в течение 4 часов для формирования осадка. Осадок отделяется от жидкой фазы при помощи центрифуги. Твердая фаза несколько раз (2-3 раза) промывается охлажденным ацетоном до тех пор, пока осадок не приобретет светло-серый или белый цвет. Полученный влажный осадок ацетонового порошка направляют в вакуумно-сушильный шкаф для сушки при температуре не выше +20°С. Время высушивания составляет 2,5-3,0 часа. Получают ацетоновый порошок в количестве 1,0 кг. Водно-ацетоновая смесь направляют на регенерацию ацетона.

К ацетоновому порошку добавляют воды для инъекций при pН 7,0. Затем вносят сериновую эндопротеазу, до конечной концентрации 0,3%. После внесения фермента раствор нагревают при постоянном перемешивании до +65°С в течение 3 часов. Затем температуру реакционной массы увеличивают до +90°С и выдерживают в течение 30 минут для инактивации фермента.

После окончания ферментативного гидролиза реакционную смесь охлаждают до комнатной температуры и подают на сепаратор для удаления твердой фазы. Режим сепарирования при 2000-3000 об/мин. Полученный фильтрат собирают и передают на стадию стерилизующей фильтрации.

Процессы стадии стерилизующей фильтрации осуществляют в помещении класса чистоты В. Санитарный статус фильтра для стерилизующей фильтрации предел отсечения 0,2 мкм. Фильтродержатель вместе с фильтром подвергают стерилизации на стерилизаторе температура стерилизации +134°С. Стерильный раствор разливают в предварительно подготовленные стерильные поддоны и передают на стадию лиофильной сушки. Процессы стадии осуществляются в помещении класса чистоты В с локальной зоной А в зоне загрузки/выгрузки сушки. Процесс производства осуществляют на лиофильной сушке в автоматическом режиме.

Высушенный готовый продукт представляет собой хорошо сформированный порошок белого или желтовато-белого цвета, потери в массе при высушивании не должны превышать 10%. Выход готового продукта составляет 0,587 кг сухого лиофилизированного порошка.

Высушенный готовый продукт упаковывается в первичную упаковку и передается в помещение для хранения, где маркируется и временно хранится в холодильнике.

Далее проводят контроль параметров полученного продукта:

Полученный заявляемым способом целевой продукт был проверен на специфическую активность. Специфическую активность продукта оценивают по влиянию на процесс восстановление активности щелочной фосфатазы ингибированной цистеином. Повышение активности щелочной фосфатазы при различных заболеваниях и патологических процессах следует рассматривать как проявление защитно-приспособительных процессов, которые имеют исключительно важное значение в развитии, течении и исходе болезни Шубин М.Г., Нагоев Б.С. Щелочная фосфатаза лейкоцитов в норме и патологии. - М.: Медицина, 1980., 223 с.)

В пробирки при температуре (20±1)°С разливают компоненты реакционной смеси (общий объем 3 мл) в последовательности и объемах, описанных в таблице. На определение берут 0,3 мл испытуемого раствора, прибавляют раствор щелочной фосфатазы и через 5 мин останавливают реакцию 1 мл 2 М раствором гидроксида натрия, содержащего этилендиаминтетраацетат. Измеряют оптическую плотность растворов на спектрофотометре при длине волны 405 нм против соответствующего контроля (без щелочной фосфатазы) в кювете с толщиной слоя 10 мм.

Влияние препарата на восстановление активности щелочной фосфатазы выражают в процентах.

Выявлено, что продукт, полученный заявленным способом, обладает выраженной специфической активностью - процент восстановления активности щелочной фосфатазы достоверно превышали 13%.

Представленные в таблице 3 данные демонстрируют, что полученный заявленным способом целевой продукт имеет аналогичные качественные и количественные характеристики, а по некоторым параметрам заявленный продукт превосходит известный.

Таким образом, целевой продукт, полученный предлагаемым способом, соответствует всем параметрам фармацевтического продукта - субстанции.

Сравнение показателей качества продуктов, полученных известным и заявленным способами

Способ получения комплекса биологически активных пептидов из предстательной железы убойных животных, бычков или быков, включающий операции измельчения и гомогенизации замороженной ткани, экстракции гомогената раствором кислоты уксусной, обработки надосадочной жидкости ацетоном, промывки образовавшегося осадка ацетоном, высушивания осадка, экстракции пептидов из высушенного порошка водой для инъекций, отличающийся тем, что экстракцию гомогената проводят раствором 3% кислоты уксусной, содержащим хлористый цинк в концентрации 1,2 г/л, на стадии экстракции пептидов, из высушенного порошка, добавляют фермент - сериновую эндопротеазу до концентрации 0,3%, выдерживают при температуре 65°C при постоянном перемешивании в течение 3 часов, инактивируют фермент при температуре 90°C в течение 30 минут, охлаждают до комнатной температуры, сепарируют или фильтруют и лиофилизируют.



 

Похожие патенты:

Группа изобретений относится к медицине. Описан формованный пластинчатый продукт из полимерной композиции, включающий по меньшей мере один белок, выбранный из группы, состоящей из фибриногена и тромбина, и по меньшей мере один полимер, выбранный из группы, состоящей из алифатического полиэфира и водорастворимого полимера; и ламинированный формованный пластинчатый продукт, содержащий первый слой полимерной композиции, состоящий из фибриногена и водорастворимого полимера, и второй слой полимерной композиции, состоящий из тромбина и алифатического полиэфира.

Изобретение относится к области биохимии. Описана группа изобретений, включающая гликозилированный полипептид, обладающий активностью интерферона β и имеющий лучшее удерживание в крови по сравнению с природным человеческим интерфероном β (варианты), и фармацевтическая композиция, содержащая вышеуказанный гликозилированный полипептид.

Изобретение относится к области биохимии и биотехнологии, в частности к модифицированному молозивному белку. Указанный белок применяется для повышения иммунной реакции у животного и имеет аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO.: 1.

Изобретение относится к области биохимии, в частности к средству для применения при индукции толерантности при пероральном введении к белкам коровьего молока у млекопитающих.

Изобретение относится к медицине и касается способа защиты синтетических пептидов от разрушения пептидазами, заключающегося в том, что на обоих концах пептида помещают остатки бета-аланина.

Настоящее изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к рекомбинантному получению слитого белка, состоящего из иммунорегуляторного белка гандермы и человеческого сывороточного альбумина (HSA), и может быть использовано в медицине для лечения лейкопении и как противоопухолевое средство.

Группа изобретений относится к области медицины, а именно к иммунологии, и предназначена для лечения аутоиммунных расстройств. Элюирующая матрица, пригодная для имплантации в организм субъекта, включает как минимум одну клетку, экспрессирующую белок.
Изобретение относится к биомедицине, а именно к повышению температурной стабильности желатина при изготовлении клеточных продуктов. Способ повышения термостойкости желатина при модификации его дигидрокверцетином, включающий смешивание 20% раствора желатина с 10% раствором дигидрокверцетина, приготовленных на изотоническом растворе NaCl, взятые в объемном соотношении растворов 9:1, далее смесь помещают в чашку Петри на 30 минут при температуре 4°С.
Изобретение относится к биомедицине, а именно к повышению температурной стабильности желатина при изготовлении клеточных продуктов. Способ повышения термостойкости желатина при модификации его смесью дигидрокверцетина и арабиногалактана, включающий смешивание 20% раствора желатина с 10% раствором дигидрокверцетина и арабиногалактана, при весовом соотношении дигидрокверцетина и арабиногалактана 1:3, при этом растворы приготовлены на изотоническом растворе NaCl и смешаны в объемном соотношении растворов 9:1, далее смесь помещают в чашку Петри на 30 минут при температуре 22°С и влажности воздуха 55-75%.

Изобретение относится к области генной инженерии, конкретно к рекомбинантному получению антиангиогенных белков, и может быть использовано в медицине. Сконструирована рекомбинантная плазмидная ДНК pERIG-PGS, обеспечивающая синтез в клетках Escherichia coli гибридного белка GyrA-PGS, содержащего модифицированный мини-интеин Мхе GyrA и антиангиогенный пептид Пигастин - производное фрагмента [44-77] фактора роста пигментного эпителия человека с присоединенной к С-концу последовательностью Pro-Gly-Pro.

Изобретение относится к области ветеринарной медицины, в частности к получению биологически активных препаратов для стимуляции половой функции у самок домашних животных.

Изобретение относится к области ветеринарии и предназначено для коррекции функциональной активности яичников при их гипофункции у коров. Способ включает обработку животных препаратом натуральных половых феромонов быка, который распыляют на носовое зеркало животных в дозе 0,5 мл/гол.

Изобретение относится к фармацевтической промышленности, а именно к способу получения из тканей человека белкового экстракта, обогащенного сфингомиелинсинтазой 1.
Изобретение относится к фармацевтической промышленности, а именно к способу получения средства для восстановления функции предстательной железы. Способ получения средства для восстановления функции предстательной железы, включающий измельчение животной ткани предстательной железы забойных быков и/или бычков, достигших половой зрелости, выдерживание в водном растворе уксусной кислоты и хлористого цинка, после экстракции в водный раствор добавляют ацетон, удаляют балластные белки и жмых сепарированием, добавляют ацетон, водно-ацетоновую смесь перемешивают и отстаивают, осветленную жидкость сливают и фильтруют с отделением сырца, сырец сушат, растирают и просеивают при определенных условиях.

Изобретение относится к медицине, а именно к кардиологии, и может быть использовано в ходе проведения гемодинамической коррекции врожденных пороков сердца у больных с функционально единственным желудочком сердца.
Изобретение относится к животноводству и ветеринарии. .
Изобретение относится к области фармацевтики, касается мази для лечения рубцов путем наружного применения на теле пациента. .
Изобретение относится к медицине и может быть использовано для лечения псориаза, простатита и обусловленных простатитом половых расстройств. .
Изобретение относится к косметологии, бальнеологии, фармацевтике или пищевой промышленности. .
Изобретение относится к медицине, а именно к технологии получения препаратов, используемых в косметике и бальнеологии. .

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к вариантам исходного альбумина, что может быть использовано в медицине. Получают полипептид, который является вариантом альбумина или его фрагментом, где этот полипептид содержит изменения в двух или более положениях, выбранных из положений: (а) 492 и 580; (b) 492 и 574; (с) 492 и 550; (d) 550 и 573; (e) 550 и 574; (f) 550 и 580 в SEQ ID NO: 2, и не содержит мутаций E492G+K573P, E492G+K573A или E492G+N503K, а также получают слитые с ним полипептиды, полинуклеотиды, кодирующие эти варианты, конъюгаты, ассоциаты и наночастицы с ним, композиции, векторы, клетки-хозяева, содержащие эти полинуклеотиды, и способы использования этих вариантов. Изобретение позволяет получить варианты альбумина, имеющие увеличенный период полужизни в плазме и увеличенную аффинность связывания с FcRn в сравнении с исходным альбумином. 30 н. и 50 з.п. ф-лы, 4 ил., 27 табл., 5 пр.

Изобретение относится к химико-фармацевтической промышленности и представляет собой способ получения комплекса биологически активных пептидов из предстательной железы убойных животных, бычков или быков, включающий операции измельчения и гомогенизации замороженной ткани, экстракции гомогената раствором кислоты уксусной, обработки надосадочной жидкости ацетоном, промывки образовавшегося осадка ацетоном, высушивания осадка, экстракции пептидов из высушенного порошка водой для инъекций, отличающийся тем, что экстракцию гомогената проводят раствором 3 кислоты уксусной, содержащим хлористый цинк в концентрации 1,2 гл, на стадии экстракции пептидов, из высушенного порошка, добавляют фермент - сериновую эндопротеазу до концентрации 0,3, выдерживают при температуре 65°C при постоянном перемешивании в течение 3 часов, инактивируют фермент при температуре 90°C в течение 30 минут, охлаждают до комнатной температуры, сепарируют или фильтруют и лиофилизируют. Изобретение позволяет увеличить выход и качество целевого продукта. 3 табл., 3 пр.

Наверх