Рекомбинантная плазмидная днк pet21-npve, содержащая ген нуклеопротеина (np) вируса эбола и рекомбинантный белок np-вэ, полученный в результате экспрессии гена np вируса эбола с использованием рекомбинантной плазмидной днк pet21-npve и обладающий иммуногенными и антигенными свойствами

Изобретение относится к области биотехнологии. Изобретение представляет собой рекомбинантную плазмидную ДНК pET21-NPVE предназначенную для экспрессии гена нуклеопротеина NP вируса Эбола (штамм Zaire, изолят Mayinga) в прокариотической системе E.coli и получения рекомбинантного белка NP-ВЭ, имеет размер 7593 п.н. и содержит в своем составе: ген bla (координаты с 599 по 1459 п.н.) в качестве генетического маркера; участок начала репликации ori (координаты с 1630 по 2218 п.н.); промотор фага T7 (координаты с 5117 по 5135 п.н.; лактозный репрессор (координаты с 3648 п.н. по 4730 п.н.); ДНК-связывающий белок, который ингибирует экспрессию генов E.coli и обеспечивает экспрессию целевого рекомбинантного белка NP-ВЭ после добавления индуктора изопропил-β-D-1-тиогалактопиранозида (IPTG); уникальные сайты узнавания рестрикционными эндонуклеазами, имеющие следующие координаты: NheI (5209 п.н.) и XhoI (7432 п.н.); полноразмерный ген NP вируса Эбола (изолят Mayinga, штамм Zaire) 2217 п.н. (с 470 по 2686 нуклеотид геномной РНК), встроенный в экспрессионную кассету по сайтам рестрикции NheI (5209 п.н.) и XhoI (7432 п.н.), который кодирует 739 аминокислотных остатков (а.о.) вирусного нуклеопротеина; последовательность (18 п.н.), кодирующая полигистидиновый (6xHis) политракт из шести гистидинов на N-конце кодируемого белка для последующей очистки его с помощью метода аффинной Ni-хроматографии и рекомбинантный белок NP-ВЭ полученный в результате экспрессии гена нуклепротеина NP вируса Эбола (штамм Zaire, изолят Mayinga) в бактериальной системе экспрессии E.coli в составе рекомбинантной ДНК-конструкции pET21-NPVE, имеющий расчетную молекулярную массу 84457,42 Да, и аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1 длиной 748 а.о., включая 6xHis, и стоп-кодон, и обладающий иммуногенными и антигенными свойствами, и предназначенный для индукции в организме мышей линии Balb/c антител, узнающих в иммунохимических реакциях вирусный белок NP-ВЭ, а также взаимодействующий с мышиными моноклональными антителами, поликлональными козьими и человеческими антителами, специфичными к инактивированному и инфекционному вирусу, соответственно. Изобретение позволяет повысить выход целевого рекомбинантного белка NP-ВЭ. 2 н.п. ф-лы, 3 табл., 14 ил.

 

Изобретение относится к области медицины, биотехнологии и молекулярной биологии, в частности к ДНК-конструкции pET21-NPVE, содержащей ген NP вируса Эбола (штамм Zaire, изолят Mayinga) и рекомбинантному белку NP-ВЭ, обладающему иммуногенными и антигенными свойствами, т.к. вызывает в организме иммунизированных мышей линии Balb/c синтез антител, узнающих нативный белок нуклеопротеина NP в инактивированном препарате вируса Эбола в иммунохимических реакциях в формате ИФА и имунноблоттинга.

По классификации Национального центра биотехнологической информации, США (National Center for Biotechnological Information, NCBI) вирус Эбола (ВЭ) относится к семейству Filoviridae. На настоящее время известно пять штаммов ВЭ: Zaire ebolavirus (EBOV), Taï Forest ebolavirus (TAFV), Reston ebolavirus (RESTV), Sudan ebolavirus (SUDV) и Bundibugyo ebolavirus (BDBV) (Se-Ran Jun Michael R. Leuze, Intawat Nookaew, Edward C. Uberbacher et al./ Ebolavirus comparative genomics. / FEMS Microbiol Rev. 2015; 39(5): 764-778. Published online 2015 Jul 14.doi: 10.1093/femsre/fuv031). Штаммы ВЭ подразделяют на изоляты по географическому району и/или году выделения, например, Zaire ebolavirus: Ebola virus - Eckron (Zaire, 1976); Ebola virus - Gabon (1994-1997); Ebola virus - Mayinga, Zaire, 1976; Ebola virus - Zaire (1995); Zaire ebolavirus Makona (2014); Tai Forest virus: Cote d'Ivoire (1994); Reston ebolavirus: Reston (1989) u Siena/Philippine-92; Sudan ebolavirus: Yambio0401, 0402 и 0403, Maleo (1979), Nakisamata, Uganda (2000), Boniface (Sudan,1976) (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/Browser/wwwtax.cgi?id=186538).

Геномы филовирусов представлены несегментированной негативной одноцепочечной РНК и имеют длину приблизительно 19000 пар нуклеотидов, состоят из 7 расположенных по порядку генов: 3’ leader - NP - VP35 - VP40 - GP - VP30 - VP24 - L-5’ - trailer, кодирующих соответствующие структурные белки - нуклеопротеин (NP), кофактор вирусной полимеразы (VP35), матриксный (VP40), структурный гликопротеин оболочки (GP) и дополнительно только у ВЭ - секреторный (sGP), минорный нуклеопротеин (VP30), мембранно-ассоциированный (VP24) и РНК-зависимую РНК полимеразу (L) (Bukreyev A.А. Characteristics of Filoviridae: Marburg and Ebola Viruses. / Naturwissenschaften. 1999; 86:8-17).

ВЭ является этиологическим агентом болезни, вызванной вирусом Эбола (БВВЭ) с 90%-м уровнем летальности среди заболевших. Начавшуюся эпидемию БВВЭ в 2013 г. медицинские работники распознали не сразу, т.к. в это же время в Гвинее (где начались первые случаи заболевания), были зарегистрированы эпидемии холеры, кори и менингита (Арутюнов Ю.И., Москвитина Э.А., Ковалева Т.В. Болезнь, вызванная вирусом Эбола, и развитие эпидемии в странах Западной Африки (обзор). / Проблемы особо опасных инфекций. Выпуск №4. 2015. С. 5-9). В августе 2014 г. Всемирная Организация Здравоохранения (ВОЗ) объявила вспышку БВВЭ в Африке чрезвычайной ситуацией для международного общественного здравоохранения (Dixon M.G., Schafer I.J. Ebola viral disease outbreak - West Africa, 2014. MMWR. 2014; 63:548-51). За период 2013-2015 гг. в Гвинее, Сьерра-Леоне, Либерии и Нигерии из 28652 заболевших погибли 11325 человека (Reynard S., Journeaux A., Gloaguen E. et al. Immune parameters and outcomes during Ebola virus disease. / JCI Insight. 2019; 4(1). pii: 125106. doi: 10.1172/jci.insight.125106). В мае 2018 г., несмотря на вакцинацию 40000 человек местного населения экспериментальной вакциной rVSVΔG-ZEBOV-GP, разработанной в Германии (Medaglini D., Santoro F., Siegrist C.A. Correlates of vaccine-induced protective immunity against Ebola virus disease. / Semin Immunol. 2018; 39:65-72), в восточной части Демократической Республики Конго (ДРК, ранее называлась Заир) началась новая эпидемия БВВЭ. В настоящее время из-за гражданской войны в этой стране трудно оценить масштаб трагедии, в декабре 2018 г. было известно о 500 случаях заболевания, половина из которых закончились летально. Специалисты ВОЗ практически прекратили работу в данном регионе из-за угроз со стороны местного населения и вооруженных ополченцев. Cohen J. Worries about Ebola outbreak grow, despite use of vaccine. / Science. 2018; 362(6420):1225). На 24 марта 2019 г., по данным СDС (Centers for Disease Control and Prevention), количество случаев БВВЭ превысила 1000; включая 625 смертей и 318 выживших. И эта вспышка является крупнейшей в истории ДРК и второй по величине, зарегистрированной когда-либо (после вспышки 2014-2016 в Западной Африке) (https://www.cdc.gov/media/releases/2019/s0322-ebola-congo.html). В связи с этим может произойти неконтролируемое распространение ВЭ в другие страны с потоком беженцев. Как известно, ранее несколько медицинских работников и специалистов, которые работали в очаге эпидемии БВВЭ в 2014 г. и проходили все необходимые карантинные меры, вернулись домой, в Испанию и США, заболевшими (Selvaraj S.A., Lee K.E., Harrell M. et al. Infection Rates and Risk Factors for Infection Among Health Workers During Ebola and Marburg Virus Outbreaks: A Systematic Review. / J Infect Dis. 2018; 218(suppl_5):S679-S689).

ВЭ распространяется от человека к человеку через прямой контакт с биологическими жидкостями. Мультитропность ВЭ обуславливает его наличие во многих внутренних органах и выделение с биологическими жидкостями организма. По данным ВОЗ, самыми заразными являются кровь, кал и рвотные массы заболевших. Вирус выявляли в моче, слизи носоглотки, грудном молоке, сперме, вагинальном секрете, слюне, поте (инфекционный на культуре клеток или его РНК методом ОТ-ПЦР). Наличие крови в биологической жидкости усиливает вероятность инфицирования (Пакскина Н.Д.. Шиянова А.Е.. Дмитриева Л.Н. и др. Мероприятия в отношении лиц, контактировавших с больным лихорадкой Эбола. / Проблемы особо опасных инфекций. Выпуск №3. 2015. С. 33-38). Аэрозольный путь передачи ВЭ также возможен как было показано при исследовании на приматах (Пьянков О.В., Сергеев А.Н., Пьянкова О.Г. и др. Патологические изменения в организме приматов, аэрозольно инфицированных вирусом Эбола. / Межведомственная конференция «Изучение и профилактика особо опасных вирусных инфекций». Тезисы докладов. 7-8 апреля 1993 г, Кольцово; Johnson E., Jaax N., White J. et al. Lethal experimental infection of rhesus monkeys by aerosolized Ebola virus. / Int J. Exp Pathol. 1995; 76(4):227-236). Описаны случаи лабораторного инфицирования научных сотрудников - в Англии в 1976 г. (Emond R.T., Evans B., Bowen E.T., et al. A case of Ebola virus infection. / Br Med J. 1977; 2(6086):541-4) и России в 2004 г. (Чепурнов А.А., Шестопалова Л.В. Генетические и патофизиологические факторы вирулентности вируса Эбола. / Изд. «Наука - Центр», Новосибирск 2010. 150 с.).

Есть предположение, что вспышки БВВЭ среди людей начинаются после контакта с инфицированными животными (Leroy E.M., Telfer P., Kumulungui B. et al. A serological survey of Ebola virus infection in central African nonhuman primates. / J Infect Dis. 2004; 190(11):1895-9; Leroy E.M., Epelboin A., Mondonge V. et al. Human Ebola outbreak resulting from direct exposure to fruit bats in Luebo, Democratic Republic of Congo, 2007. / Vector Borne Zoonotic Dis. 2009; 9(6):723-8. doi: 10.1089/vbz.2008.0167). Экпериментально показана возможность инфицирования обычных домашних свиней препаратом ВЭ (штамм Zaire) (Kobinger G.P., Leung A., Neufeld J. et al. Replication, pathogenicity, shedding, and transmission of Zaire ebolavirus in pigs. / J Infect Dis. 2011; 204(2):200-8. doi: 10.1093/infdis/jir077) и передача вируса от этих животных яванским макакам (Weingartl H.M., Embury-Hyatt C., Nfon C. et al. Transmission of Ebola virus from pigs to non-human primates. Sci Rep. 2012; 2:811. doi: 10.1038/srep00811). Поэтому необходимы тест-системы и для эпидемиологического исследования сывороток крови различных видов диких и домашних животных (горилл, шимпанзе, дукеров (антилоп), рукокрылых (летучих мышей) и свиней).

Ранняя лабораторная диагностика имеет решающее значение для предотвращения распространения ВЭ. В сыворотке крови пациентов с диагнозом БВВЭ антиген ВЭ может быть обнаружен на третий день после начала заболевания и его концентрация достигает 10⁶-10⁸ вирусных частиц в миллилитре (Rowe A.K., Bertolli J., Mukunu R. et al. Clinical, virologic and immunologic follow up of convalescent Ebola haemorrhagic fever patients and their household contacts, Kikwit Democratic Republic of the Congo. / Infect. Dis, 1999; 179:28-35). За рубежом разработаны тест-системы по выявлению генетического материала ВЭ, т.е. РНК (методом полимеразной цепной реакции, ПЦР, а также его антигенов и специфических антител методами иммуноферментного анализа (ИФА) или иммунохроматографии (ИХА). Основные производители тест-систем США, Германия и Республика Корея (James A.S., Todd S., Pollak N.M. et al. Ebolavirus diagnosis made simple, comparable and faster than molecular detection methods: preparing for the future. / Virol J. 2018; 15(1):75). В обзоре (Broadhurst M.J., Brooks T.J., Pollock N.R. Diagnosis of Ebola Virus Disease: Past, Present, and Future. / Clin Microbiol Rev. 2016; 29(4):773-93. doi:10.1128/CMR.00003-16) описаны тест-системы, одобренные ВОЗ или FDA (Food and Drug Administration, Управление по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов США) для диагностики ГЛЭ. В ПЦР формата RT (в реальном времени) используются праймеры, специфичные к генам L, GP, NP и VP40 ВЭ. Два теста ИХА, выявляющие белок VP40, и один тест ИХА для одновременного выявления трех белков ВЭ - GP, NP и VP40.

В РФ зарегистрирован набор реагентов для определения РНК ВЭ (штамм Zaire) в биологическом материале методом ПЦР для диагностики in vitro «АмплиСенс® EBOV Zaire-FL» по ТУ 9398-232-01897593-2014», производства ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора. (http://doctorpiter.ru/articles/10390) и набор реагентов для амплификации кДНК ВЭ (штаммы Zaire и Sudan) с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме реального времени (для приборов Rotor-Gene 6000/3000) «Вектор-ПЦР_РВ-Эбола-RG» № РЗН 2013/1322, производства ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» (http://www.vector.nsc.ru/katalog-produktsii-fbun-gnts-vb).

Иммуноферментные тест-системы в формате ИФА или ИХА для диагностики БВВЭ (выявления специфических антител) или выявления антигенов (вирусных маркеров) в РФ не зарегистрированы или коммерчески не доступны.

По литературным данным, для подтверждения диагноза БВВЭ и эпидемиологических исследований обычно применяются иммуноферментные тест-системы для выявления специфических антител (Broadhurst M.J., Brooks T.J., Pollock N.R. Diagnosis of Ebola Virus Disease: Past, Present, and Future. / Clin Microbiol Rev. 2016; 29(4):773-93. doi:10.1128/CMR.00003-16). Разработки лабораторных иммуноферментных тест-систем в формате ИФА с использованием инактивированного ВЭ описаны, начиная с 1986 г., причем российские исследователи были первыми в этой области (Иванов А.П., Ткаченко П., van der Groen и др. Непрямой иммуноферментный метод для лабораторной диагностики геморрагических лихорадок Ласса и Эбола. / Вопр. вирусол. 1986. Том 31, №2. С. 186-190; Мерзликин Н.В., Чепурнов А.А., Истомина Н.Н. и др. Разработка и применение иммуноферментных тест-систем для диагностики лихорадки Эбола. / Вопросы вирусол. 1995. №1. С. 31-35; Ksiazek T.G., West C.P., Rollin P.E. et al. ELISA for the detection of antibodies to Ebola viruses. / Infect Dis. 1999, 179(1):192-19). И в настоящее время инактивированный ВЭ, наработанный на культуре клеток Vero, используется для разработки серологической диагностики БВВЭ (Krähling V., Becker D., Rohde C., et al. Development of an antibody capture ELISA using inactivated Ebola Zaire Makona virus. / Med Microbiol Immunol. 2016; 205(2):173-83. doi: 10.1007/s00430-015-0438-6; Рустамова Л.М.. Семенов С.Ф., Богданова Н.Л. и др. Набор для выявления антител к возбудителям особо опасных инфекций Ласса и Эбола методом непрямой иммунофлуоресценции. / Биопрепараты. Профилактика, диагностика, лечение. 2016. № 2. С. 115-119; Пьянков С. А., Пьянков О. В., Найденова Е. В. и др. Опыт использования метода ИФА для выявления антител к вирусу Эбола при работе бригады СПЭБ в Гвинейской Республике. / Проблемы особо опасных инфекций. 2016. № 3. С. 71-75. https://doi.org/10.21055/0370-1069-2016-3-71-75). Но по Санитарным правилам РФ, ВЭ относится к I группе патогенности (http://docs.cntd.ru/document/901799960), поэтому наработка нативного вирусного препарата сопряжена с опасностью для научного персонала и требует тщательной проверки биобезопасности антигена с использованием чувствительных культур клеток и адекватных животных моделей. Кроме того, в настоящее время в РФ отсутствуют официально утвержденные методики инактивации филовирусов с целью их использования в качестве антигенов вне лаборатории с максимальным уровнем биозащиты. В основном, при разработке описанных в литературе зарубежных тест-систем ИФА для выявления специфических антител, используются рекомбинантные аналоги вирусных белков, полученные в прокариотической или эукариотической системах экспрессии генов GP, NP и VP40 ВЭ и свойства которых подтверждены с использованием сывороток крови людей-рековалесцентов.

Ранее методом иммуноблоттинга было показано, что антитела, специфичные к филовирусным белкам NP и VP40 появляются в крови переболевших обезьян и людей (Becker S., Feldmann H., Will C. et al. Evidence for occurrence of filovirus antibodies in humans and imported monkeys: do subclinical filovirus infections occur worldwide? / Med Microbiol Immunol. 1992; 181(1):43-55). Исследование иммунного ответа у людей против ВЭ проводили во время вспышки БВВЭ в 1996 г. в Габоне. Было обнаружено, что у оставшихся в живых пациентов, на фоне циркуляции вируса, в сыворотке крови рано появлялись и количественно увеличивались IgG, направленные преимущественно против нуклеопротеина (NP) и матриксного белка VP40 (Baize S., Leroy E.M., Georges-Courbot M.C. et al. Defective humoral responses and extensive intravascular apoptosis are associated with fatal outcome in Ebola virus-infected patients. / Nat Med. 1999; 5(4):423-426). Сыворотки крови людей, переболевших БВВЭ (186 проб), были собраны в Уганде в 2000-2010 гг. и хранились в вирусологическом исследовательском институте (Уганда, г. Энтеббе). Для оценки профиля противовирусных антител, появляющихся в течение естественной БВВЭ у выживших людей, в ИФА использовали рекомбинантные белки GP, VP30, NP и VP40 ВЭ (штамм Sudan), полученные в эукариотической системе экспрессии в клетках почки эмбриона человека (линия 293Т). Результаты показали, что соотношение по специфичности антител распределилось следующим образом: к NP, GP, VP30 и VP40 - 115/186, 97/186, 79/186 и 43/186, соответственно. Соотношение нейтрализующих сывороток к не нейтрализующим, содержащих антитела, специфичные к трем белкам - GP, NP и VP40, было примерно 50/50. Кроме того, было показано, что наличие антител, специфичных к гликопротеину (GP), не всегда обеспечивало нейтрализацию ВЭ на культуре клеток Vero (Sobarzo A., Perelman E., Groseth A., et al. Profiling the native specific human humoral immune response to Sudan Ebola virus strain Gulu by chemiluminescence enzyme-linked immunosorbent assay. / Clin Vaccine Immunol. 2012; 19(11):1844-52. doi: 10.1128/CVI.00363-12).

Разрабатываемые в настоящее время векторные вакцины против ВЭ основаны на кодировании белка GP (Должникова И.В., Токарская Е.А, Джаруллаева А.Ш. и др. Векторные вакцины против болезни, вызванной вирусом Эбола. / ACTA NATURAE, 2017; 9(3): 4-12), но и ДНК-конструкции, кодирующие белок NP, также были эффективны при исследовании на животных (Vanderzanden L., Bray M., Fuller D. et al. DNA vaccines expressing either the GP or NP genes of Ebola virus protect mice from lethal challenge. Virology. 1998; 246(1):134-44). Пептиды NP рассматриваются в качестве потенциальных синтетических вакцин-кандидатов против ВЭ (Jain S, Baranwal M. Conserved peptide vaccine candidates containing multiple Ebola nucleoprotein epitopes display interactions with diverse HLA molecules. Med Microbiol Immunol. 2019 Feb 21. doi: 10.1007/s00430-019-00584-y).

Рекомбинантный белок NP филовирусов может быть идеальным антигеном для разработки серологических иммуноферментных тест-систем из-за высокого содержания нативного белка в вирионе (17% от общей массы белков) и высокой иммуногенности (Elliott LH, Kiley MP, McCormick JB. Descriptive analysis of Ebola virus protein. / Virology. 1985; 147(1):169-176; Huang Y, Zhu Y, Yang M et al. Nucleoprotein-based indirect enzyme-linked immunosorbent assay (indirect ELISA) for detecting antibodies specific to Ebola virus and Marbug virus. / Virol Sin. 2014; 29(6):372-80). Например, описано, что белки NP и GP ВЭ (штамм Zaire), экспрессированные в E.coli и полученные посредством рекомбинантных бакуловирусов в эукариотических клетках Spodoptera frugiperda, реагировали в ИФА с антителами реконвалесцентов из Заира (в н.вр. ДРК), Габона и Берега Слоновой Кости (Prehaud C., Hellebrand E., Coudrier D. et al. Recombinant Ebola virus nucleoprotein and glycoprotein (Gabon 94 strain) provide new tools for the detection of human infections. / J Gen Virol. 1998; 79 (Pt11):2565-72). Рекомбинантный полноразмерный белок NP ВЭ (штамм Zaire), полученный экспрессией гена NP в бакуловирусной системе при инфицировании культуры клеток шейки матки человека (линия HeLa), был использован для обнаружения IgG методом иммунофлуоресценции в сыворотках крови, собранных от реконвалесцентов при вспышках БВВЭ в 1976, 1977 и 1995 гг. в ДРК, а также от приматов вида cynomolgus monkeys (M. fascicularis) в г. Рестоне (США) в 1996 г. при вспышке Эбола-подобной болезни у животных, завезенных в питомник из Филиппин. Специфичность определения IgG в этом тесте была 100%-ной, без ложноположительных результатов (Saijo M., Niikura M., Morikawa S. et al. Immunofluorescence method for detection of Ebola virus immunoglobuling, using HeLa cells which express recombinant nucleoprotein. / J Clin Microbiol. 2001;39(2):776-8).

Для эпидемиологического исследования сывороток крови обезьян вида орангутаны (Pongo pygmaeus) на островах Индонезии на наличие антител, специфичных к ВЭ (штамм Reston), применяли лабораторные образцы ИФА и иммуноблоттинга, в которых в качестве антигенов использовали рекомбинантные белки GP, NP и VP40 разных изолятов штамма Zaire ВЭ (Mayinga, Boniface, Cote d’Ivoire, Bundibugyo) и ВЭ-штамм Reston (изолят Pennsylvania), полученные в эукариотической системе экспрессии линии клеток 293Т (Nidom C.A., Nakayama E., Nidom R.V. et al. Serological evidence of Ebola virus infection in Indonesian orangutans. / PLoS One. 2012; 7(7):e40740. doi: 10.1371/journal.pone.0040740). Для неинвазивного метода определения специфических антител в фекалиях горилл, обитающих в Национальном парке на юго-западе от реки Mambili в ДРК, использовали методы ИФА и иммуноблоттинга на основе антигена - рекомбинантного белка NP ВЭ, полученного в эукариотической системе экспрессии в клетках линии 293Т (Reed P.E., Mulangu S., Cameron K.N. et al. A new approach for monitoring ebolavirus in wild great apes. / PLoS Negl Trop Dis. 2014; 8(9):e3143. doi: 10.1371/journal.pntd.0003143). Образцы сывороток крови рукокрылых (летучих мышей), как предполагаемых природных резервуаров ВЭ, тестировали в ИФА и иммуноблоттинге, с использованием в качестве антигена рекомбинантный белок NP, полученный в прокариотической системе экспрессии E.coli (Hayman DT, Yu M, Crameri G, Wang LF, Suu-Ire R, Wood JL, Cunningham AA. Ebola virus antibodies in fruit bats, Ghana, West Africa. / Emerg Infect Dis. 2012; 18(7):1207-9. doi: 10.3201/eid1807.111654). Молекулярные и серологические признаки присутствия ВЭ (штамм Reston) в сыворотках крови летучих мышей разных видов, обитающих на Филиппинах и в Бангладеш, были обнаружены при использовании метода ПЦР на основе праймеров, специфичных к гену NP ВЭ, а также ИФА на основе рекомбинантного белка NP, полученного в прокариотической системе экспрессии E.coli (Jayme S.I., Field H.E., de Jong C. et al. Molecular evidence of Ebola Reston virus infection in Philippine bats. Virol J. 2015 Jul 17; 12:107. doi: 10.1186/s12985-015-0331-3; Olival K.J., Islam A., Yu M. et al. Ebola virus antibodies in fruit bats, Bangladesh. / Emerg Infect Dis. 2013; 19(2):270-3. doi: 10.3201/eid1902.120524).

При разработке ИФА для выявления вирусного антигена на основе моноклональных антител (МКА) в качестве положительного контроля использовали полноразмерный рекомбинантный белок NP ВЭ (штамм Zaire), полученный в бакуловирусной системе экспрессии его гена в векторе pQE31, а также короткие пептиды длиной 26 а.о. (входящих в состав С-конца вирусного белка), полученные в клетках E.coli, трансформированных с векторами рGEX2Т, кодирующими ген NP штаммов Sudan и Reston (Niikura M, Ikegami T, Saijo M et al. Detection of Ebola viral antigen by enzyme-linked immunosorbent assay using a novel monoclonal antibody to nucleoprotein. / Clinical Microbiol. 2001; 39(9):3267-3271).

Для выявления специфических человеческих антител разработан микрочип на основе рекомбинантных белков GP, NP и VP40 ВЭ (штаммов и изолятов - Zaire, Sudan, Bundibugyo, Tai Forest, Reston), полученных в прокариотической системе E.coli (BL21-AI) при экспрессии плазмид, несущих соответствующие гены с последовательностью, кодирующей полигистидиновый тракт. Рекомбинантные белки были очищены методом аффинной хромотографии до 80-95% чистоты (концентрация очищенных белков не указана). Показано, что титры антител убывали по их специфичности от NP до VP40 и GP, соответственно (Natesan M., Jensen S.M., Keasey S.L. et al. Human Survivors of Disease Outbreaks Caused by Ebola or Marburg Virus Exhibit Cross-Reactive and Long-Lived Antibody Responses. / Clin Vaccine Immunol. 2016; 23(8):717-24. doi: 10.1128/CVI.00107-16). Рекомбинантные белки GP, VP40 и NP ВЭ (изолят Маkona, 2014 штамма Zaire) были получены в прокариотической системе экспрессии E.coli (BLR (DE3) при клонировании коммерчески синтезированных фрагментов н.о. в векторе pET15bLFn. При стимуляции мононуклеарных клеток периферической крови этими белками, методом спот анализа (enzyme-linked immunospot assay, ELISPOT), было показано, что все рекомбинантные белки вызывают высокий уровень Т-клеточного ответа. Полученные данные важны для разработки эффективных вакцин, вызывающих сбалансированный иммунный ответ (Herrera B.B., Hamel D.J., Oshun P. et al. A modified anthrax toxin-based enzyme-linked immunospot assay reveals robust T cell responses in symptomatic and asymptomatic Ebola virus exposed individuals. / PLoS Negl Trop Dis. 2018; 12(5):e0006530. doi: 10.1371/journal.pntd.0006530).

Чувствительный и высокопроизводительный серологический тест для выявления специфический антител разработан на основе технологии Luminex с использованием коммерческих препаратов (система экспрессии не указана) неполноразмерных рекомбинантных белков GP, VP40 и NP ВЭ (штамм Zaire, изоляты Mayinga 1976, Makona 2014 и др.). При исследовании сывороток крови людей, выживших в Гвинее после БВВЭ, было показано, что почти все образцы (87 из 94) взаимодействовали с тремя белками с чувствительностью 94,4, 95,4 и 96,3%, соответственно. С рекомбинантными белками штаммов - Sudan (Gulu), Bundibugyo и Reston антитела этих сывороток крови реагировали с меньшей чувствительностью (Ayouba A., Touré A., Butel C. et al. Development of a Sensitive and Specific Serological Assay Based on Luminex Technology for Detection of Antibodies to Zaire Ebola Virus. / J Clin Microbiol. 2016; 55(1):165-176. doi: 10.1128/JCM.01979-16).

Иммунохроматографический (ИХА) мультиплексный тест с оптическим приспособлением для смартфона разработан для «полевых» исследований биологического материала на содержание специфических антител и антигенов на основе трех рекомбинантных белков - GP, VP40 и NP ВЭ (штамм Sudan, изолят Gulu). Белок GP получен в эукариотической системе, а белки VP40 и NP получены экспрессией последовательностей н.о. соответствующих генов с последовательностью н.о., кодирующей полигистидиновый тракт (на С- или N-концах белков NP и VP40, соответственно) в прокариотической системе E.coli (BL21(DE3) и очищены аффинной хроматографией на Ni-хеллатной смоле (Brangel P., Sobarzo A., Parolo C. et al. A Serological Point-of-Care Test for the Detection of IgG Antibodies against Ebola Virus in Human Survivors. / ACS Nano. 2018; 12(1):63-73. doi: 10.1021/acsnano.7b07021).

Наиболее близким к заявляемому техническому решению (прототипом) является работа по описанию способа получения рекомбинантной плазмидной ДНК, обеспечивающей экспрессию полного гена NP вируса Эбола (штамм Zaire, изолят Mayinga) в векторе pQE30 с выходом целевого белка до 40% от суммарного клеточного белка и получение из 1 литра биомассы трансформированной культуры клеток E.coli (JM103) 10 мл очищенного рекомбинантного полноразмерного белка NP ВЭ с концентрацией 2,4 мг/мл. Чистота белка после аффинной хроматографии составляет 67% (Иванова А.В., Казачинская Е.И., Качко, А.В. и др. Получение и иммунологическая характериcтика рекомбинантных белков VP40 и NP филовирусов. / Проблемы особо опасных инфекций. 2010. №4. С. 32-36). Однако в прототипе для выделения РНК был использован инфекционный вирусный препарат, что сопряжено с опасностью для научного персонала, а также недостаточно оптимизирован кодоновый состав рекомбинантной плазмидной ДНК-конструкции pQE30-ВЭ, вследствие чего обеспечивается недостаточный выход целевого рекомбинантного белка.

Техническим результатом заявляемого изобретения является повышение выхода целевого рекомбинантного белка NP-ВЭ (по сравнению с прототипом) до 40 % от суммарного клеточного белка и получение из одного литра биомассы E.coli 10 мл очищенного рекомбинантного белка NP-ВЭ с концентрацией 6 мг/мл путем оптимизации кодонового состава ДНК-конструкции и условий культивирования трансформированной культуры E.coli (BL21/DE3(+) - штамма продуцента.

Указанный технический результат достигается тем, что создана рекомбинантная плазмидная ДНК pET21-NPVE, предназначенная для экспрессии гена нуклеопротеина NP вируса Эбола (штамм Zaire, изолят Mayinga) в прокариотической системе E.coli и получения рекомбинантного белка NP-ВЭ, имеет размер 7593 п.н. и содержит в своем составе:

- ген bla (координаты с 599 по 1459 п.н.), в качестве генетического маркера, определяющего устойчивость к ампициллину клеток бактерии E.coli, трансформированных рекомбинантной плазмидой pET21-NPVE;

- участок начала репликации ori (координаты с 1630 по 2218 п.н.)

- промотор фага T7 (координаты с 5117 по 5135 п.н.), обеспечивающий экспрессию полноразмерного гена NP вируса Эбола в прокариотических клетках E.coli;

- лактозный репрессор (координаты с 3648 п.н. по 4730 п.н.) - ДНК-связывающий белок, который ингибирует экспрессию генов E.coli и обеспечивает экспрессию целевого рекомбинантного белка NP-ВЭ после добавления индуктора изопропил-β-D-1-тиогалактопиранозида (IPTG);

- уникальные сайты узнавания рестрикционными эндонуклеазами, имеющие следующие координаты: NheI (5209 п.н.) и XhoI (7432 п.н.);

- полноразмерный ген NP вируса Эбола (изолят Mayinga, штамм Zaire) 2217 п.н. (с 470 по 2686 нуклеотид геномной РНК), встроенный в экспрессионную кассету по сайтам рестрикции NheI (5209 п.н.) и XhoI (7432 п.н.), который кодирует 739 аминокислотных остатков (а.о.) вирусного нуклеопротеина;

- последовательность (18 п.н.), кодирующая полигистидиновый (6xHis) политракт из шести гистидинов на N-конце кодируемого белка для последующей очистки его с помощью метода аффинной Ni-хроматографии.

Указанный технический результат достигается также тем, что получен рекомбинантный белок NP-ВЭ в результате экспрессии гена нуклепротеина NP вируса Эбола (штамм Zaire, изолят Mayinga) в бактериальной системе экспрессии E.coli в составе рекомбинантной ДНК-конструкции pET21-NPVE по п. 1 формулы, имеющий расчетную молекулярную массу 84457,42 Да, и аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1:

MDSRPQKIWM APSLTESDMD YHKILTAGLS VQQGIVRQRV IPVYQVNNLE 50

EICQLIIQAF EAGVDFQESA DSFLLMLCLH HAYQGDYKLF LESGAVKYLE 100

GHGFRFEVKK RDGVKRLEEL LPAVSSGKNI KRTLAAMPEE ETTEANAGQF 150

LSFASLFLPK LVVGEKACLE KVQRQIQVHA EQGLIQYPTA WQSVGHMMVI 200

FRLMRTNFLI KFLLIHQGMH MVAGHDANDA VISNSVAQAR FSGLLIVKTV 250

LDHILQKTER GVRLHPLART AKVKNEVNSF KAALSSLAKH GEYAPFARLL 300

NLSGVNNLEH GLFPQLSAIA LGVATAHGST LAGVNVGEQY QQLREAATEA 350

EKQLQQYAES RELDHLGLDD QEKKILMNFH QKKNEISFQQ TNAMVTLRKE 400

RLAKLTEAIT AASLPKTSGH YDDDDDIPFP GPINDDDNPG HQDDDPTDSQ 450

DTTIPDVVVD PDDGSYGEYQ SYSENGMNAP DDLVLFDLDE DDEDTKPVPN 500

RSTKGGQQKN SQKGQHIEGR QTQSRPIQNV PGPHRTIHHA SAPLTDNDRR 550

NEPSGSTSPR MLTPINEEAD PLDDADDETS SLPPLESDDE EQDRDGTSNR 600

TPTVAPPAPV YRDHSEKKEL PQDEQQDQDH TQEARNQDSD NTQSEHSFEE 650

MYRHILRSQG PFDAVLYYHM MKDEPVVFST SDGKEYTYPD SLEEEYPPWL 700

TEKEAMNEEN RFVTLDGQQF YWPVMNHKNK FMAILQHHQL EHHHHHH* 748

длиной 748 а.о., включая 6xHis, и стоп-кодон, и обладающий иммуногенными и антигенными свойствами, и предназначенный для индукции в организме мышей линии Balb/c антител, узнающих в иммунохимических реакциях вирусный белок NP-ВЭ, а также взаимодействующий с мышиными моноклональными антителами, поликлональными козьими и человеческими антителами, специфичными к инактивированному и инфекционному вирусу Эбола.

При получении рекомбинантной плазмидной ДНК pET21-NPVE исключена стадия выделения вирусной РНК из инфекционного материала, а именно проводится синтез гена NP вируса Эбола (штамм Zaire, изолят Mayinga) с его встройкой в донорскую ДНК-матрицу (плазмиду pGH). Оптимизация кодонового состава ДНК-конструкции на основе коммерческой векторной плазмиды pET21 (Novagen, США) и условий культивирования трансформированной культуры E.coli (BL21/DE3(+) - штамма продуцента позволяет повысить выход рекомбинантного белка NP-ВЭ (по сравнению с прототипом) до 40% от суммарного клеточного белка и получить из одного литра биомассы E.coli 10 мл очищенного рекомбинантного белка NP-ВЭ с концентрацией 6 мг/мл. Использование рекомбинантного белка NP-ВЭ для трехкратной иммунизации мышей линии Balb/c в общей концентрации 90 мкг/мышь позволяет индуцировать в организме животных синтез антител, которые взаимодействуют с нативным белком NP в составе инактивированного препарата ВЭ в ИФА и узнают вирусный белок NP в иммуноблоттинге (т.е. рекомбинантный белок NP-ВЭ обладает иммуногенностью). Моноклональные мышиные антитела (МКА), специфичные к инактивированному ВЭ, и

поликлональные антитела (человеческие и козьи), специфичные к инфекционному ВЭ, взаимодействуют с рекомбинантным белком NP-ВЭ в ИФА и иммуноблоттинге (т.е. рекомбинантный белок NP-ВЭ обладает антигенностью).

При исследовании антигенных свойств рекомбинантного белка NP-ВЭ использовали моноклональные мышиные антитела (МКА) 10А8 и 4А8 специфичные к белку NP инактивированного ВЭ, полученные как описано (Казачинская Е.И. Получение моноклональных антител и рекомбинантных белков для иммунодиагностики опасных инфекций человека. / Автореф. дисс. доктора биол. наук, Кольцово, 2010, 57 с.), препарат очищенных козьих IgG, имеющих титр нейтрализующих антител 1/1000 и полученных при иммунизации животных инфекционным вирусом как описано (Зубавичене Н.М. Получение и изучение свойств козьих и овечьих лечебно-профилактических иммуноглобулинов против болезни Эбола. / автореф. канд. диссертации. 2001. Кольцово), а также сыворотки крови десяти здоровых пациентов в возрасте 25-60 лет, серопозитивных по БВВЭ и давших свое письменное согласие на исследование. Забор крови у пациентов проводился к.м.н. Деминой А.В. с разрешения Этического комитета Угандийского вирусологического исследовательского института (Уганда, г. Энтеббе) во время командировки в Уганду от Университета им. Бен-Гуриона (г. Беер-Шева, Израиль).

Очищенный рекомбинантный белок NP-ВЭ, полученный в результате экспрессии полного гена нуклеопротеина (NP) ВЭ в бактериальной системе E.coli в составе рекомбинантной плазмидной ДНК-конструкции pET21-NPVE может быть использован:

1. В качестве антигена:

- в клинической практике для серологического тестирования сывороток крови пациентов на содержание иммуноглобулинов классов IgM и IgG, специфичных к ВЭ методами ИФА, иммуноблоттинга и ИХА;

- при создании контрольных панелей сывороток крови, содержащих и не содержащих IgM и IgG, специфичных к ВЭ;

- как положительный контроль в иммуноферментных тест-системах по выявлению вирусного белка NP ВЭ;

2. В качестве иммуногена:

- для иммунизации мышей при получении препаратов гибридомных моноклональных антител, используемых при разработке иммуноферментных тест-систем в формате «сэндвич» для выявления вирусного антигена;

- в составе профилактической вакцины против ВЭ в комплексе с другими структурными вирусными протеинами, например, гликопротеином (GP) и матриксным белком VP40.

Перечень графических материалов.

На фиг. 1 представлена аминокислотная последовательность SEQ ID NO: 1 рекомбинантного белка NP-ВЭ, полученного в результате экспрессии гена нуклепротеина NP вируса Эбола (штамм Zaire, изолят Mayinga) в бактериальной системе экспрессии E.coli в составе рекомбинантной ДНК-конструкции pET21-NPVE.

Фиг. 2. Последовательность нуклеотидных остатков (н.о) гена NP вируса Эбола (штамм Zaire, изолят Mayinga) (GenBank № AF 086833.2).

Фиг. 3. Схема клонирования гена NP, кодирующего белок NP вируса Эбола (штамм Zaire, изолят Mayinga) из коммерческой донорской ДНК-матрицы (плазмида pGH+NP-ВЭ)

Примечания к фиг. 3: 1 - ПЦР продукт (NP-ВЭ) после обработки ферментами NheI и XhoI; 2 - вектор pET21 после обработки ферментами NheI и XhoI; 3 - плазмида pET21-NPVE, рестрицированная ферментами NheI и XhoI; (подтверждение наличия встройки фрагмента); 4 - маркер 1kb.

Фиг. 4. Электрофоретическое разделение ПЦР фрагмента и плазмидной ДНК pET21 после ферментативного гидролиза.

Фиг. 5. Схема ДНК-конструкции pET21-NPVE.

Примечания к фиг. 5: 1 - белковые маркеры молекулярной массы (кДa); 2 - лизат клеток pET21; 3 - индуцированный лизат клеток, трансформированных pET21-NPVE; 4 - очищенный рекомбинантный белок NP-ВЭ по 10 мкл/дорожка, соответственно.

Фиг. 6. Электрофоретическое разделение лизатов E.coli, трансформированных ДНК-конструкцией pET21-NPVE и очищенного препарата рекомбинантного белка NP-ВЭ в 6%-ном ПААГ-SDS.

Примечания к фиг. 6: 1, 2 - концентрированный, инактивированный ВЭ и рекомбинантный белок NP-ВЭ, соответственно, по 10 мкл на дорожку. Стрелками обозначены вирусный белок NP (справа) и рекомбинантный белок NP-ВЭ (слева).

Фиг. 7. Электрофореграмма очищенных препаратов в 10%-ном ПААГ-SDS.

Примечания к фиг. 7: антиген рекомбинантного белка NP ВЭ был использован в рабочем разведении 1/1000, что соответствует концентрации 6 мкг/мл. Для подавления неспецифического сигнала связывания антител с рекомбинантным белком, сыворотки крови истощали лизатом E.coli в разведении 1/1000. Антиген ВЭ (штамм Zaire, изолят Mayinga) сконцентрированный и очищеный из суспензии инфицированной культуры клеток Vero, инактивирован кипячением в течение 2 мин в растворе, содержащем 5% β-меркаптоэтанола и 1% додецилсульфата натрия (SDS) с дальнейшим прогреванием при 60°С в течение 1 часа, как описано (Чепурнов А.А., Мерзликин Н.В., Рябчикова Е.И. и др. Получение очищенного вируса Эбола. / Вопросы вирусологию 1994. Т.39. № 6. С. 254-257) был использован в рабочем разведении 1/1000. Конъюгат Gout anti mouse с пероксидазой использовали в разведении 1/6000. Фон системы - оптическая плотность (ОП) в лунках с субстратно-индикаторной смесью и блокировочным раствором 1 N HCl. Титр антител определяли при средней арифметической значения ОП при трехкратном повторе титрования с учетом среднего значения фона системы (ОП = 0,15); положительным считали значение ОП в два раза и более выше ОП фона системы. В качестве отрицательного контроля для титрования сывороток крови мышей использовали инактивированный вирус Марбург (штамм Рорр) в разведении 1/1000, полученный также как и антиген ВЭ доктором Чепурновым.

Фиг. 8. Результат титрования в ТИФА сыворотки крови мышей, иммунизированных рекомбинантным белком NP-ВЭ.

Фиг. 9. Результат титрования в ТИФА моноклональных антител, специфичных к инактивированному ВЭ.

Примечания к фиг. 9: антигены - рекомбинантный белок NP-ВЭ и инактивированный ВЭ использованы в рабочем разведении 1/1000. Моноклональные антитела 10А8 и 4А8, специфичные к инактивированному ВЭ, полученные, как описано (Казачинская Е.И. Получение моноклональных антител и рекомбинантных белков для иммунодиагностики опасных инфекций человека. / Автореф. дисс. доктора биол. наук. Кольцово, 2010, 57 с.), использованы в виде культуральной среды от гибридом, осажденные 50%-ным раствором сульфатом аммония и концентрированные в 100 раз от общего объема. В качестве отрицательного контроля для титрования сывороток крови мышей использовали инактивированный вирус Марбург (штамм Рорр) в разведении 1/1000.

Фиг. 10. Иммуноблоттинг моноклональных антител с рекомбинантным и нативным белками NP ВЭ.

Примечания к фиг. 10: Антигены нанесены на дорожки по 10 мкл. 1 - препарат инактивированного ВЭ, обработан МКА 10А8; 2 - препарат инактивированного ВЭ, обработан МКА 4А8; 3 - рек. белок NP-ВЭ, обработан МКА 1А8; 4 - рек. белок NP-ВЭ, обработан МКА 4А8; 5 - препарат инактивированного ВМ, обработан МКА 10А8 (отриц. контроль); 6 - препарат инактивированного ВМ, обработан МКА 4А8 (отриц. контроль); 7 - лизат E.coli., обработан МКА 10А8 (отриц. контроль); 8 - лизат E.coli., обработан МКА 4А8 (отриц. контроль). Антивидовой конъюгат с пероксидазой Gout anti mouse (Sigma) использован в разведении 1/6000.

Фиг. 11. Результат титрования в ТИФА очищенных IgG козы, иммунизированной инфекционным ВЭ.

Примечания к фиг. 11: антигены использованы в рабочем разведении 1/1000. Очищенные IgG козы, специфичные к инфекционному ВЭ (штамм Zaire, изолят Mayinga) получены как описано (Зубавичене Н.М. Получение и изучение свойств козьих и овечих лечебно-профилактических иммуноглобулинов против болезни Эбола. / автореф. канд.диссертации. 2001. Кольцово). Для подавления неспецифического сигнала связывания IgG с рекомбинантным белком истощали лизатом E.coli в разведении 1/1000. Конъюгат белка G меченного пероксидазой использован в разведении 1/1000. Фон системы - оптическая плотность (ОП) в лунках с субстратно - индикаторной смесью и блокировочным раствором 1 N HCl. Титр антител определяли при средней арифметической значения ОП при трехкратном повторе титрования с учетом среднего значения фона системы (ОП = 0,15); положительным считали значение ОП в два раза и более выше ОП фона системы. В качестве отрицательного контроля для титрования сывороток крови мышей использовали инактивированный вирус Марбург (штамм Рорр) в разведении 1/1000, полученный так же, как и антиген ВЭ доктором Чепурновым.

Примечания к фиг. 11: 1. антиген ВЭ обработан сывороткой мыши, иммунизированной инактивированным ВЭ (положит. контроль); 2. антиген ВЭ обработан сывороткой мышей, иммунизированных рекомбинантным белком NP-ВЭ. Антиген инактивированного ВЭ нанесен на дорожки по 10 мкл; мышиные антитела и антивидовой конъюгат с пероксидазой Gout anti mouse (Sigma) использованы в разведении 1/500 и 1/6000, соответственно.

Фиг. 12. Иммуноблоттинг мышиных антител, специфичных к рекомбинантному белку NP-ВЭ, с инактивированным вирусным препаратом.

Примечания к фиг. 12: 1. рекомбинантный белок NP-ВЭ; 2. инактивированный ВЭ. Антигены нанесены на дорожки по 10 мкл. Очищенные IgG козы использованы в разведении 1/800 и для них конъюгат белка G с пероксидазой хрена в разведении 1/1000.

Фиг. 13. Иммуноблоттинг очищенных IgG козы, специфичных к инфекционному ВЭ, с вирусным антигеном и рекомбинантным белком NP-ВЭ.

Примечания к фиг. 13: антигены нанесены на дорожки по 10 мкл, антитела двух реконвалесцентов (№ 3 и №10) в разведении (1/200) каждого. Антивидовой конъюгат с пероксидазой Gout anti human Sigma) использован в разведении 1/6000.

Фиг. 14. Иммуноблоттинг антител сывороток крови людей, переболевших лихорадкой Эбола, с вирусным антигеном и рекомбинантным белком NP-ВЭ.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами конкретного выполнения изобретения.

Пример 1. Теоретический анализ, подбор праймеров для амплификации последовательности, кодирующей белок NP ВЭ.

1.1 Биоинформативный анализ генома ВЭ (штамм Zaire, изолят Mayinga) был проведен с помощью программы SnapGene.

1.2. Синтез гена NP ВЭ с его встройкой в донорскую ДНК - матрицу (плазмиду pGH) был проведен в коммерческой научно-производственной фирме OOO «ДНК-Синтез» (г. Москва).

1.3. Подбор праймеров (табл. 1) для амплификации нуклеотидной последовательности гена NP ВЭ (фиг. 2), расчет условий и кинетики ПЦР нуклеотидной последовательности осуществляли с помощью программы SnapGene и Vector NTI-11. Синтез праймеров был проведен в коммерческой научно-производственной фирме OOO «ДНК-Синтез» (г. Москва).

Таблица 1. Праймеры использованные для амплификации последовательности, кодирующей белок NP вируса Эбола.

Название олигонуклеотида	Нуклеотидная последовательность
F-NP- NheI	5'-ATAAGCTAGCATGGATTCTCGTCCTCAGAAAATCT-3'
R-NP- XhoI	5'-AAAACTCGAGCTGATGATGTTGCAGGATTG-3'

Пример 2. Создание ДНК-конструкции (pET21-NPVE).

2.1. Амплификация методом ПЦР фрагмента ДНК, кодирующего белок NP ВЭ.

Из коммерческой плазмиды pGH-NPVE (фиг. 3), на амплификаторе «Mastercycler Gradient» (Eppendorf, Германия) методом ПЦР с помощью специфических праймеров (табл. 1) был амплифицирован район, кодирующий белок NP ВЭ.

2.2. Выделение ДНК из агарозного геля.

После проведения ПЦР очистку продуктов амплификации ДНК проводили фракционированием методом электрофореза в 1%-ном агарозном геле в Трис-ацетатном буфере (TAEx1), с бромистым этидием (EtBr) в концентрации 0,2 мкг/мл. После визуализации под УФ-излучением фрагменты ДНК необходимой длины, разделенные в агарозном геле (фиг. 4) вырезали из геля и элюировали при помощи набора «Евроген» Cleanup Standard (Россия) в соответствии с рекомендациями производителя и ресуспендировали осадок в 20 мкл бидистиллированной воды.

2.3. Ферментативный гидролиз векторной плазмиды pET21 и ПЦР продукта (последовательности участка генома ВЭ, кодирующей белок NP ВЭ).

Для клонирования гена NP ВЭ в вектор pET21 были использованы эндонуклеазы рестрикции NheI и XhoI («Сибэнзим», Россия) с прилагаемыми к ним буферами. Реакционную смесь готовили в соответствии с активностью фермента (2-5 ед. акт. на 1 мкг ДНК) и концентрации плазмидной ДНК. Условия реакции: температура, состав буфера и длительность проведения ферментативного гидролиза ДНК подбирали в соответствии с инструкциями производителя «Сибэнзим».

Обработанные ферментами ПЦР фрагмент, соответствующий гену NP ВЭ и вектор pET21 разделяли с помощью электрофореза в 0,8% агарозном геле с последующим выделением с помощью набора «Евроген» Cleanup Standard (Россия) в соответствии с инструкцией производителя.

2.4. Лигирование ПЦР продукта (последовательности участка генома ВЭ, кодирующей белок NP ВЭ) и векторной плазмиды pET21.

Реакцию лигирования проводили 30 минут при комнатной температуре, используя смесь из 2 мкг ампликонов с ДНК-матрицы, 1 мкг векторной плазмиды pET21 и 20 е.а. ДНК-лигазы фага Т4 (Сибэнзим, Россия) в прилагаемом к коммерческому набору реакционном буфере. Полученный препарат ДНК-конструкции pET21-NPVE (фиг. 5) использовали для трансформирования культуры компетентных клеток E.coli штамм BL21/DE3(+).

Пример 3. Получение штамма Escherichia Coli-продуцента рекомбинантного белка NP-ВЭ.

При создании прокариотической системы экспрессии гена NP, кодирующего белок NP ВЭ, использовали коммерчески доступный штамм BL21/DE3(+) культуры клеток E.coli (Novagen, США).

3.1. Трансформация «компетентных» клеток E. coli рекомбинантными плазмидами.

Коммерчески доступный штамм E. coli BL21/DE3(+) (Novagen, США) использовали для экспрессии гена рекомбинантного белка NP-ВЭ. К «компетентным» клеткам BL21/DE3(+) добавляли 10 мкл лигазной смеси, инкубировали на льду в течение 30 минут. После этого клетки подвергали «температурному шоку» при 42°С в течение 45 сек. Охлаждали клетки на льду в течение 2 минут, затем добавляли 200 мкл среды «S.O.B» (Super Optimal Broth) и инкубировали при 37°С в течение 60 минут. По окончании инкубации трансформированные клетки высевали на чашку Петри с твёрдой питательной средой LB (Lysogeny broth) (среда LB с 1,5% агара), содержащей антибиотик (ампициллин, 50-100 мкг/мл).

3.2. Культивирование трансформированной культуры клеток E.coli и индукция синтеза рекомбинантного белка NP-ВЭ.

Клетки E.coli штамма BL21/DE3(+), трансформированные ДНК-конструкцией (pET21-NPVE) селективно культивировали в 100 мл жидкой питательной среды LB с добавлением ампициллина натриевой соли в рабочей концентрации 25 мкг/мл. Синтез целевого рекомбинантного белка индуцировали 1 M IPTG (изопропил-β-D-тиогалактозид). Отбор клонов E.coli-продуцентов проводили по наличию синтезируемого целевого белка по результатам электрофореза лизатов клеток в 6%-ном полиакриламидном геле (фиг. 6) с додецилсульфатом натрия (SDS-ПААГ) (см. пример 4). В качестве контроля использовали полученный аналогичным способом лизат клеток E.coli штамма BL21/DE3(+), содержащий векторную плазмиду pET21.

Пример 4. Белковый электрофорез в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия (SDS-ПААГ).

Электрофорез проводили в разрешающем геле (состав: 30% акриламида; 1,5 M Tris (pH 8,8); 10% SDS; 10% аммония персульфата; TEMED (tetramethylethylenediamine) 1 мкл/мл) и концентрирующем геле (состав: 30% акриламида; 1M Tris (pH 6,8); 10% SDS; 10% аммония персульфата; TEMED 1 мкл/мл) в различных буферных растворах (верхний - 5Х трис-глициновый буферный раствор pH 8,3 (состав:1,25 мM Tris; 1,25 M глицина; 0,5 % SDS), нижний - 1Х трис-ацетатный буферный раствор pH 8,0 (состав: 40 мМ Tris-HCl; 40 мМ уксусной кислоты; 2 мМ EDTA (этилендиаминтетрауксусная кислота). Биологический материал смешивали с буферным раствором для нанесения, кипятили 5 минут и наносили в верхний концентрирующий гель. SDS-ПААГ вели при напряжении ~10В/см в концентрирующем геле, ~180В в разрешающем геле. Окраску гелей проводили при помощи раствора Кумасси G-250.

Пример 5. Очистка рекомбинантного белка NP-ВЭ в денатурирующих условиях.

Очистку рекомбинантного белка NP-ВЭ, содержащего полигистидиновый блок, проводили аффинной хроматографией на Ni-хеллатной смоле, согласно протоколу фирмы-производителя (Qiagen). Полученные клеточные лизаты штамма E.coli - продуцента и очищенный рекомбинантной белок анализировали методом белкового электрофореза по методу Лэммли (Laemmli UK. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. / Nature. 1970; 227(5259):680-685) в SDS-ПААГ. В качестве контроля использовали полученный аналогичным способом лизат клеток E.coli штамма BL21/DE3(+), содержавший векторную плазмиду pET21. Электрофоретическая подвижность в 6% SDS-ПААГ (см. пример 4) синтезируемого белка - 105 кДа не совпадала с теоретическими расчётами (84746,75 Да), что объясняется изменением подвижности областей 439-492 и 589-739 п.н. на 5 и 15 кДа соответственно (Watanabe S., Noda T., Kawaoka Y. et al. Functional mapping of the nucleoprotein of Ebola virus// J. Virol. 2006. V. 80. No. 8. P. 3743-3751.) Концентрацию рекомбинантного белка измеряли визуально по данным электрофореграммы (фиг. 6) и при помощи набора «Bio-Rad Protein Assay Kit» в соответствии с рекомендациями производителя на спектрофотометре при длине волны 495 нм и оценивали путем калибровки по овальбумину в 4 М растворе мочевины (pH 8,0).

В результате из 150 мл биомассы штамма E.coli-продуцента было получено 10 мл очищенного белка с концентрацией 6 мг/мл.

Электрофореграмма инактивированного ВЭ и очищенного белка NP-ВЭ представлена на фиг. 7.

Пример 6. Твердофазный иммуноферментный анализ (ТИФА).

Для проведения непрямого ТИФА использовали полистироловые планшеты (Nunk). Сенсибилизацию ячеек рекомбинантным белком NP-ВЭ (в концентрации 6 мкг/мл) или инактивированным препаратом ВЭ в разведении (1/1000) выполняли в объёме 100 мкл 0,05 М натрий-фосфатного буферного раствора (рН 8,0) с 4 М мочевины. Сорбцию проводили при 22°C в течение 18 часов. Дополнительную блокировку сорбционной активности осуществляли 1%-ным раствором казеина в ТСБ-Т (трис-солевой буфер с твином, содержащий 0,15M NaCl; 0,02M трис-HCl рН 7,4; 0,05% Твин-20) в течение 30 минут при 37°С. Затем раствор казеина удаляли и инкубировали антиген со специфическими антителами (мышиными, человеческими или козьими) в течение 1 часа при 37°С или 18 часов при 4°С в 0,5%-ном растворе казеина в ТСБ-Т. После трехкратной отмывки ТСБ-Т буфером в лунки добавляли по 100 мкл пероксидазного конъюгата антивидовых антител (Sigma) - Gout anti mouse, Gout anti human или белок G, меченный пероксидазой для козьих антител, в рабочих разведениях в 0,5%-ном растворе казеина в ТСБ-Т. Инкубировали 1 час при 37°С. Отмывку лунок осуществляли трехкратно с ТСБ-Т. Проявление проводили в течение 30 минут при 37°С с использованием жидкого субстрата на основе ТМБ (3,3’,5,5’-Tetramethylbenzidine). Блокировали реакцию добавлением 100 мкл 1 N HCl на каждую лунку и измеряли ОП субстратно-индикаторной смеси на спектрофотометре «Uniscan» при длине волны 450 нм. В качестве отрицательного контроля использовали инактивированный вирус Марбург (ВM, штамм Рорр) (сконцентрированный и очищеный из суспензии инфицированной культуры клеток Vero, инактивированный кипячением в течение 2 минут в растворе, содержащем 5% β-меркаптоэтанола и 1% додецилсульфата натрия (SDS) с дальнейшим прогреванием при 60°С в течение 1 часа, как описано для ВЭ (Чепурнов А.А., Мерзликин Н.В., Рябчикова Е.И. и др. Получение очищенного вируса Эбола. / Вопросы вирусологию 1994. Т.39. № 6. С. 254-257). В качестве положительного контроля для ВM использовали сыворотку крови человека, переболевшего лихорадкой Марбург (Никифоров В.В., Туровской Ю.И, Калинин П.П. и др. Случай лабораторного заражения лихорадкой Марбург. / Микробиология. 1994. № 3. С. 104-110).

Пример 7. Иммуноблоттинг.

Препараты рекомбинантного белка NP-ВЭ и инактивированного ВЭ после электрофореза переносили на нитроцеллюлозную мембрану («Millipore», США) на аппарате Transpor («LKB», Швеция) в течение 1,5 часов при напряжении 80 В в 0,025М трис-HCl буфере, содержащем 0,192 М глицина (рН 8,3) и 20% этанола. Места неспецифического связывания насыщали 1%-ным раствором казеина при 37°С в течение 2 часов в ТСБ-Т буфере (состав: трис-солевой буфер с твином, содержащий 0,15M NaCl; 0,02M трис-HCl рН 7,4; 0,05% твин-20). Затем мембрану, содержащую рекомбинантный и вирусные белки, инкубировали со специфическими антителами 4 часа при 20-22°С в буфере ТСБ-Т, содержащем 0,5% казеина. После отмывки в ТСБ-Т буфере мембраны обрабатывали антивидовыми антителами, меченными пероксидазой хрена (Sigma) - Gout anti mouse, Gout anti human или белок G, меченный пероксидазой для козьих антител в рабочих разведениях в 0,5%-ном растворе казеина в ТСБ-Т в течение 2-х часов при 37°С. Затем полоски мембраны промывали ТСБ-Т буфером и проявляли в растворе хромагена (1 мг/мл 3,3 диаминобензидин тетрагидрохлорида в 50 мМ трис-HCl буфере (pH 7,4), содержащем 0,145 М NaCl, 20% этанола и 0,03% перекиси водорода). Реакцию останавливали отмыванием полосок в дистиллированной воде. Специфическое взаимодействие антител с белками проявлялось в виде ярких коричневых полос.

Пример 8. Изучение иммуногенных и антигенных свойств рекомбинантного белка NP-ВЭ.

8.1. Иммунизация мышей рекомбинантным белком NP-ВЭ.

Для иммунизации использовали трех мышей линии Balb/c (самок весом 22 г) из вивария ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор». Схема иммунизации представлена в табл. 2. Общая доза антигена на одну мышь составила 90 мкг/мл. Кровь была взята посредством декапитации животных, усыпленных парами хлороформа, на 34-е сутки после первой иммунизации, соответственно.

Таблица 2. Схема иммунизации мышей линии Balb/c рекомбинантным белком NP-ВЭ

№ п/п	сутки иммунизации	концентрация белка (антигена) мкг/мышь	раствор для разведения антигена
1	0	30	50%-ный НАФ в физ. растворе
2	13	30	50%-ный ПАФ в физ. растворе
3	20	30	50%-ный ПАФ в физ. растворе
взятие крови	34

Примечание: исходная концентрация очищенного рекомбинантного белка NP ВЭ - 6 мг/мл; группа из трех мышей; метод иммунизации - внутрибрюшинный; НАФ - неполный адъювант Фрейнда (Difco); ПАФ - неполный адъювант Фрейнда.

8.2. Исследование иммуногенности рекомбинантного белка NP-ВЭ.

Титр антител в сыворотках крови иммунизированных мышей определяли методом ТИФА (см. пример 6), используя рекомбинантный антиген в рабочей концентрации 6 мкг/мл. Для подавления неспецифического сигнала связывания антител с рекомбинантным белком, сыворотки крови истощали лизатом клеток E.coli, полученным в разведении 1/1000. Как видно из результатов ТИФА, представленных на графике (фиг. 8), титр антител в сыворотках крови, собранных при декапитации трех мышей на 34-е сутки после иммунизации, на гомологичном антигене (рекомбинантном белке NP-ВЭ) составил более чем 1/204000.

8.3. Исследование антигенности рекомбинантного белка NP-ВЭ.

Антигенность препарата рекомбинантного белка NP-ВЭ как способность взаимодействовать со специфическими антителами в иммуноферментных реакциях была исследована методами ТИФА (см. пример 6) и иммуноблоттига (см. пример 7).

Например, на фиг. 8 представлен график титрования сыворотки крови трех мышей, иммунизированных рекомбинантным белком NP-ВЭ на инактивированном ВЭ. Титр антител составил 1/25600. Аналогичным образом антигенность рекомбинантного белка NP-ВЭ была исследована в ТИФА с антителами, специфичными к ВЭ.

На фиг. 9 представлен график титрования мышиных моноклональных антител (МКА), специфичных к инактивированному ВЭ и полученных как описано (Казачинская Е.И. Получение моноклональных антител и рекомбинантных белков для иммунодиагностики опасных инфекций человека. / Автореф. дисс. доктора биол. наук. Кольцово, 2010, 57 с.), на инактивированном ВЭ и рекомбинантном белке NP-ВЭ. Титр антител составил от 1/25600 до 1/102400, в зависимости от антигена. Специфичность взаимодействия подтверждается результатом иммуноблоттинга МКА с белками NP (фиг. 10).

На фиг. 11 представлен график титрования IgG козы, иммунизированной инфекционным ВЭ. Титр IgG козы составил на рекомбинантном белке NP-ВЭ и инактивированном ВЭ 1/51200, соответственно. Результат титрования сывороток крови десяти реконвалесцентов представлен в табл. 3. Титр антител составил от 1/400 до 1/12800, в зависимости от антигена. При этом наблюдался фон (в разведении от 1/50 до 1/200) перекрестного взаимодействия сывороток крови людей, переболевших ГЛЭ на инактивированном вирусе Марбург, а также перекрестное взаимодействие сыворотки рековалесцента (в разведении 1/100), переболевшего лихорадкой Марбург на инактивированном ВЭ. Эти результаты соотносятся с литературными данными о частичной гомологии N-концевой части нуклеопротеинов филовирусов и возможности перекреста антител, специфичных к нуклеопротеину филовирусов

(Sanchez A., Kiley M.P., Klenk H.D., Feldmann H. Sequence analysis of the Marburg virus nucleoprotein gene: comparison to Ebola virus and other non-segmented negative-strand RNA viruses. / J Gen Virol. 1992; 73 ( Pt 2):347-57; Natesan M., Jensen S.M., Keasey S.L. et al. Human Survivors of Disease Outbreaks Caused by Ebola or Marburg Virus Exhibit Cross-Reactive and Long-Lived Antibody Responses. / Clin Vaccine Immunol. 2016;23(8):717-24. doi: 10.1128/CVI.00107-16).

Таблица 3

Результат титрования в ТИФА сывороток крови людей, переболевших лихорадкой Эбола

№ п/п	антигены
вирус Эбола	рекомбинантный белок NP-ВЭ	вирус Марбург
1	1/3200	1/1600	1/100
2	1/400	1/800	<1/50
3	1/3200	1/1600	1/100
4	1/3200	1/3200	1/100
5	1/3200	1/800	1/100
6	1/1600	1/1600	1/50
7	1/3200	1/400	1/100
8	1/1600	1/800	1/100
9	1/3200	1/3200	1/100
10	1/12800	1/6400	1/200
11	1/100	<1/50	1/24300

Примечание: 1-10 - сыворотки крови реконвалесцентов, полученные от десяти здоровых пациентов в возрасте 25-60 лет в анамнезе серопозитивных по БВВЭ (ссылка в разделе «решение технического решения….». Титр антител определяли при средней арифметической значения ОП (при трехкратном повторе титрования) с учетом фона системы значение ОП = 0,15; положительным считали значение ОП в два раза и более выше ОП фона системы. В качестве отрицательного контроля антигена для титрования сывороток крови людей, переболевших БВВЭ использовали инактивированный вирус Марбург (ссылка в примере 6). 11 - в качестве положительного контроля для вируса Марбург использовали сыворотку крови человека, переболевшего лихорадкой Марбург (ссылка в примере 6). Антигены использованы в рабочем разведении 1/1000. Антивидовой конъюгат с пероксидазой Gout anti human (Sigma) использован в разведении 1/6000.

Методом иммуноблоттинга показано, что мышиные антитела, специфичные к рекомбинантному белку NP-ВЭ, узнают аналогичный вирусный белок в препарате инактивированного ВЭ (фиг. 12). Взаимодействие рекомбинантного белка NP-ВЭ с антителами (козьими и человеческими), специфичными к инфекционному ВЭ представлено на фиг. 13 и фиг. 14.

Таким образом, заявляемое техническое решение позволяет получить ДНК-конструкцию pET21-NPVE, кодирующую ген NP ВЭ. Трансформированная рекомбинантной плазмидой культура клеток E.coli BL21.DE3(+) при индукции IPTG осуществляет биосинтез полипетида с молекулярной массой 105 кДа. На N-конце рекомбинантный белок NP-ВЭ содержит полигистидиновый тракт для аффинной очистки. Данный подход позволяет получать высокоочищенный рекомбинантный белок NP-ВЭ, предназначенный для индукции в организме мышей линии Balb/c антител, узнающих в иммунохимических реакциях вирусный белок NP ВЭ, а также взаимодействующий с мышиными моноклональными антителами, поликлональными козьими и человеческими антителами, специфичными к инактивированному и инфекционному вирусу, соответственно (т.е. обладающий иммуногенными и антигенными свойствами).

ПРИЛОЖЕНИЕ

--->

Перечень последовательностей

<110> Федеральное бюджетное учреждение науки «Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора)

<120> Рекомбинантная плазмидная ДНК pЕТ21-NPVE, содержащая ген нуклеопротеина (NP) вируса Эбола и рекомбинантный белок NP-ВЭ, полученный в результате экспрессии гена NP вируса Эбола с использованием рекомбинантной плазмидной ДНК pЕТ21-NPVE и обладающий иммуногенными и антигенными свойствами

<160> SEQ ID NO 1

<210> SEQ ID NO:1

<211> 748

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Аминокислотная последовательность рекомбинантного белка NP-ВЭ, полученного в результате экспрессии гена нуклепротеина NP вируса Эбола (штамм Zaire, изолят Mayinga) в бактериальной системе экспрессии E.coli в составе рекомбинантной ДНК-конструкции pЕТ21-NPVE.

<400> 1

MDSRPQKIWM APSLTESDMD YHKILTAGLS VQQGIVRQRV IPVYQVNNLE 50

EICQLIIQAF EAGVDFQESA DSFLLMLCLH HAYQGDYKLF LESGAVKYLE 100

GHGFRFEVKK RDGVKRLEEL LPAVSSGKNI KRTLAAMPEE ETTEANAGQF 150

LSFASLFLPK LVVGEKACLE KVQRQIQVHA EQGLIQYPTA WQSVGHMMVI 200

FRLMRTNFLI KFLLIHQGMH MVAGHDANDA VISNSVAQAR FSGLLIVKTV 250

LDHILQKTER GVRLHPLART AKVKNEVNSF KAALSSLAKH GEYAPFARLL 300

NLSGVNNLEH GLFPQLSAIA LGVATAHGST LAGVNVGEQY QQLREAATEA 350

EKQLQQYAES RELDHLGLDD QEKKILMNFH QKKNEISFQQ TNAMVTLRKE 400

RLAKLTEAIT AASLPKTSGH YDDDDDIPFP GPINDDDNPG HQDDDPTDSQ 450

DTTIPDVVVD PDDGSYGEYQ SYSENGMNAP DDLVLFDLDE DDEDTKPVPN 500

RSTKGGQQKN SQKGQHIEGR QTQSRPIQNV PGPHRTIHHA SAPLTDNDRR 550

NEPSGSTSPR MLTPINEEAD PLDDADDETS SLPPLESDDE EQDRDGTSNR 600

TPTVAPPAPV YRDHSEKKEL PQDEQQDQDH TQEARNQDSD NTQSEHSFEE 650

MYRHILRSQG PFDAVLYYHM MKDEPVVFST SDGKEYTYPD SLEEEYPPWL 700

TEKEAMNEEN RFVTLDGQQF YWPVMNHKNK FMAILQHHQL EHHHHHH* 748

<---

1. Рекомбинантная плазмидная ДНК pET21-NPVE, предназначенная для экспрессии гена нуклеопротеина NP вируса Эбола (штамм Zaire, изолят Mayinga) в прокариотической системе E.coli и получения рекомбинантного белка NP-ВЭ, имеет размер 7593 п.н. и содержит в своем составе:

- ген bla (координаты с 599 по 1459 п.н.) в качестве генетического маркера, определяющего устойчивость к ампициллину клеток бактерии E.coli, трансформированных рекомбинантной плазмидой pET21-NPVE;

- участок начала репликации ori (координаты с 1630 по 2218 п.н.);

- промотор фага T7 (координаты с 5117 по 5135 п.н.), обеспечивающий экспрессию полноразмерного гена NP вируса Эбола в прокариотических клетках E.coli;

- лактозный репрессор (координаты с 3648 п.н. по 4730 п.н.) - ДНК-связывающий белок, который ингибирует экспрессию генов E.coli и обеспечивает экспрессию целевого рекомбинантного белка NP-ВЭ после добавления индуктора изопропил-β-D-1-тиогалактопиранозида (IPTG);

- уникальные сайты узнавания рестрикционными эндонуклеазами, имеющие следующие координаты: NheI (5209 п.н.) и XhoI (7432 п.н.);

- полноразмерный ген NP вируса Эбола (изолят Mayinga, штамм Zaire) 2217 п.н. (с 470 по 2686 нуклеотид геномной РНК), встроенный в экспрессионную кассету по сайтам рестрикции NheI (5209 п.н.) и XhoI (7432 п.н.), который кодирует 739 аминокислотных остатков (а.о.) вирусного нуклеопротеина;

- последовательность (18 п.н.), кодирующая полигистидиновый (6xHis) политракт из шести гистидинов на N-конце кодируемого белка для последующей очистки его с помощью метода аффинной Ni-хроматографии.

2. Рекомбинантный белок NP-ВЭ, полученный в результате экспрессии гена нуклепротеина NP вируса Эбола (штамм Zaire, изолят Mayinga) в бактериальной системе экспрессии E.coli в составе рекомбинантной ДНК-конструкции pET21-NPVE по п. 1 формулы, имеющий расчетную молекулярную массу 84457,42 Да, и аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1 длиной 748 а.о., включая 6xHis, и стоп-кодон, и обладающий иммуногенными, и антигенными свойствами, и предназначенный для индукции в организме мышей линии Balb/c антител, узнающих в иммунохимических реакциях вирусный белок NP-ВЭ, а также взаимодействующий с мышиными моноклональными антителами, поликлональными козьими и человеческими антителами, специфичными к инактивированному и инфекционному вирусу, соответственно.