Способ выявления влияния низкомолекулярных биологически активных соединений на взаимодействие антиген-антитело

Изобретение относится к медицинской биотехнологии. Изобретение представляет собой способ выявления влияния низкомолекулярных биологически активных соединений на взаимодействие антиген-антитело, заключающийся в количественной характеристике изменений в площади флуоресцирующих комплексов с использованием метода конфокальной микроскопии, отличающийся тем, что 10 мкл низкомолекулярного биологически активного соединения вносят в полистироловую пробирку с 50 мкл венозной крови, предварительно разведенной раствором FAX flow до содержания эритроцитов 1×10⁶/л, далее добавляют 10 мкл специфических к выбранному антигену антител, конъюгированных флуорохромным красителем, производят инкубацию в течение 20 минут в темном месте, перемешивают полученную смесь на вортексе, добавляют 2 мл раствора FAX flow и вновь перемешивают на вортексе, что составляет опытную пробу, контрольной пробой служит аналогичный раствор, не содержащий низкомолекулярного биологически активного соединения; затем выполняют конфокальную микроскопию опытного и контрольного образцов в режиме флуоресценции; выделяют кадр с флуоресцирующими комплексами; рассчитывают интенсивность пикселей кадра с флуоресцирующими комплексами по зеленому цвету, находят отношение интенсивности пикселей кадра с флуоресцирующими комплексами опытной и контрольной проб в процентах, значение интенсивности кадра с флуоресцирующими комплексами контрольной пробы принимают за 100%, при изменении отношения >35% по сравнению с контрольной пробой говорят о том, что исследуемое низкомолекулярное биологически активное соединение усиливает взаимодействие антиген-антитело, при изменении отношения <-35% по сравнению с контрольной пробой говорят о том, что исследуемое низкомолекулярное биологически активное соединение замедляет взаимодействие антиген-антитело, при изменении одного из отношений от -35% до 35% включительно говорят об отсутствии влияния выбранного низкомолекулярного биологически активного соединения на взаимодействие антиген-антитело. Изобретение позволяет количественно оценивать влияние низкомолекулярных биологически активных соединений на взаимодействие антиген-антитело. 4 ил.

 

Изобретение относится к биологии, медицине, а именно к фундаментальной и клинической биохимии, и позволяет количественно оценивать влияние низкомолекулярных биологически активных соединений на взаимодействие антиген-антитело.

Методы биоимаджинга позволяют наблюдать процессы на уровне молекул [1, 2]. Характерной особенностью этих методов является то, что они не нарушают относительное постоянство состава и свойства внутренней среды, а также процессы взаимодействия между молекулами, как на уровне целого организма, так и на субклеточном уровне. Тем не менее недостаточно изученным остается вопрос о достоверной оценке разницы влияния различных низкомолекулярных биологически активных соединений на взаимодействие антиген-антитело.

Известен способ оценки влияния низкомолекулярного биологически активного соединения на взаимодействие антиген-антитело, основанный на методе W. Marsh [3]. Суть способа заключается в постановке реакции агглютинации антиген-антитело с использованием эритроцитов, содержащих антигены, преинкубированных с низкомолекулярным биологически активным соединением, и стандартных сывороток, содержащих антитела к указанным антигенам, с последующей балльной оценкой от 12 до 0 интенсивности агглютинации [4].

Недостатком данного метода является субъективность оценки полученных результатов, ввиду того что оценка агглютинации производится визуально, высокая частота ложноположительных результатов, поскольку используется стандартная сыворотка, которая, однако, может содержать другие белковые компоненты, способные вызывать перекрестную реакцию с исследуемым антигеном.

Известен способ гетерогенного твердофазного иммуноферментного анализа [5], суть которого заключается в иммобилизации одного из участников реакции антиген-антитело на планшете и последующем добавлении второго участника реакции и их специфическом связывании с образованием окрашенного комплекса, по интенсивности изменения окраски раствора делается вывод о наличии или отсутствии комплекса антиген-антитело, а также производится расчет концентрации антигена или антитела в зависимости от применяемой методики.

Недостатком данного способа является наличие многих факторов, способных внести вклад во взаимодействие антиген-антитело, среди которых смена фаз при постановке методики, изменение температуры, применение химических реагентов, добавление дополнительных антител, связывающих сам комплекс антиген-антитело, что усложняет характеристику первичного комплекса антиген-антитело, затрудненность количественного описания образованных комплексов, высокая времязатратность большинства известных методик.

Известен способ сканирующей лазерной конфокальной микроскопии с применением флуоресцентных меток [6], суть которого заключается в визуализации антиген-антительных комплексов, основанном на связывании интересующего антигена со строго специфическим антителом, конъюгированным флуорохромным красителем. В зависимости от выбранного флуорохромного красителя в режиме флуоресценции при микроскопии наблюдаются светящиеся комплексы определенного цвета, отражающие интенсивность взаимодействия.

Недостатком данного способа является отсутствие унифицированного подхода для количественной оценки, сложность визуального сравнения влияния разных низкомолекулярных биологически активных соединений в виду отсутствия специализированных инструментов, позволяющих достоверно выявить разницу влияния метаболитов.

Целью является создание способа для выявления влияния низкомолекулярных биологически активных соединений на взаимодействие антиген-антитело.

Эта цель достигается тем, что 10 мкл низкомолекулярного биологически активного соединения вносят в полистироловую пробирку с 50 мкл венозной крови, предварительно разведенной раствором FAX flow до содержания эритроцитов 1×10⁶/л, далее добавляют 10 мкл специфичных к выбранному антигену антител, конъюгированных флуорохромным красителем, производят инкубацию в течение 20 минут в темном месте, перемешивают полученную смесь на вортексе, добавляют 2 мл раствора FAX flow и вновь перемешивают на вортексе, что составляет опытную пробу, контрольной пробой служит аналогичный раствор, не содержащий низкомолекулярного биологически активного соединения; затем выполняют конфокальную микроскопию опытного и контрольного образцов в режиме флуоресценции; выделяют кадр с флуоресцирующими комплексами; рассчитывают интенсивность пикселей кадра с флуоресцирующими комплексами по зеленому цвету, находят отношение интенсивности пикселей кадра с флуоресцирующими комплексами опытной и контрольной проб в процентах, значение интенсивности кадра с флуоресцирующими комплексами контрольной пробы принимают за 100%, при изменении отношения >35% по сравнению с контрольной пробой говорят о том, что исследуемое низкомолекулярное биологически активное соединение усиливает взаимодействие антиген-антитело, при изменении отношения <-35% по сравнению с контрольной пробой говорят о том, что исследуемое низкомолекулярное биологически активное соединение замедляет взаимодействие антиген-антитело, при изменении отношения от -35% до 35% включительно говорят об отсутствии влияния выбранного низкомолекулярного биологически активного соединения на взаимодействие антиген-антитело.

Предложенный способ позволяет стандартизировать процедуру обработки результатов, получить объективную оценку взаимодействия антиген-антитело, а также детализировать влияние отдельных низкомолекулярных биологически активных соединений на взаимодействие антиген-антитело. Нами была проведена серия экспериментов с применением низкомолекулярных биологически активных соединений (лактат, пируват, этанол, малат, оксалоацетат), антигенов А и В (эритроциты А(II) и В(III) по системе групп крови АВ0) и специфичных моноклональных конъюгированных антител, меченных флуоресцеинизотиоционатом (ФИТЦ) (Blood group A antigen (Z2A), Blood group В antigen (89-F)). Оценивали взаимодействие антиген-антитело при влиянии низкомолекулярных биологически активных соединений. В ходе эксперимента было эмпирически установлено, что предел измерений >35% и <-35% является точным для характеристики взаимодействия антиген-антитело, поскольку, по результатам наших исследований, заданный диапазон значений наиболее полно способствовал исключению низкомолекулярных биологически активных соединений и их концентраций, не влияющих на взаимодействие антиген-антитело, а также был удобен при необходимости оценки влияния низкомолекулярных биологических соединений в сложных случаях, когда изменение числа агглютинатов, определение которого предусматривается оригинальной методикой, менялось незначительно, однако интенсивность пикселей кадра с флуоресцирующими комплексами опытных проб в сравнении с контрольной пробой свидетельствовала о значительном изменении взаимодействия антиген-антитело.

Способ выявления влияния низкомолекулярных биологически активных соединений на взаимодействие антиген-антитело реализуют следующим образом:

Для определения влияния исследуемого низкомолекулярного биологически активного соединения на взаимодействие антиген-антитело 10 мкл низкомолекулярного биологически активного соединения вносят в полистироловую пробирку с 50 мкл венозной крови, предварительно разведенной раствором FAX flow до содержания эритроцитов 1×10⁶/л, далее добавляют 10 мкл специфических к выбранному антигену антител, конъюгированных флуорохромным красителем, производят инкубацию в течение 20 минут в темном месте, перемешивают полученную смесь на вортексе, добавляют 2 мл раствора FAX flow и вновь перемешивают на вортексе, что составляет опытную пробу, контрольной пробой служит аналогичный раствор, не содержащий низкомолекулярного биологически активного соединения; затем выполняют конфокальную микроскопию опытного и контрольного образцов в режиме флуоресценции; выделяют кадр с флуоресцирующими комплексами; рассчитывают интенсивность пикселей кадра с флуоресцирующими комплексами по зеленому цвету, находят отношение интенсивности пикселей кадра с флуоресцирующими комплексами опытной и контрольной проб в процентах, значение интенсивности кадра с флуоресцирующими комплексами контрольной пробы принимают за 100%, при изменении отношения >35% по сравнению с контрольной пробой говорят о том, что исследуемое низкомолекулярное биологически активное соединение усиливает взаимодействие антиген-антитело, при изменении отношения <-35% по сравнению с контрольной пробой говорят о том, что исследуемое низкомолекулярное биологически активное соединение замедляет взаимодействие антиген-антитело, при изменении одного из отношений от -35% до 35% включительно говорят об отсутствии влияния выбранного низкомолекулярного биологически активного соединения на взаимодействие антиген-антитело. Способ сопровождается лабораторными примерами.

Лабораторный пример №1.

Определение влияния пирувата в концентрации 2 мМ на взаимодействие антиген-антитело с применением эритроцитов А (II) группы крови по системе АВ0 и специфичных моноклональных конъюгированных антител Blood group A antigen (Z2A), меченных флуоресцеинизотиоционатом (ФИТЦ).

В качестве низкомолекулярного биологически активного соединения была выбрана молекула пирувата (Sigma, США), в качестве антигена А -эритроциты А (II) группы крови по системе АВ0, в качестве антитела - специфичные моноклональные конъюгированные антитела Blood group А antigen (Z2A), меченные флуоресцеинизотиоционатом (ФИТЦ) (Santa Cruz biotechnology, Inc., США). Вносили 10 мкл низкомолекулярного биологически активного соединения в полистироловую пробирку с 50 мкл венозной крови, которую разводили раствором FAX flow до содержания эритроцитов 1×10⁶/л, конечная концентрация низкомолекулярного биологически активного соединения составила 2 мМ, далее добавляли 10 мкл специфичных к выбранному антигену антител, конъюгированных флуорохромным красителем, производили инкубацию в течение 20 минут в темном месте, перемешивали полученную смесь на вортексе, добавляли 2 мл раствора FAX flow и вновь перемешивали на вортексе, что составляет опытную пробу, контрольной пробой служит аналогичный раствор, не содержащий низкомолекулярного биологически активного соединения; затем выполняли конфокальную микроскопию опытного и контрольного образцов в режиме флуоресценции на приборе Olympus IX 71 (Olympus, Япония), для возбуждения флуоресценции флуорохрома применяли лазер с длиной волны 488 нм, размер полученных микроснимков составлял 400×400 мкм, разрешение - 400 нм на пиксель.

Выделяли кадр с флуоресцирующими комплексами; рассчитывали интенсивность пикселей кадра с флуоресцирующих комплексами по зеленому цвету для пробы, содержащей пируват в концентрации 2 мМ и контрольной пробы (Фигура 1, А, Б). На фигуре 1А показано взаимодействие Антигена А с моноклональным анти-А антителом, что составило контрольную пробу, на фигуре 1Б представлено взаимодействие Антигена А с моноклональным анти-А антителом при добавлении пирувата в конечной концентрации 2 мМ. Производили расчет отношения интенсивности пикселей кадра с флуоресцирующими комплексами опытной пробы к контрольной, где значение контрольной пробы принимали за 100% (Таблица 1). Изменение отношения составило 69%, что входит в диапазон значений >35% и свидетельствует об усилении взаимодействия антиген-антитело с применением эритроцитов А (II) группы крови по системе АВ0 и специфичных моноклональных конъюгированных антител Blood group A antigen (Z2A), меченных флуоресцеинизотиоционатом (ФИТЦ) в присутствии пирувата в концентрации 2 мМ.

Лабораторный пример №2.

Определение влияния пирувата в коцентрации 2 мМ на взаимодействие антиген-антитело с применением эритроцитов В (III) группы крови по системе АВ0 и специфичных моноклональных конъюгированных антител Blood group В antigen (89-F), меченных флуоресцеинизотиоционатом (ФИТЦ).

В качестве низкомолекулярного биологически активного соединения была выбрана молекула пирувата (Sigma), в качестве антигена В - эритроциты В (III) группы крови по системе АВ0, в качестве антитела - специфичные моноклональные конъюгированные антитела Blood group В antigen (89-F), меченные флуоресцеинизотиоционатом (ФИТЦ) (Santa Cruz biotechnology, Inc., США). Вносили 10 мкл низкомолекулярного биологически активного соединения в полистироловую пробирку с 50 мкл венозной крови, которую разводили раствором FAX flow до содержания эритроцитов 1×106/л, конечная концентрация низкомолекулярного биологически активного соединения составила 2 мМ, далее добавляли 10 мкл специфичных к выбранному антигену антител, конъюгированных флуорохромным красителем, производили инкубацию в течение 20 минут в темном месте, перемешивали полученную смесь на вортексе, добавляли 2 мл раствора FAX flow и вновь перемешивали на вортексе, что составляет опытную пробу, контрольной пробой служит аналогичный раствор, не содержащий низкомолекулярного биологически активного соединения; затем выполняли конфокальную микроскопию опытного и контрольного образцов в режиме флуоресценции на приборе Olympus IX 71 (Olympus, Япония), для возбуждения флуоресценции флуорохрома применяли лазер с длиной волны 488 нм, размер полученных микроснимков составлял 400×400 мкм, разрешение - 400 нм на пиксель.

Выделяли кадр с флуоресцирующими комплексами; рассчитывали интенсивность пикселей кадра с флуоресцирующих комплексами по зеленому цвету для пробы, содержащей пируват в концентрации 2 мМ и контрольной пробы (Фигура 2, А, Б). На фигуре 2А показано взаимодействие Антигена В с моноклональным анти-В антителом, что составило контрольную пробу, на фигуре 2Б представлено взаимодействие Антигена В с моноклональным анти-В антителом при добавлении пирувата в конечной концентрации 2 мМ. Производили расчет отношения интенсивности пикселей кадра с флуоресцирующими комплексами опытной пробы к контрольной, где значение контрольной пробы принимали за 100% (Таблица 2). Изменение отношения составило -42%, что входит в диапазон значений <-35% и свидетельствует о замедлении взаимодействия антиген-антитело с применением эритроцитов В (III) группы крови по системе АВ0 и специфичных моноклональных конъюгированных антител Blood group В antigen (89-F), меченных флуоресцеинизотиоционатом (ФИТЦ) в присутствии пирувата в концентрации 2 мМ.

Лабораторный пример №3.

Определение влияния лактата в концентрации 2 мМ на взаимодействие антиген-антитело с применением эритроцитов А (II) и В (III) групп крови по системе АВ0 и специфичных моноклональных конъюгированных антител Blood group A antigen (Z2A), Blood group В antigen (89-F), меченных флуоресцеинизотиоционатом (ФИТЦ).

В качестве низкомолекулярного биологически активного соединения была выбрана молекула лактата (Sigma), в качестве антигена А и В - эритроциты А (II) и В (III) групп крови по системе АВО соответственно, в качестве антител - специфичные моноклональные конъюгированные антитела Blood group A antigen (Z2A), Blood group В antigen (89-F), меченные флуоресцеинизотиоционатом (ФИТЦ) (Santa Cruz biotechnology, Inc., США). Вносили 10 мкл низкомолекулярного биологически активного соединения в полистироловую пробирку с 50 мкл венозной крови, которую разводили раствором FAX flow до содержания эритроцитов 1×10⁶/л, конечная концентрация низкомолекулярного биологически активного соединения составила 2 мМ, далее добавляли 10 мкл специфичных к выбранному антигену антител, конъюгированных флуорохромным красителем, производили инкубацию в течение 20 минут в темном месте, перемешивали полученную смесь на вортексе, добавляли 2 мл раствора FAX flow и вновь перемешивали на вортексе, что составляет опытную пробу, контрольной пробой служит аналогичный раствор, не содержащий низкомолекулярного биологически активного соединения; затем выполняли конфокальную микроскопию опытного и контрольного образцов в режиме флуоресценции на приборе Olympus IX 71 (Olympus, Япония), для возбуждения флуоресценции флуорохрома применяли лазер с длиной волны 488 нм, размер полученных микроснимков составлял 400×400 мкм, разрешение - 400 нм на пиксель.

Выделяли кадр с флуоресцирующими комплексами; рассчитывали интенсивность пикселей кадра с флуоресцирующих комплексами по зеленому цвету для пробы, содержащей лактат в концентрации 2 мМ и контрольной пробы (Фигуры 3, А, Б и Фигура 4 А, Б). На фигуре 3А показано взаимодействие Антигена А с моноклональным анти-А антителом, что составило контрольную пробу, на фигуре 3Б представлено взаимодействие Антигена А с моноклональным анти-А антителом при добавлении лактата в конечной концентрации 2 мМ. На фигуре 4А показано взаимодействие Антигена В с моноклональным анти-В антителом, что составило контрольную пробу, на фигуре 4Б представлено взаимодействие Антигена В с моноклональным анти-В антителом при добавлении лактата в конечной концентрации 2 мМ. Производили расчет отношения интенсивности пикселей кадра с флуоресцирующими комплексами опытной пробы к контрольной, где значение контрольной пробы принимали за 100% (Таблицы 3 и 4). Изменения отношений составили 22% для А (II) группы крови по системе АВ0 и 2,5% для В (III) группы крови по системе АВ0, что входив в диапазон значений от 35% до -35% и свидетельствует об отсутствии влияния лактата в концентрации 2 мМ на взаимодействие антиген-антитело с применением эритроцитов А (II) группы крови по системе АВ0 и специфичных моноклональных конъюгированных антител Blood group A antigen (Z2A), меченных флуоресцеинизотиоционатом (ФИТЦ) и взаимодействие антиген-антитело с применением эритроцитов В (III) группы крови по системе АВ0 и специфичных моноклональных конъюгированных антител Blood group В antigen (89-F), меченных флуоресцеинизотиоционатом (ФИТЦ).

Способ выявления влияния низкомолекулярных биологически активных соединений на взаимодействие антиген-антитело может быть использован в фундаментальных и клинических исследованиях, в области метаболомики, протеомики, иммунологии, а также при разработке лекарственных препаратов на основе низкомолекулярных биологически активных соединений, способных избирательно повышать или снижать степень антиген-антительного взаимодействия.

Источники информации

1. Riezzo I. Confocal laser scanning microscope, Raman microscopy and Western blotting to evaluate inflammatory response after myocardial infarction / I. Riezzo, S. Cantatore, D. DeCarlo, C. Fiore // Curr Vase Pharmacol. - 2015. - Vol. 13(1). - P. 78-90.

2. Barizuddin S. Highly specific and rapid immuno-fluorescent visualization and detection of E. coli O104:H4 with protein-A coated magnetic beads based LST-MUG assay / S. Barizuddin, B. Balakrishnan, R.C. Stringer, M. Dweik // J Microbiol Methods. - 2015. - Vol. 115. - P. 27-33.

3. Marsh, W.L. Scoring of hemagglutination reactions / W.L. Marsh // Transfusion. - 1972. - Vol. 12(5). - P. 352-353.

Способ выявления влияния низкомолекулярных биологически активных соединений на взаимодействие антиген-антитело, заключающийся в количественной характеристике изменений в площади флуоресцирующих комплексов с использованием метода конфокальной микроскопии, отличающийся тем, что 10 мкл низкомолекулярного биологически активного соединения вносят в полистироловую пробирку с 50 мкл венозной крови, предварительно разведенной раствором FAX flow до содержания эритроцитов 1×10⁶/л, далее добавляют 10 мкл специфических к выбранному антигену антител, конъюгированных флуорохромным красителем, производят инкубацию в течение 20 минут в темном месте, перемешивают полученную смесь на вортексе, добавляют 2 мл раствора FAX flow и вновь перемешивают на вортексе, что составляет опытную пробу, контрольной пробой служит аналогичный раствор, не содержащий низкомолекулярного биологически активного соединения; затем выполняют конфокальную микроскопию опытного и контрольного образцов в режиме флуоресценции; выделяют кадр с флуоресцирующими комплексами; рассчитывают интенсивность пикселей кадра с флуоресцирующими комплексами по зеленому цвету, находят отношение интенсивности пикселей кадра с флуоресцирующими комплексами опытной и контрольной проб в процентах, значение интенсивности кадра с флуоресцирующими комплексами контрольной пробы принимают за 100%, при изменении отношения >35% по сравнению с контрольной пробой говорят о том, что исследуемое низкомолекулярное биологически активное соединение усиливает взаимодействие антиген-антитело, при изменении отношения <-35% по сравнению с контрольной пробой говорят о том, что исследуемое низкомолекулярное биологически активное соединение замедляет взаимодействие антиген-антитело, при изменении одного из отношений от -35% до 35% включительно говорят об отсутствии влияния выбранного низкомолекулярного биологически активного соединения на взаимодействие антиген-антитело.