Способ измерения концентрации аналита в плазме крови

Изобретение относится к области исследования и анализа материалов, а именно к способам измерения параметров наночастиц, взвешенных в жидкости, оптическими методами, и может быть использовано для определения концентрации аналита в плазме крови. Способ состоит из подготовки исходного коллоидного раствора металлических вытянутых наночастиц-зондов, длина наностержня которых превышает ширину не менее чем в 3 раза, на поверхности нанозондов закреплены молекулы-рецепторы, селективно связывающиеся с молекулами аналита; измерения с помощью лазерного корреляционного спектрометра автокорреляционной функции gVH0(τ) исходного раствора в диапазоне значений времен задержки τ от 1 мкс до 10 мс для компоненты рассеянного излучения; вычисления исходного гидродинамического радиуса RH0; добавления к исходному раствору исследуемого образца плазмы крови и инкубации полученного раствора при заданной температуре; измерения аналогичным образом автокорреляционной функции gVH1(τ) и вычисления гидродинамического радиуса RH1 для полученного раствора; определения концентрации искомого аналита в плазме крови по разности значений RH0 и RH1. Технический результат заключается в возможности получать максимально точные значения концентрации аналита для образцов слаборазбавленной или неразбавленной плазмы крови. 1 з.п. ф-лы, 1 ил., 1 табл.

 

Изобретение относится к области исследования и анализа материалов, а именно, к способам измерения параметров наночастиц, взвешенных в жидкости, оптическими методами и может быть использовано для определения концентрации аналита, в том числе маркеров различных заболеваний, в плазме крови.

В последнее время интенсивно разрабатываются средства медицинской диагностики, основанные на эффекте агрегации наночастиц, используемых в качестве зондов. Подобный зонд представляет собой наночастицу, во многих случаях золотую, функционализированную биологическими рецепторами, например, антителами к определенным маркерам заболеваний, зонды помещаются в биологическую жидкость, например, в плазму или сыворотку крови. При наличии в этой жидкости молекул аналита происходит их связывание с молекулами-рецепторами, находящимися на поверхности функционализированных наночастиц, что приводит к их агрегации. В результате существенно увеличивается средний гидродинамический диаметр частиц в коллоидной системе и меняется распределение частиц по размерам. Эти изменения измеряются оптическими методами - по спектрам плазмонного резонанса или с помощью динамического рассеяния света.

Из уровня техники известен способ измерения количества аналита в исходном растворе, заключающийся в добавлении в раствор металлических наночастиц-зондов, облучении полученного раствора лазерным излучением, измерении автокорреляционной функции (АКФ) интенсивности рассеянного излучения, из которой путем решения обратной задачи рассеяния получают средний гидродинамический радиус наночастиц и их распределение по размерам. На основе этого распределения рассчитывают концентрацию аналита в анализируемой жидкости (см. патент US 8883094, кл. G01N 15/02, опубл. 11.11.2010). При использовании указанного метода для измерений размеров наночастиц и последующих их распределений по размерам требуется, чтобы рассеяние на исследуемых объектах не менее чем на порядок превышало рассеяние на других нано- или микрообъектах, находящихся в образце. Для целей медицинской диагностики - определения содержание аналитов-маркеров заболеваний в плазме крови, с помощью указанного метода требуется либо существенного разбавлять плазму, либо увеличивать концентрацию добавляемых частиц. Такие подходы во многих случаях крайне нежелательны, поскольку эффекты образования белковых оболочек и агрегации существенно зависят как от свойств плазмы, которые изменяются при разбавлении, так и от концентрации наночастиц.

Возможны различные подходы к выделению вклада наночастиц в рассеяние света на фоне других рассеивающих объектов. Если требуется исследовать оптически анизотропные частицы на фоне оптически изотропных, то можно использовать эффекты, возникающие при рассеянии поляризованного лазерного излучения. Когда возбуждающее излучение имеет линейную поляризацию, например в вертикальной плоскости (V), то в излучении, рассеянном на оптически анизотропных частицах, можно выделить составляющую VV, поляризация которой совпадает с поляризацией возбуждающего излучения (кополяризационную), и перпендикулярную ей составляющую VH (кросс-поляризационную). Метод анализа, использующий VH, получил название деполяризованного динамичесого рассеяния света и до последнего времени применялся главным образом для измерения размерных параметров несферических наночастиц (см. Шмыткова Е.А., Возможности метода деполяризованного динамического рассеяния света для определения геометрических параметров несферических наночастиц // Метрология. 2013. №10. С. 16-21). У оптически изотропных частиц составляющая VH отсутствует, поэтому АКФ этой состаляющей gVH(τ) содержит информацию только об анизотропных частицах. Таким образом, регистрация этой составляющей позволяет определить размерные параметры анизотропных частиц, минимизировав влияние рассеянного излучения изотропного фона. Такой подход, основанный на применении деполяризованного динамического рассеяния, был предложен в работе (Balog S., Rodriguez-Lorenzo L., Monnier С.A. Obiols-Rabasa M., Rothen-Rutishauser В., Schurtenberger P., Petri-Fink A., Characterizing nanoparticles in complex biological media and physiological fluids with depolarized dynamic light scattering // Nanoscale. 2015. V. 7. P. 5991-5997) и апробирован путем измерения размеров сферических золотых наночастиц, добавляемых в искусственно приготовленные смеси. Указанные смеси содержали частицы биологического происхождения - бычий сывороточный альбумин, клеточные культуры и др.

Технической проблемой является разработка способа измерения, позволяющего с высокой точностью определять концентрацию аналита даже в неразбавленной плазме крови. Поставленная проблема решается тем, что согласно способу измерения концентрации аналита в плазме крови, выполняют следующие последовательные операции: подготавливают исходный коллоидный раствор металлических вытянутых наночастиц-зондов, на поверхности которых закреплены молекулы-рецепторы, селективно связывающиеся с молекулами аналита, а длина наностержня превышает ширину не менее, чем в 3 раза; с помощью лазерного корреляционного спектрометра для исходного раствора измеряют АКФ gVH0(τ) в диапазоне значений времен задержки τ от 1 мкс до 10 мс для компоненты рассеянного излучения, линейная поляризация которой перпендикулярна поляризации лазерного излучения, возбуждающего рассеяние; вычисляют исходный гидродинамический радиус RH0 путем решения обратной задачи деполяризованного динамического рассеяния на основе уравнения

где β - фактор когерентности лазерного корреляционного спектрометра, k - постоянная Больцмана, Т - абсолютная температура, η - коэффициент вязкости, q=4πnsim(θ/2)/λ0 - модуль волнового вектора рассеяния, n - показатель преломления, λ0 - длина волны лазерного излучения в вакууме, θ - угол рассеяния;

затем добавляют к исходному раствору исследуемый образец плазмы крови и инкубируют полученный раствор при заданной температуре. Аналогичным образом измеряют автокорреляционную функцию gVH1(τ) и вычисляют гидродинамический радиус RH1 для полученного раствора; по разности значений RH0 и RH1 определяют концентрацию искомого аналита в плазме крови.

На чертеже приведены АКФ золотых наностержней, зарегистрированные в водном растворе (пунктирная линия) и в неразбавленной плазме крови (сплошная линия).

В ходе разработки предлагаемого способа были проведены эксперименты с наночастицами различной конфигурации, которые могут быть использованы в качестве зондов. В результате этих экспериментов было выявлено, что наиболее перспективными с точки зрения использования совместно с методом деполяризованного динамического рассеяния света являются металлические, в частности, золотые наночастицы-зонды, длина которых превышает ширину не менее, чем в 3 раза. Было показано, что именно такая геометрия позволяет обеспечить значительно более высокую анизотропию рассеяния, и, соответственно, более интенсивную составляющую VH, что, в конечном счете, положительным образом влияет на точность измерений.

При исследованиях использовали пулированную (смешенную) плазму крови, полученную от нескольких условно здоровых доноров. В качестве антикоагулянта применяли 3,8%-й раствор цитрата натрия. В плазму добавляли наночастицы-зонды золота, имеющие форму наностержней длиной 40-100 нм и диаметром 10-25 нм. АКФ gVH(τ) в диапазоне значений времен задержки τ от 1 мкс до 10 мс измеряли с помощью лазерного корреляционного спектрометра АРН-2 (производства ФГУП «ВНИИОФИ»), для составляющих VV и VH рассеянного излучения при угле рассеяния 90°. В качестве источника линейно-поляризованного излучения был задействован гелий-неоновый лазер мощностью 21 мВт, выделение указанных составляющих осуществлялось с помощью призмы Глана-Томпсона в канале сбора рассеянного излучения. Для точного определения слабой составляющей VH были учтены темновой ток фотоприемника, а также фоновые засветки, обусловленные деполяризованным рассеянием на стенках кюветы, на жидкости, в которой взвешены частицы, и на элементах оптической схемы прибора. Коллоиды указанных наночастиц-зондов в количестве 600 мкл добавляли в 2400 мкл неразбавленной плазмы крови.

В таблице 1 приведены значения компонент VV и VH скорости счета фотонов, пропорциональной интенсивности рассеянного излучения, для чистой неразбавленной плазмы и плазмы с различными добавлениями золотых наносфер и золотых наностержней.

Все значения скоростей счета приведены в таблице после вычитания темнового тока фотоприемника (3300 импульсов в секунду).

Из данных, приведенных в таблице 1, следует:

- для ко-поляризационной компоненты VV, используемой в обычном ДРС, рассеяние добавляемыми в неразбавленную плазму наночастицами мало различимо на фоне рассеяния частицами плазмы;

- кросс-поляризационная компонента VH для чистой неразбавленной плазмы находится на уровне фоновых засветок, в то время, как для золотых наносфер и особенно золотых наностержней, добавляемых в такую плазму, получаются значимые значения скоростей счета.

Таким образом, для измерения размерных параметров золотых наночастиц в неразбавленной плазме крови целесообразно использовать кросс-поляризационную компоненту VH рассеянного излучения. У наносфер значение этой компоненты недостаточно для получения приемлемого качества АКФ, поэтому предпочтительнее проводить измерение с золотыми наностержнями, имеющими большую анизотропию рассеяния, и, соответственно, более интенсивную компоненту VH.

Вид АКФ, а, следовательно, и размера частиц изменяется в результате взаимодействия наностержней золота с плазмой (см. фиг.).

Нормированная АКФ кросс-поляризационной составляющей интенсивности рассеянного излучения gVH(τ) связана с коэффициентами трансляционной и ротационной диффузии наночастиц (Dт и Dр соответственно) выражением

где β - фактор когерентности лазерного корреляционного спектрометра, т.е. коэффициент, зависящий от оптической схемы установки; q=4πnsin(θ/2)/λ0 - модуль волнового вектора рассеяния, n - показатель преломления жидкости, в которой взвешены наночастицы, λ0 - длина волны лазерного излучения в вакууме, θ - угол рассеяния.

Экспериментально зарегистрированная gVH(τ) позволяет по формуле (1) определить эквивалентный гидродинамический радиус наночастиц Rн, т.е. радиус сферических частиц, имеющих такие же коэффициенты трансляционной и ротационной диффузии, что и исследуемые наностержни. Для этого необходимо использовать формулы для коэффициентов трансляционной и ротационной диффузии:

где k - постоянная Больцмана; Т - абсолютная температура; η - коэффициент вязкости раствора.

Окончательно гидродинамический радиус RH может быть вычислен путем решения обратной задачи деполяризованного динамического рассеяния на основе уравнения

Определение концентрации аналита в плазме крови складывается из двух этапов. На первом этапе осуществляется построение градуировочного графика. С этой целью проводится измерение гидродинамических радиусов исходных наночастиц и наночастиц, прошедших взаимодействие с растворами аналитов известных концентраций ci (i - номер раствора с данной концентрацией), по результатам этих измерений строится график зависимости [RH1-RHo](c), где RH0 - гидродинамический радиус наночастиц до взаимодействия с аналитом, RH1 - после взаимодействия. Затем полученная зависимость аппроксимируется линейным или квадратичным полиномом. На втором этапе проводится измерение гидродинамического радиуса наночастиц RH1x после взаимодействия с раствором с неизвестной концентрацией аналита Сх. По измеренному значению RH1x определяют с помощью градуировочной зависимости, построение которой было описано выше, значение концентрации аналита в растворе.

Благодаря использованию наночастиц-зондов и вычислению гидродинамического радиуса по кросс-корреляционной компоненте рассеянного излучения с помощью указанного математического выражения, предлагаемый способ позволяет даже для образцов слабо разбавленной или неразбавленной плазмы крови получать максимально точные значения концентрации аналита.

Пример.

Предлагаемый способ был реализован путем выполнения следующих последовательных операций:

- подготовили исходный коллоидный раствор наностержней золота длиной 63-79 нм и диаметром 19-25 нм (коллоидный раствор производства фирмы Alfa Asear, Великобритания);

- с помощью спектрометра АРН-2 для исходного раствора измерили нормированную автокорреляционную функцию gVH0(τ) для кросс-поляризованной компоненты рассеянного излучения;

- вычислили исходный гидродинамический радиус RH0=18 нм… путем решения обратной задачи деполяризованного динамического рассеяния на основе вышеприведенного уравнения (3);

- добавили к исходному раствору исследуемый образец неразбавленной плазмы крови, встряхнули и выдерживали полученный раствор при комнатной температуре (25°С) в течение 10 минут;

- аналогичным образом измерили автокорреляционную функцию gVH1(τ) и вычислили гидродинамический радиус RH1=28 нм для раствора наночастиц, прошедшего выдержку в плазме;

Проведенные эксперименты показывают возможность определять изменение гидродинамических радиусов наночастиц - зондов в неразбавленной плазме крови. Такие измерения оказались возможными благодаря использованию отличительных признаков изобретения - наночастиц-зондов в форме наностержней, длина которых превышает ширину не менее, чем в 3 раза, и кросс-корреляционной компоненты VH интенсивности рассеянного излучения для определения изменений гидродинамического диаметра наночастиц, обусловленного взаимодействием с аналитами.

1. Способ измерения концентрации аналита в плазме крови, согласно которому выполняют следующие последовательные операции:

- подготавливают исходный коллоидный раствор металлических вытянутых наночастиц-зондов, на поверхности которых закреплены молекулы-рецепторы, селективно связывающиеся с молекулами аналита, а длина наностержня превышает ширину не менее чем в 3 раза;

- с помощью лазерного корреляционного спектрометра для исходного раствора измеряют автокорреляционную функцию gVH0(τ) в диапазоне значений времен задержки τ от 1 мкс до 10 мс для компоненты рассеянного излучения, линейная поляризация которой перпендикулярна поляризации лазерного излучения, возбуждающего рассеяние;

- вычисляют исходный гидродинамический радиус RH0 путем решения обратной задачи деполяризованного динамического рассеяния на основе уравнения

где β - фактор когерентности лазерного корреляционного спектрометра,

k - постоянная Больцмана,

Т - абсолютная температура,

η - коэффициент вязкости,

q=4πnsin(θ/2)/λ0 - модуль волнового вектора рассеяния,

n - показатель преломления,

λ0 - длина волны лазерного излучения в вакууме,

θ - угол рассеяния;

- добавляют к исходному раствору исследуемый образец плазмы крови и инкубируют полученный раствор при заданной температуре;

- аналогичным образом измеряют автокорреляционную функцию gVH1(τ) и вычисляют гидродинамический радиус RH1 для полученного раствора;

- по разности значений RH0 и RH1 определяют концентрацию искомого аналита в плазме крови.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что в качестве наночастиц-зондов используют наностержни золота длиной 40-100 нм и диаметром 10-25 нм.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к медицине и предназначено для прогнозирования развития некроза кишки у больных с острой мезентериальной ишемией. В венозной крови определяют содержание общих и цитотоксических лимфоцитов у больных, рассчитывают интегральные показатели общих лимфоцитов (P1) и цитотоксических лимфоцитов (Р2) по отношению их содержания у больного к среднему значению у здоровых лиц, вычисляют прогностический индекс (К) по отношению интегрального показателя (P1) к интегральному показателю (Р2) и при значениях коэффициента меньше 0,5 прогнозируют развитие некроза кишечника.

Изобретение относится к медицине, а именно к сосудистой хирургии, и касается оценки реперфузионного повреждения сосудистой стенки в эксперименте. Для этого проводят оценку окислительной модификации белков сосудистой стенки и при определении кетон-динитрофенилгидразонов диагностируют реперфузионное поражение сосудистой стенки.

Изобретение относится к области медицины, а именно к кардиологии и генетике, и представляет собой способ диагностики многососудистого атеросклеротического поражения коронарных артерий у больных ишемической болезнью сердца при абдоминальном ожирении; согласно изобретению определяют уровень экспрессии гена микроРНК-203 в сыворотке крови и при уровне экспрессии гена микроРНК-203, равном или более 101,00 условной единице экспрессии, диагностируют многососудистое атеросклеротическое поражение коронарных артерий.

Изобретение относится к области медицины, в частности к способу прогнозирования индивидуального риска развития ожирения у человека на различные по продолжительности периоды жизни.

Изобретение относится к области медицины, а именно фармакологии и токсикологии, и может быть использовано для определения 8-(трифторметил)бензо[f][1,2,3,4,5]пентатиепин-6-амина гидрохлорида в биологических средах.

Группа изобретений относится к медицине и может быть использована для получения, разделения и исследования компонентов биологических жидкостей. Для этого первоначально в биологическую жидкость вводят не более одного реагента.

Изобретение относится к экспериментальной медицине и касается прогнозирования развития нефрита в индуцированной модели системной красной волчанки (СКВ). Способ заключается в том, что здоровым самкам мышам-гибридам (C57BL/6хDBA2)F1 внутрибрюшинно вводят липополисахарид в дозе 0,5 мкг/кг.

Предложенная группа изобретений относится к области медицины, в частности акушерству и медицинской генетике. Предложены способы определения источника анеуплоидных клеток по крови беременной женщины.

Изобретение относится к медицине, а именно к пульмонологии и токсикологии. На территории по среднесуточному содержанию мелкодисперсной пыли, в 1,6 и более раз превышающему предельно-допустимую концентрацию, выявляют детей с рецидивирующим бронхитом.

Изобретение относится к измерительной емкости, которая предназначена для циркуляции газа, анализируемого методом спектрометрии. Емкость выполнена в виде полой трубки (20), снабженной отражающим материалом, образующим отражающий оптический слой.

Изобретение относится к измерительной технике, а именно к технике измерения физической температуры объекта по температурным изменениям его оптических постоянных, и может быть использовано для дистанционного измерения температуры объекта в промышленности, медицине, биологии, в физических исследованиях и др.

Изобретение относится к области оптико-физических измерений и касается способа неразрушающего контроля качества теплового контакта термоэлектрического модуля. Контроль осуществляется путем определения наличия/отсутствия воздушных полостей в его структуре методом спектроскопической эллипсометрии.

Изобретение относится к области оптико-физических измерений и касается способа неразрушающего контроля качества теплового контакта термоэлектрического модуля. Контроль осуществляется путем определения наличия/отсутствия воздушных полостей в его структуре методом спектроскопической эллипсометрии.

Изобретение относится к области анализа материалов, тонкопленочных структур и поверхностей с помощью оптических средств. Эллипсометр включает последовательно расположенные вдоль оптической оси источник излучения, плечо поляризатора и плечо анализатора.

Изобретение относится к области оптических измерений и касается способа и устройства идентификации покрытого прозрачным слоем объекта. Идентификация объекта осуществляется посредством определения свойства поверхности с помощью оптической системы, которая содержит поляризационную камеру, выполненную с возможностью получения изображений с высоким разрешением и соединенную с устройством обработки и хранения данных.

Изобретение относится к области экологического мониторинга и может быть использовано для обнаружения нефтяных разливов. Способ обнаружения разливов нефти или нефтепродуктов на поверхности водоема заключается в установке тепловизора на беспилотный летательный аппарат, располагаемый в зависшем состоянии над зоной разлива, тепловизор осуществляет съемку в виде ряда цифровых изображений, которые через приемно-передающее устройство беспилотного летательного аппарата передаются в режиме реального времени на пункт круглосуточного дистанционного наблюдения, где оцениваются параметры разлива нефти или нефтепродуктов.

Изобретение относится к области оптических измерений и может быть использовано для полного определения состояния поляризации света, отраженного от поверхности исследуемого образца.
Изобретение относится к области контроля качества высококлассных поверхностей. В заявляемом способе в качестве разряда используют поверхностный диэлектрический барьерный разряд, локализованный на поверхности одного из двух электродов, одновременно служащего столиком для исследуемого образца материала; диэлектрический барьер выполняют бездефектным и тщательно отполированным, повторяющим конфигурацию поверхности исследуемого образца, плотно прижимают к нему образец, затем приводят в соприкосновение с образцом заостренный конец второго электрода, выполненного в виде стержня из низкокоррозионного проводящего электрический ток материала; подключают питающее напряжение переменного электрического тока, при этом электрическую прочность диэлектрического барьера выбирают превышающей максимальное напряжение источника электрического питания более чем в два раза; для принятия решения о пригодности поверхности твердых материалов используют появляющееся на поверхности исследуемого образца в местах расположения дефектов слабое голубое свечение плазмы воздуха в виде ярких светящихся голубых точек; исследуемую поверхность признают пригодной при полном отсутствии светящихся голубых точек.

Изобретение относится к медицине, а именно к кардиологии, и может быть использовано для экспресс-диагностики резистентности и чувствительности к ацетилсалициловой кислоте (АСК).

Изобретение относится к области магнитных и магнитооптических измерений. Способ заключается в том, что исследуемый образец освещают линейно поляризованным световым пучком и измеряют изменение поляризации при отражении, используя разделение отраженного луча на p- и s-компоненты с разложением по амплитуде и фазе, получая на выходе четыре световых пучка.

Изобретение относится к методам дисперсного анализа радиоактивных аэрозолей, поступающих в организм человека с вдыхаемым воздухом. Способ включает разделение аэрозольных частиц, содержащихся в анализируемом газовом потоке, на размерные фракции путем прокачки газового потока через однокаскадный инерционный разделитель при различных величинах расхода, осаждение аэрозольных частиц на фильтр, измерение альфа-активности осажденных на фильтре аэрозольных частиц для каждой выделенной размерной фракции в течение равных промежутков времени, обработку результатов измерений и определение параметров дисперсного состава радиоактивных аэрозолей на основании обработанных результатов измерений, разделение аэрозольных частиц по меньшей мере на четыре размерные фракции путем последовательного пошагового изменения расхода прокачиваемого через однокаскадный инерционный разделитель газового потока, при каждом фиксированном значении расхода газового потока, количество которых равно по меньшей мере четырем, аэрозольные частицы осаждают на фильтр, расположенный в камере детектирования, в которую подают газовый поток с выхода однокаскадного инерционного разделителя, измерение альфа-активности осажденных на фильтре аэрозольных частиц с помощью спектрометра, детектор которого установлен в камере детектирования, для размерных фракций, выделенных при фиксированных значениях расхода газового потока, установление зависимости измеренных значений альфа-активности от размера аэрозольных частиц путем последовательного сравнения величин альфа-активности на каждом шаге измерений с величиной активности на предыдущем шаге измерений при предыдущем значении расхода газового потока, на основании полученной зависимости определяют параметры дисперсного состава радиоактивного аэрозоля.

Изобретение относится к области исследования и анализа материалов, а именно к способам измерения параметров наночастиц, взвешенных в жидкости, оптическими методами, и может быть использовано для определения концентрации аналита в плазме крови. Способ состоит из подготовки исходного коллоидного раствора металлических вытянутых наночастиц-зондов, длина наностержня которых превышает ширину не менее чем в 3 раза, на поверхности нанозондов закреплены молекулы-рецепторы, селективно связывающиеся с молекулами аналита; измерения с помощью лазерного корреляционного спектрометра автокорреляционной функции gVH0 исходного раствора в диапазоне значений времен задержки τ от 1 мкс до 10 мс для компоненты рассеянного излучения; вычисления исходного гидродинамического радиуса RH0; добавления к исходному раствору исследуемого образца плазмы крови и инкубации полученного раствора при заданной температуре; измерения аналогичным образом автокорреляционной функции gVH1 и вычисления гидродинамического радиуса RH1 для полученного раствора; определения концентрации искомого аналита в плазме крови по разности значений RH0 и RH1. Технический результат заключается в возможности получать максимально точные значения концентрации аналита для образцов слаборазбавленной или неразбавленной плазмы крови. 1 з.п. ф-лы, 1 ил., 1 табл.

Наверх