Рекомбинантная плазмидная днк pet21-vp40ve, содержащая ген матриксного белка vp40 вируса эбола и рекомбинантный белок vp40-вэ, полученный в результате экспрессии гена белка vp40 вируса эбола с использованием рекомбинантной плазмидной днк pet21-vp40ve и обладающий иммуногенными и антигенными свойствами

Изобретение относится к биотехнологии, медицине и молекулярной биологии, в частности к конструированию in vitro ДНК-конструкции pET21-VP40VE, содержащей ген матриксного белка VP40 вируса Эбола (штамм Zaire, изолят Mayinga) и рекомбинантному белку VP40-ВЭ, обладающему иммуногенными и антигенными свойствами. Рекомбинантная плазмидная ДНК pET21-VP40VE предназначена для экспрессии гена матриксного белка VP40 вируса Эбола (штамм Zaire, изолят Mayinga) в прокариотической системе E.coli и получения рекомбинантного белка VP40-VE, которая имеет размер 6366 п.н. и содержит в своем составе: ген bla (координаты с 599 по 1459 п.н.) в качестве генетического маркера, определяющего устойчивость к ампициллину клеток бактерии E.coli (BL21/DE3(+), трансформированных рекомбинантной плазмидой pET21-VP40VE; участок начала репликации ori (координаты с 1630 по 2218 п.н.); промотор фага T7 (координаты с 5117 по 5135 п.н.); лактозный репрессор (координаты с 3648 п.н. по 4730 п.н.); ДНК-связывающий белок, который ингибирует экспрессию генов E.coli и обеспечивает экспрессию целевого рекомбинантного белка VP40-ВЭ; уникальные сайты узнавания рестрикционными эндонуклеазами, имеющие следующие координаты: NheI (5204 п.н.) и XhoI (6205 п.н.); ген VP40 ВЭ (штамм Zaire, изолят Mayinga) (981п.н.), встроенный в экспрессионную кассету по сайтам рестрикции NheI (5204 п.н.) и XhoI (6205 п.н.) (с 4479 по5459 нуклеотид геномной РНК), который кодирует 327 аминокислотных остатков (а.о.) вирусного матриксного белка VP40; последовательность (18 п.н.), кодирующая полигистидиновый (6xHis) политракт из шести гистидинов на N-конце кодируемого белка для последующей очистки его с помощью метода аффинной Ni-хроматографии. Рекомбинантный белок VP40-ВЭ получен в результате экспрессии гена матриксного белка VP40 вируса Эбола (штамм Zaire, изолят Mayinga) в бактериальной системе экспрессии E.coli в составе рекомбинантной ДНК-конструкции pET21-VP40VE, имеющий молекулярную массу 36114,68 Да и аминокислотную последовательность SEQ ID NO:1 длиной 333 а.о., включая 6 гистидинов и стоп-кодон, и обладающий иммуногенными и антигенными свойствами и предназначенный для индукции в организме мышей линии Balb/c антител, узнающих в иммунохимических реакциях вирусный белок VP40-BE, а также взаимодействующий с мышиными моноклональными антителами, поликлональными козьими и человеческими антителами, специфичными к инактивированному и инфекционному вирусу Эбола. Изобретение позволяет повысить выход целевого рекомбинантного матриксного белка VP40-ВЭ. 2 н.п. ф-лы, 14 ил., 3 табл., 8 пр.

 

Изобретение относится к области медицины, биотехнологии и молекулярной биологии, в частности к конструированию in vitro ДНК-конструкции pET21-VP40VE, содержащей ген матриксного белка VP40 вируса Эбола (штамм Zaire, изолят Mayinga) и рекомбинантному белку VP40-ВЭ, обладающему иммуногенными и антигенными свойствами, т.к. вызывает в организме иммунизированных мышей линии Balb/c синтез антител, узнающих нативный матриксный белок VP40 в инактивированном препарате вируса Эбола в иммунохимических реакциях в формате ИФА и имунноблоттинга.

Вирус Эбола (ВЭ) относится, к семейству Filoviridae, как и вирус Марбург (ВМ). Оба вируса эндемичны для стран Африки и очень опасны для человека. Геномы филовирусов представлены несегментированной негативной одноцепочечной РНК и имеют длину приблизительно 19000 пар нуклеотидов, состоят из 7 расположенных по порядку генов: 3’ leader- NP - VP35 - VP40 - GP - VP30 - VP24 - L-5’- trailer, кодирующих соответствующие структурные белки - нуклеопротеин (NP), кофактор вирусной полимеразы (VP35), матриксный (VP40), структурный гликопротеин оболочки (GP) и дополнительно только у ВЭ - секреторный (sGP), минорный нуклеопротеин (VP30), мембранно-ассоциированный (VP24) и РНК-зависимую РНК полимеразу (L) (Bukreyev A.А. Characteristics of Filoviridae: Marburg and Ebola Viruses. / Naturwissenschaften. 1999; 86:8-17). На настоящее время известно пять штаммов ВЭ: Zaire ebolavirus (EBOV), Taï Forest ebolavirus (TAFV), Reston ebolavirus (RESTV), Sudan ebolavirus (SUDV) и Bundibugyo ebolavirus (BDBV) (Se-Ran Jun Michael R. Leuze, Intawat Nookaew, Edward C. Uberbacher et al/ Ebolavirus comparative genomics. / FEMS Microbiol Rev. 2015; 39(5): 764-778. Published online 2015 Jul 14.doi: 10.1093/femsre/fuv031). В штаммах ВЭ подразделяют изоляты по географическому району и/или году выделения, например, Zaire ebolavirus: Ebola virus - Eckron (Zaire, 1976); Ebola virus - Gabon (1994-1997); Ebola virus - Mayinga, Zaire, 1976; Ebola virus - Zaire (1995); Zaire ebolavirus Makona (2014); Tai Forest virus: Cote d'Ivoire (1994); Reston ebolavirus: Reston (1989) и Siena/Philippine-92; Sudan ebolavirus: Yambio0401, 0402 и 0403, Maleo (1979), Nakisamata, Uganda (2000), Boniface (Sudan,1976) (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/Browser/wwwtax.cgi?id=186538).

Болезнь, вызванная вирусом Эбола (БВВЭ) у приматов и людей характеризуется тяжелым течением, общей интоксикацией и высоким уровнем летальности среди заболевших - до 90%. (Beer B., Kurth R., Bukreyev A. Characteristics of Filoviridae: Marburg and Ebola viruses. / Naturwissenschaften. 1999; 86 (1):8-17.DOI: 10.1007/s001140050562). Одна из последних вспышек БВВЭ в 2013-2016 гг. в Западной Африке стала причиной 28616 случаев заболевания и из них 11310 со смертельным исходом (World Health Organization. Ebola Situation Report - June 10, 2016. 2016. Available: http://apps.who.int/iris/bitstream/10665/208883/1/ebolasitrep_10Jun2016_eng.pdf?ua=1. Accessed: 26 March 2017). Всемирный банк оценивает потери ВВП от БВВЭ до 2015 г. в Гвинеи, Либерии и Сьерра-Леоне в 2,8 млрд долларов США (World Bank Group. 2014-2015 West Africa Ebola Crisis: Impact Update. May 10, 2016. Available: http://pubdocs.worldbank.org/en/297531463677588074/Ebola-Economic-Impact-and-Lessons-Paper-short-version.pdf. Accessed: 24 April 24 2018). В 2018 г. в Демократической Республике Конго (ДРК, ранее называемая Заир) на фоне гражданской войны началась новая вспышка БВВЭ (Barry A, Ahuka-Mundeke S, Ali Ahmed Y et al. Outbreak of Ebola virus disease in the Democratic Republic of the Congo, April-May, 2018: an epidemiological study. / Lancet. 2018;392(10143):213-221. doi: 10.1016/S0140-6736(18)31387-4), в связи с чем может произойти неконтролируемое распространение ВЭ в другие страны с потоком беженцев (Cohen J. Worries about Ebola outbreak grow, despite use of vaccine. / Science. 2018;362(6420):1225), т.к. доказана длительная персистенция филовирусов в репродуктивном тракте выживших мужчин (Schindell B.G., Webb A.L., Kindrachuk J. Persistence and Sexual Transmission of Filoviruses. / Viruses. 2018;10(12). pii: E683. doi: 10.3390/v10120683). ВЭ распространяется от человека к человеку через прямой контакт с биологическими жидкостями. По данным ВОЗ, самыми заразными являются кровь, кал и рвотные массы заболевших. Вирус выявляли в моче, слизи носоглотки, грудном молоке, сперме, вагинальном секрете, слюне и поте (инфекционный на культуре клеток или его РНК методом ОТ-ПЦР). Наличие крови в биологической жидкости усиливает вероятность инфицирования (Пакскина. Н. Д.. Шиянова А. Е, Дмитриева Л. Н. и др. Мероприятия в отношении лиц, контактировавших с больным лихорадкой Эбола. / Проблемы особо опасных инфекций. № 3, 2015. С. 33-38). Недавно описан случай зачатия от мужчины, инфицированного ВЭ. Беременная женщина не заболела, но анализ тканей плода, погибшего на 36 недели, показал наличие вируса в его тканях (Okoror L, Kamara A, Kargbo B et al. Transplacental transmission: A rare case of Ebola virus transmission. / Infect Dis Rep. 2018;10(3):7725. doi: 10.4081/idr.2018.7725).

Распространению ВЭ может способствовать туристический поток в страны Африки, а также контакт с дикими и домашними животными. Рукокрылые (летучие мыши) вида Egyptian rousettes (Rousettus aegyptiacus) могут быть носителями филовирусов, загрязняя испражнениями фрукты, которыми питаются. Кроме того, эти животные являются объектом охоты и используются в пищу (Paweska J. T., Storm N., Grobbelaar A.A., Markotter W. et al. Experimental inoculation of Egyptian fruit bats (Rousettus aegyptiacus) with Ebola virus. / Viruses. 2016; 8(2): 29.doi:10.3390/v8020029). Экспериментально доказан аэрозольный путь инфицирования ВЭ как приматов (Johnson E., Jaax N., White J. Lethal experimental infection of rhesus monkeys by aerosolized Ebola virus. / Int J Exp Pathol.1995; 76 (4):227-236.PMCID: PMC1997182) так и обычных домашних свиней (Kobinger G.P., Leung A., Neufeld J. et al. Replication, pathogenicity, shedding, and transmission of Zaire ebolavirus in pigs. / J Infect Dis. 2011; 204 (2):200-8. doi: 10.1093/infdis/jir077). Продемонстрирована межвидовая передача ВЭ от инфицированных свиней обезьянам (Weingartl H.M., Embury-Hyatt C., Nfon C. et al. Transmission of Ebola virus from pigs to non-human primates. / Sci Rep. 2012;2:811. doi: 10.1038/srep00811) и способность вируса реплицироваться в клетках змеи (Fedewa G., Radoshitzky S.R., Chī X. et al. Ebola virus, but not Marburg virus, replicates efficiently and without required adaptation in snake cells. / Virus Evol. 2018;4(2):vey034. doi: 10.1093/ve/vey034).

Специфическая иммунопрофилактика БВВЭ длительное время (начиная с первых вспышек в 1976 г. в Африке) не была разработана в связи с неэффективностью инактивированных вирусных препаратов (Lupton HW, Lambert RD, Bumgardner DL et al. Inactivated vaccine for Ebola virus efficacious in guinea pig model. / Lancet. 1980;(2):1294-1295; Чепурнов А.А., Чернухин И.В., Терновой В.А. и др. Попытка получения вакцины против лихорадки Эбола. / Вопросы вирусол. 1995;(6):257-260). В настоящее время разрешенные к применению на людях вакцины основаны на препаратах, индуцирующих синтез антител, специфичных к наружному структурному гликопротеину (GP) (Anywaine Z., Whitworth H., Kaleebu P.et al. Randomized clinical trial examining safety and immunogenicity of heterologous prime-boost Ebola vaccines, Ad26.ZEBOV and MVA-BN-Filo: 12-month data from Uganda and Tanzania. / J Infect Dis. 2019 Feb 23. pii: jiz070. doi: 10.1093/infdis/jiz070). Наиболее часто используемая вакцинная платформа - это рекомбинантный аденовирус человека серотипа 5 (rAd5), дефектный по репликативному циклу (Venkatraman N., Silman D., Folegatti PM. et al. Vaccines against Ebola virus. / Vaccine. 2018;36(36):5454-5459. doi: 10.1016/j.vaccine.2017.07.054). Но исследования по разработке вакцин продолжаются, например, на основе вирусоподобных частиц (virus-like particle, VLPs), которые структурно имитируют аутентичные вирионы, но не содержат генетического материала. Поэтому такие препараты не являются инфекционными и более безопасны чем репликативные вакцины (Park E.M., Park S.W., Lee Y.J. et al. Production of Ebola virus-like particles in Drosophila melanogaster Schneider 2 cells. / J Virol Methods. 2018;261:156-159. doi: 10.1016/j.jviromet.2018.08.016).

Матриксный белок VP40 филовирусов играет ключевую роль в процессе почкования вирионов. Ранее было показано, что экспрессия полноразмерного гена VP40 ВЭ, клонированного в составе экспрессионного вектора, после трансфекции клеток приводит к выходу вирусоподобных частиц, состоящих только из одного этого белка (Noda T., Sagara H., Suzuki E. et al. Ebola virus VP40 drives the formation of virus-like filamentous particles along with GP. / Virology Journal. 2002; 76 (10):4855-65). Показано также, что белок VP40 не только самостоятельно формирует VLPs, но и повышает их выход при ко-экспрессии с другими генами при трансфекции эукариотических клеток 293Т и COS-1. Комбинация белка VP40 с GP или с NP в 5 раз увеличивала выход VLPs. Сочетание VP40+GP+NP обеспечивало максимальный урожай VLPs ВЭ (Licata J., Johnson R.F., Han Z. Et al. Contribution of Ebola virus glycoprotein, nucleoprotein, and VP24 to budding of VP40 virus-like particles. / J Virol. 2004; 78 (14):7344-51. doi: 10.1128/JVI.78.14.7344-7351.2004). Недавно описана кандидатная вакцина на основе VLPs вируса вакцины, экспрессирующих сочетано гены GP и VP40 (Lázaro-Frías A., Gómez-Medina S., Sánchez-Sampedro L. et al. Distinct Immunogenicity and Efficacy of Poxvirus-Based Vaccine Candidates against Ebola Virus Expressing GP and VP40 Proteins. / J Virol. 2018;92(11). pii: e00363-18. doi: 10.1128/JVI.00363-18).

Ранняя лабораторная диагностика имеет решающее значение для предотвращения распространения ВЭ. В сыворотке крови пациентов с диагнозом БВВЭ антиген ВЭ может быть обнаружен на третий день после начала заболевания и его концентрация достигает 10⁶-10⁸ вирусных частиц в миллилитре (Rowe A.K., Bertolli J., Mukunu R. et al. Clinical, virologic and immunologic follow up of convalescent Ebola haemorrhagic fever patients and their household contacts, Kikwit Democratic Republic of the Congo. / Infect. Dis, 1999;179:28-35). Белок VP40 является мажорным протеином, что соответствует значительному содержанию его в вирионе - 37,7 % (Elliott LH, Kiley MP, McCormick JB. Descriptive analysis of Ebola virus protein. / Virology. 1985; 147(1):169-176). Методом иммуноблоттинга было показано, что антитела, специфичные к филовирусным белкам NP и VP40, появляются в крови переболевших обезьян и людей (Becker S., Feldmann H., Will C. et al. Evidence for occurrence of filovirus antibodies in humans and imported monkeys: do subclinical filovirus infections occur worldwide? / Med Microbiol Immunol. 1992;181(1):43-55). Было обнаружено, что у пациентов, оставшихся в живых во время вспышки БВВЭ в 1996 г. в Габоне, в сыворотке крови, на фоне циркуляции вируса, рано появлялись и количественно увеличивались IgG, преимущественно против белков NP и VP40 (Baize S., Leroy E.M., Georges-Courbot M.C. et al. Defective humoral responses and extensive intravascular apoptosis are associated with fatal outcome in Ebola virus-infected patients. / Nat Med. 1999; 5(4):423-426). Сыворотки крови людей, переболевших БВВЭ, (186 проб) были собраны в Уганде в 2000-2010 гг. и хранились в вирусологическом исследовательском институте (Уганда, г. Энтеббе). Для оценки профиля противовирусных антител, появляющихся в течение естественной инфекции у выживших людей в ИФА использовали рекомбинантные белки GP, VP30, NP и VP40 ВЭ (штамм Sudan), полученные в эукариотической системе экспрессии в клетках почки эмбриона человека (линия 293Т). Соотношение антител по специфичности распределилось следующим образом: к NP, GP, VP30 и VP40 - 115/186, 97/186, 79/186 и 43/186, соответственно. Соотношение нейтрализующих сывороток крови к не нейтрализующим, содержащих антитела, специфичные к трем белкам - GP, NP и VP40, было примерно 50/50. Важно отметить, что в сыворотках крови наличие антител, специфичных к гликопротеину (GP), не всегда обеспечивало нейтрализацию ВЭ на культуре клеток Vero (Sobarzo A., Perelman E.,Groseth A., et al. Profiling the native specific human humoral immune response to Sudan Ebola virus strain Gulu by chemiluminescence enzyme-linked immunosorbent assay. / Clin Vaccine Immunol. 2012;19(11):1844-52. doi: 10.1128/CVI.00363-12).

В перечень тест-систем, одобренных ВОЗ или FDA (Food and Drug Administration, Управление по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов США) для диагностики БВВЭ, входят ПЦР формата RT (в реальном времени), в которых используются праймеры, специфичные к генам L, GP, NP и VP40 ВЭ и два теста ИХА, выявляющие белок VP40, а также один тест ИХА для одновременного выявления трех белков - GP, NP и VP40 (Broadhurst M.J., Brooks T.J., Pollock NR. Diagnosis of Ebola Virus Disease: Past, Present, and Future. / Clin Microbiol Rev. 2016;29(4):773-93. doi:10.1128/CMR.00003-16).

В РФ зарегистрированы наборы реагентов для определения РНК ВЭ (Zaire) в биологическом материале методом ПЦР для диагностики in vitro «АмплиСенс® EBOV Zaire-FL»по ТУ 9398-232-01897593-2014», производства ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора. (http://doctorpiter.ru/articles/10390) и набор реагентов для амплификации кДНК ВЭ (Zaire, Sudan) с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме реального времени (для приборов Rotor-Gene 6000/3000) «Вектор-ПЦР_РВ-Эбола-RG» № РЗН 2013/1322, производства ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» (http://www.vector.nsc.ru/katalog-produktsii-fbun-gnts-vb).

Иммуноферментные тест-системы в формате ИФА или ИХА для диагностики БВВЭ (выявления специфических антител) или выявления антигенов (вирусных маркеров) в РФ не зарегистрированы или коммерчески не доступны.

Описано получение рекомбинантного белка VP40 ВЭ в эукариотической системе экспрессии его гена в культуре клеток раковой опухоли шейки матки (линия Hela). С помощью моноклональных антител (МКА) была исследована локализация белка при трансфекции этих клеток плазмидами, содержащими гены VP40 ВЭ и полимеразы фага Т7 (Luch A, Grunov R, Moller P. et al. Development, characterization and use of monoclonal VP40-antibodies for the detection of Ebola virus. / Virological Methods. 2003. 111:21-28). За рубежом экспресс-диагностика БВВЭ в формате ИХА разработана на основе МКА, выявляющих белки GP и VP40 ВЭ. Для получения МКА использовали рекомбинантные белки, полученные в эукариотической системе экспрессии в клетках линии 293Т (Boisen M.L., Oottamasathien D., Jones A.B. et al. Development of Prototype Filovirus Recombinant Antigen Immunoassays. / J Infect Dis. 2015;212 Suppl 2:S359-67. doi: 10.1093/infdis/jiv353). Описан способ получения рекомбинантной плазмидной ДНК, обеспечивающей экспрессию гена VP40 ВЭ и получение в клетках E.coli рекомбинантного белка VP40, который был использован в ИФА в качестве положительного контроля на антиген (Kalstrom G., Warfield K.L., Swenson D.L. et al. Analysis of Ebola virus and VLP release using an immunocapture assay. / Virological Methods. 2005. 127(1):1-9). Для выявления специфических человеческих антител разработан микрочип на основе рекомбинантных белков GP, NP и VP40 ВЭ (штаммы Zaire, Sudan, Bundibugyo, Tai Forest, Reston), полученных в прокариотической системе экспрессии E.coli (BL21-AI) и содержащих полигистидиновый тракт. Рекомбинантные белки были очищены методом аффинной хромотографии до 80-95% чистоты (концентрация очищенных белков не указана). Показано, что титры антител убывали по их специфичности от NP до VP40 и GP, соответственно (Natesan M., Jensen S.M., Keasey S.L. et al. Human Survivors of Disease Outbreaks Caused by Ebola or Marburg Virus Exhibit Cross-Reactive and Long-Lived Antibody Responses. Clin Vaccine Immunol. 2016;23(8):717-24. doi: 10.1128/CVI.00107-16). При использовании рекомбинантных белков GP, VP40 и NP, полученных в прокариотической системе экспрессии E.coli (BLR (DE3) при клонировании последовательности изолята Makona ВЭ (штамм Zaire) в векторе pET15bLFn, для стимуляции мононуклеарных клеток периферической крови, методом спот анализа (enzyme-linked immunospot assay, ELISPOT), было показано, что высокий Т-клеточный ответ вызывают все эти белки. Авторы считают, что полученные данные важны для разработки эффективных вакцин, вызывающих сбалансированный иммунный ответ (Herrera B.B., Hamel D.J., Oshun P. et al. A modified anthrax toxin-based enzyme-linked immunospot assay reveals robust T cell responses in symptomatic and asymptomatic Ebola virus exposed individuals. / PLoS Negl Trop Dis. 2018;12(5):e0006530. doi: 10.1371/journal.pntd.0006530). Чувствительный и высокопроизводительный серологический тест для выявления специфический антител разработан на основе технологии Luminex с использованием коммерческих препаратов (система экспрессии не указана) неполноразмерных рекомбинантных белков GP, VP40 и NP ВЭ изолятов Mayinga 1976, Makona 2014 и др. При исследовании сывороток крови людей, выживших в Гвинее после БВВЭ было показано, что почти все образцы (87 из 94) взаимодействовали с тремя белками с чувствительностью 94,4%, 95,4% и 96,3%, соответственно. С рекомбинантными белками других штаммов - Sudan (изолят Gulu), Bundibugyo и Reston антитела этих сывороток крови реконвалесцентов также реагировали, но с меньшей чувствительностью (Ayouba A., Touré A., Butel C. et al. Development of a Sensitive and Specific Serological Assay Based on Luminex Technology for Detection of Antibodies to Zaire Ebola Virus. /J Clin Microbiol. 2016;55(1):165-176. doi: 10.1128/JCM.01979-16).

При вспышках БВВЭ необходимы чувствительные и простые в использовании тест-системы для «полевых» исследований биологического материала на содержание специфических антител и антигенов. Иммунохроматографический мультиплексный тест (ИХА) с оптическим приспособлением для смартфона разработан на основе трех белков GP, VP40 и NP ВЭ (штамм Sudan, изолят Gulu). Белок GP получен в эукариотической системе, а белки VP40 и NP получены экспрессией последовательностей соответствующих генов сочетано с последовательностью полигистидиновых трактов (на С- или N- концах белков NP и VP40, соответственно) в прокариотической системе E.coli (BL21(DE3) и очищены аффинной хроматографией на Ni-хеллатной смоле (Brangel P., Sobarzo A., Parolo C. et al. A Serological Point-of-Care Test for the Detection of IgG Antibodies against Ebola Virus in Human Survivors. / ACS Nano. 2018;12(1):63-73. doi: 10.1021/acsnano.7b07021).

Наиболее близким к заявляемому техническому решению (прототипом) является способ получения рекомбинантной плазмидной ДНК-конструкции, обеспечивающей экспрессию полного гена VP40 ВЭ (штамм Zaire, изолят Mayinga) в составе вектора pQE30 (QIAGEN, США) при трансформации культуры клеток E.coli (JM103). Выход рекомбинантного белка составил 25 % от суммарного клеточного белка. Очистка методом аффинной хроматографии на Ni-хелатной смоле позволила получить из одного литра биомассы E.coli 10 мл рекомбинантного белка с концентрацией 1,75 мг/мл (Иванова А.В., Казачинская Е.И., Качко, А.В.и др. Получение и иммунологическая характеристика рекомбинантных белков VP40 и NP филовирусов. / Проблемы особо опасных инфекций. 2010. № 4. С. 32-36). Однако в прототипе для выделения РНК был использован инфекционный вирусный препарат, что сопряжено с опасностью для научного персонала, а также недостаточно оптимизирован кодоновый состав рекомбинантной плазмидной ДНК-конструкции pQE30-ВЭ, вследствие чего был снижен выход целевого рекомбинантного белка. Кроме того, ДНК-конструкция pQE30-VP40BЭ не была запатентована.

Техническим результатом заявляемого изобретения является повышение выхода целевого рекомбинантного матриксного белка VP40-ВЭ (по сравнению с прототипом) до 40 % от суммарного клеточного белка и получение из одного литра биомассы E.coli 10 мл очищенного рекомбинантного белка VP40-ВЭ с концентрацией 6 мг/мл путем оптимизации кодонового состава ДНК-конструкции и условий культивирования трансформированной культуры E.coli (BL21/DE3(+) - штамма продуцента.

Указанный технический результат достигается тем, что создана рекомбинантная плазмидная ДНК pET21-VP40VE, предназначенная для экспрессии гена матриксного белка VP40 вируса Эбола (штамм Zaire, изолят Mayinga) в прокариотической системе E.coli и получения рекомбинантного белка VP40-VE, которая имеет размер 6366 п.н. и содержит в своем составе:

- ген bla (координаты с 599 по 1459 п.н.), в качестве генетического маркера, определяющего устойчивость к ампициллину клеток бактерии E.coli (BL21/DE3(+), трансформированных рекомбинантной плазмидой pET21-VP40VE;

- участок начала репликации ori (координаты с 1630 по 2218 п.н.)

- промотор фага T7 (координаты с 5117 по 5135 п.н.), обеспечивающий экспрессию последовательности гена VP40 ВЭ в прокариотических клетках E.coli;

- лактозный репрессор (координаты с 3648 п.н. по 4730 п.н.) - ДНК - связывающий белок, который ингибирует экспрессию генов E.coli и обеспечивает экспрессию целевого рекомбинантного белка VP40-ВЭ после добавления индуктора изопропил-β-D-1-тиогалактопиранозида (IPTG);

- уникальные сайты узнавания рестрикционными эндонуклеазами, имеющие следующие координаты: NheI (5204 п.н.) и XhoI (6205 п.н.);

- ген VP40 ВЭ (штамм Zaire, изолят Mayinga) (981п.н.), встроенный в экспрессионную кассету по сайтам рестрикции NheI (5204 п.н.) и XhoI (6205 п.н.) (с 4479 по 5459 нуклеотид геномной РНК), который кодирует 327 аминокислотных остатков (а.о.) вирусного матриксного белка VP40;

- последовательность (18 п.н.), кодирующая полигистидиновый (6xHis) политракт из шести гистидинов на N-конце кодируемого белка для последующей очистки его с помощью метода аффинной Ni - хроматографии.

Указанный технический результат достигается также тем, что получен рекомбинантный белок VP40-ВЭ в результате экспрессии гена матриксного белка VP40 вируса Эбола (штамм Zaire, изолят Mayinga) в бактериальной системе экспрессии E.coli в составе рекомбинантной ДНК-конструкции pET21-VP40VE, имеющий молекулярную массу 36114,68 Да и аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1:

MRRVILPTAP PEYMEAIYPV RSNSTIARGG NSNTGFLTPE SVNGDTPSNP 50

LRPIADDTID HASHTPGSVS SAFILEAMVN VISGPKVLMK QIPIWLPLGV 100

ADQKTYSFDS TTAAIMLASY TITHFGKATN PLVRVNRLGP GIPDHPLRLL 150

RIGNQAFLQE FVLPPVQLPQ YFTFDLTALK LITQPLPAAT WTDDTPTGSN 200

GALRPGISFH PKLRPILLPN KSGKKGNSAD LTSPEKIQAI MTSLQDFKIV 250

PIDPTKNIMG IEVPETLVHK LTGKKVTSKN GQPIIPVLLP KYIGLDPVAP 300

GDLTMVITQD CDTCHSPASL PAVIEKHHHH HH* 33,

длиной 333 а.о., включая 6 гистидинов и стоп-кодон и обладающий иммуногенными и антигенными свойствами и предназначенный для индукции в организме мышей линии Balb/c антител, узнающих в иммунохимических реакциях вирусный белок VP40-BE, а также взаимодействующий с мышиными моноклональными антителами, поликлональными козьими и человеческими антителами, специфичными к инактивированному и инфекционному вирусу Эбола.

Очищенный рекомбинантный белок VP40-ВЭ, полученный в результате экспрессии полного гена VP40 вируса Эбола в бактериальной системе E.coli в составе рекомбинантной плазмидной ДНК-конструкции pET21-VP40VE может быть использован:

В качестве антигена:

- в клинической практике для серологического тестирования сывороток крови пациентов на содержание иммуноглобулинов классов IgM и IgG, специфичных к вирусу Эбола методами ИФА, иммуноблоттинга и иммунохроматографического анализа (ИХА);

- при создании контрольных панелей сывороток крови, содержащих и не содержащих IgM и IgG, специфичных к вирусу Эбола;

- для тестирования иммунного ответа животных и добровольцев на введение экспериментальных вакцин, содержащих белок VP40 вируса Эбола;

- как положительный контроль в иммуноферментных тест-системах по выявлению вирусного белка VP40 вируса Эбола;

2. В качестве иммуногена:

- для иммунизации мышей при получении препаратов гибридомных моноклональных антител, используемых при разработке иммуноферментных тест-систем в формате «сэндвич» для выявления вирусного антигена;

- в составе профилактической вакцины против вируса Эбола в комплексе с другими структурными вирусными протеинами, например, гликопротеином (GP) и нуклеопротеином (NP).

Перечень графических материалов. На фиг. 1 представлена аминокислотная последовательность SEQ ID NO: 1 рекомбинантного белка VP40-ВЭ, полученного в результате экспрессии гена матриксного белка VP40 вируса Эбола (штамм Zaire, изолят Mayinga) в бактериальной системе экспрессии E.coli в составе рекомбинантной ДНК-конструкции pET21-VP40VE.

Фиг. 2. Последовательность н.о. гена VP40 вируса Эбола (штамм Zaire, изолят Mayinga).

Фиг. 3. Схема клонирования гена VP40, кодирующего белок VP40 вируса Эбола (штамм Zaire, изолят Mayinga,) из коммерческой донорской ДНК-матрицы (плазмида pGH+ VP40 ВЭ).

Фиг. 4. Электрофоретическое разделение ПЦР фрагмента и плазмидной ДНК pET21 после ферментативного гидролиза.

Примечания к фиг. 3: 1 - маркер 1kb; 2 - ПЦР продукт (VP40-VE) после последовательной обработки ферментами NdeI и XhoI; 3- вектор pET21a после последовательной обработки ферментами NdeI и XhoI; 4 - плазмида pET21-VP40VE, рестрицированная ферментами NdeI и XhoI (подтверждение наличия встройки фрагмента VP40-VE).

Фиг. 5. Схема ДНК-конструкции pET21-VP40VE.

Фиг. 6. Электрофоретическое разделение лизатов E.coli, трансформированных ДНК конструкцией pET21-VP40VE и очищенного препарата рекомбинантного белка VP40-ВЭ в 6 %-ном ПААГ-SDS.

Примечания к фиг. 5: 1- лизат клеток pET21; 2- индуцированный лизат клеток, трансформированных pET21-VP40-VE; 3- осветленный лизат клеток, трансформированных pET21-VP40-VE; 4- очищенный рекомбинантный белок VP40-ВЭ, по 10 мкл/дорожка, соответственно; 5 - белковые маркеры молекулярной массы (кДа).

Фиг. 7. Электрофореграмма очищенных препаратов в 10%-ном ПААГ-SDS.

Примечания к фиг. 6: 1, 2 - концентрированный, инактивированный ВЭ и рекомбинантный белок VP40-ВЭ, соответственно, по 10 мкл на дорожку. Стрелками обозначены вирусный белок VP40 (слева) и рекомбинантный белок VP40-ВЭ (справа).

Фиг. 8. Результат титрования в ТИФА сыворотки крови мышей, иммунизированных рекомбинантным белком VP40-ВЭ.

Примечания к фиг. 7: антиген рекомбинантного белка VP40-ВЭ был использован в рабочем разведении 1/1000, что соответствует концентрации 6 мкг/мл. Для подавления неспецифического сигнала связывания антител с рекомбинантным белком, сыворотки крови истощали лизатом E.coli в разведении 1/1000. Антиген ВЭ (штамм Zaire, изолят Mayinga) сконцентрированный и очищеный из суспензии инфицированной культуры клеток Vero, инактивирован кипячением в течение 2 мин в растворе, содержащем 5 % β-меркаптоэтанола и 1 % додецилсульфата натрия (SDS) с дальнейшим прогреванием при 60°С в течение 1 часа, как описано (Чепурнов А.А., Мерзликин Н.В., Рябчикова Е.И. и др. Получение очищенного вируса Эбола. / Вопросы вирусологию 1994. Т.39. № 6. С. 254-257) был использован в рабочем разведении 1/1000. Конъюгат Gout anti mouse с пероксидазой использовали в разведении 1/6000. Фон системы - оптическая плотность (ОП) в лунках с субстратно - индикаторной смесью и блокировочным раствором 1 N HCl. Титр антител определяли при средней арифметической значения ОП при трехкратном повторе титрования с учетом среднего значения фона системы (ОП = 0,15); положительным считали значение ОП в два раза и более выше ОП фона системы. В качестве отрицательного контроля для титрования сывороток крови мышей использовали инактивированный вирус Марбург (штамм Рорр) в разведении 1/1000, полученный также как и антиген ВЭ доктором Чепурновым.

Фиг. 9. Результат титрования в ТИФА моноклональных антител, специфичных к инактивированному ВЭ.

Примечания к фиг. 8: антигены - рекомбинантный белок VP40-ВЭ и инактивированный ВЭ использованы в рабочем разведении 1/1000. Моноклональные антитела 1Е6 и 4А2, специфичные к инактивированному ВЭ, полученные как описано (Казачинская Е.И. Получение моноклональных антител и рекомбинантных белков для иммунодиагностики опасных инфекций человека. / Автореф. дисс. доктора биол. наук. Кольцово, 2010, 57 с.) использованы в виде культуральной среды от гибридом, осажденные 50%-ным раствором сульфатом аммония и концентрированные в 100 раз. В качестве отрицательного контроля для титрования сывороток крови мышей использовали инактивированный вирус Марбург (штамм Рорр) в разведении 1/1000

Фиг. 10. Иммуноблоттинг моноклональных антител с рекомбинантным и нативным белками VP40 ВЭ.

Примечания к фиг. 9: Антигены нанесены на дорожки по 10 мкл. 1 - препарат инактивированного ВЭ, обработан МКА 1Е6; 2 - препарат инактивированного ВЭ, обработан МКА 4А2; 3 - рек. белок VP40-ВЭ, обработан МКА 1Е6; 4 - рек. белок VP40-ВЭ, обработан МКА 4А2; 5 - препарат инактивированного ВМ, обработан МКА 1Е6 (отриц. контроль); 6 - препарат инактивированного ВМ, обработан МКА 4А2 (отриц. контроль); 7 - лизат E.coli., обработан МКА 1Е6 (отриц. контроль); 8 - лизат E.coli., обработан МКА 4А2 (отриц. контроль). Антивидовой конъюгат с пероксидазой Gout anti mouse (Sigma) использован в разведении 1/6000.

Фиг. 11. Результат титрования в ТИФА очищенных IgG козы, иммунизированной инфекционным ВЭ.

Примечания к фиг. 10: антигены использованы в рабочем разведении 1/1000. Очищенные IgG козы, специфичные к инфекционному ВЭ (штамм Zaire, изолят Mayinga) получены как описано (Зубавичене Н.М. Получение и изучение свойств козьих и овечих лечебно-профилактических иммуноглобулинов против болезни Эбола. / автореф. канд. диссертации. 2001. Кольцово). Для подавления неспецифического сигнала связывания IgG с рекомбинантным белком истощали лизатом E.coli в разведении 1/1000. Конъюгат белка G меченного пероксидазой использован в разведении 1/1000. Фон системы - оптическая плотность (ОП) в лунках с субстратно - индикаторной смесью и блокировочным раствором 1 N HCl. Титр антител определяли при средней арифметической значения ОП при трехкратном повторе титрования с учетом среднего значения фона системы (ОП = 0,15); положительным считали значение ОП в два раза и более выше ОП фона системы. В качестве отрицательного контроля для титрования сывороток крови мышей использовали инактивированный вирус Марбург (штамм Рорр) в разведении 1/1000, полученный также как и антиген ВЭ доктором Чепурновым.

Фиг. 12. Иммуноблоттинг мышиных антител, специфичных к рекомбинантному белку VP40-ВЭ, с инактивированным вирусным препаратом.

Примечания к фиг. 11: 1. антиген ВЭ обработан сывороткой мыши, иммунизированной инактивированным ВЭ (положит. контроль); 2. антиген ВЭ обработан сывороткой мышей, иммунизированных рекомбинантным белком VP40-ВЭ. Антиген инактивированного ВЭ нанесен на дорожки по 10 мкл. Мышиные антитела и антивидовой конъюгат с пероксидазой Gout anti mouse (Sigma) использованы в разведении 1/500 и 1/6000, соответственно.

Фиг. 13. Иммуноблоттинг очищенных IgG козы, специфичных к инфекционному ВЭ, с вирусным антигеном и рекомбинантным белком VP40-ВЭ.

Примечания к фиг. 12: 1. рекомбинантный белок VP40-ВЭ; 2. инактивированный ВЭ. Антигены нанесены на дорожки по 10 мкл. Очищенные IgG козы использованы в разведении 1/800 и для них конъюгат белка G с пероксидазой в разведении 1/1000.

Фиг. 14. Иммуноблоттинг антител сывороток крови людей, переболевших лихорадкой Эбола с вирусным антигеном и рекомбинантным белком VP40-ВЭ.

Примечания к фиг. 13: антигены нанесены на дорожки по 10 мкл, антитела двух реконвалесцентов (№ 3 и №10) в разведении (1/200) каждого. Антивидовой конъюгат с пероксидазой Gout anti human Sigma) использован в разведении 1/6000.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Теоретический анализ, подбор праймеров для амплификации последовательности, кодирующей белок VP40 ВЭ.

1.1 Биоинформативный анализ генома вируса Эбола (штамм Zaire, изолят Mayinga) был проведен с помощью программы SnapGene.

1.2. Синтез гена VP40 ВЭ с его встройкой в донорскую ДНК-матрицу (плазмиду pGH) был проведен в коммерческой научно-производственной фирме OOO «ДНК-Синтез» (г. Москва).

1.3. Подбор праймеров (табл.1) для амплификации нуклеотидной последовательности гена VP40 ВЭ (рис. 1), расчет условий и кинетики ПЦР нуклеотидной последовательности осуществляли с помощью программы Vector-NTI-11. Синтез праймеров был проведен в коммерческой научно-производственной фирме OOO «ДНК-Синтез» (г. Москва).

Таблица 1

Праймеры использованные для амплификации последовательности, кодирующей белок VP40 ВЭ.

Пример 2. Создание ДНК-конструкции pET21-VP40VE.

2.1. Амплификация методом ПЦР фрагмента ДНК, кодирующего белок VP40 ВЭ.

Из коммерческой плазмиды pGH-VP40VE (рис. 2), на амплификаторе «Mastercycler Gradient» (Eppendorf, Германия) методом ПЦР с помощью специфических праймеров (табл. 1) был амплифицирован район, кодирующий белок VP40 ВЭ.

2.2. Выделение ДНК из агарозного геля.

После проведения ПЦР, очистку продуктов амплификации ДНК проводили фракционированием методом электрофореза в 1 %-ном агарозном геле в Трис-ацетатном буфере (TAEx1), с бромистым этидием (EtBr) в концентрации 0,2 мкг/мл. После визуализации под УФ - излучением фрагменты ДНК необходимой длины, разделенные в агарозном геле (рис. 3) вырезали из геля и элюировали при помощи набора «Евроген» Cleanup Standard (Россия) в соответствии с рекомендациями производителя и ресуспендировали осадок в 20 мкл бидистиллированной воды.

2.3. Ферментативный гидролиз векторной плазмиды pET21 и ПЦР продукта (последовательности участка генома ВЭ, кодирующей белок VP40-ВЭ).

Для клонирования гена VP40 ВЭ в вектор pET21 были использованы эндонуклеазы рестрикции NheI и XhoI (фирма «Сибэнзим», Новосибирск) с прилагаемыми к ним буферами. Реакционную смесь готовили в соответствии с активностью фермента (2-5 ед. акт. на 1 мкг ДНК) и концентрации плазмидной ДНК. Условия реакции: температура, состав буфера и длительность проведения ферментативного гидролиза ДНК подбирали в соответствии с инструкциями производителя.

Обработанные ферментами ПЦР продукт, соответствующий гену VP40 ВЭ и вектор pET21 разделяли с помощью электрофореза в 1%-ном агарозном геле с последующим выделением с помощью набора «Евроген» Cleanup Standard (Россия) в соответствии с инструкцией производителя.

2.4. Лигирование ПЦР продукта (последовательности участка генома ВЭ, кодирующей белок VP40 ВЭ) и векторной плазмиды pET21.

Реакцию лигирования проводили 30 минут при комнатной температуре, используя смесь из 2 мкг ампликонов с ДНК-матрицы, 1 мкг векторной плазмиды pET21 и 20 е.а. ДНК-лигазы фага Т4 (Сибэнзим, Россия) в прилагаемом к коммерческому набору реакционном буфере. Полученный препарат ДНК-конструкции pET21-VP40VE (рис. 4) использовали для трансформирования культуры компетентных клеток E.coli штамм BL21/DE3(+).

Пример 3. Получение штамма Escherichia Coli - продуцента рекомбинантного белка VP40-ВЭ.

При создании прокариотической системы экспрессии гена VP40, кодирующего белок VP40-ВЭ, использовали коммерчески доступный штамм (BL21/DE3(+) культуры клеток E.coli (Novagen, США).

3.1. Трансформация «компетентных» клеток E. coli рекомбинантными плазмидами.

К «компетентным» клеткам BL21/DE3(+) добавляли 10 мкл лигазной смеси, инкубировали на льду в течение 30 минут. После этого клетки подвергали «температурному шоку» при 42°С в течение 45 сек. Охлаждали клетки на льду в течение 2 минут, затем добавляли 200 мкл среды «S.O.B» (Super Optimal Broth) и инкубировали при 37°С в течение 60 минут. По окончании инкубации трансформированные клетки высевали на чашку Петри с твердой питательной средой LB (Lysogeny broth) (среда LB с 1,5% агара), содержащей антибиотик (ампициллин, 50-100 мкг/мл).

3.2. Культивирование трансформированной культуры клеток E.coli и индукция синтеза рекомбинантного белка VP40-ВЭ.

Клетки E.coli штамма BL21/DE3(+), трансформированные ДНК-конструкцией pET21- VP40VE, селективно культивировали в 100 мл жидкой питательной среды LB с добавлением ампициллина натриевой соли в рабочей концентрации 50 мкг/мл. Синтез целевого рекомбинантного белка индуцировали 0,5 мМ IPTG (изопропил-β-D-тиогалактозид). Отбор клонов E.coli - продуцентов проводили по наличию синтезируемого целевого белка по результатам электрофореза лизатов клеток в 10% -ном полиакриламидном геле (рис. 5) с додецилсульфатом натрия (SDS-ПААГ) (см. пример 4). В качестве контроля использовали, полученный аналогичным способом, лизат клеток E.coli штамма BL21/DE3(+), содержащий векторную плазмиду pET21.

Пример 4. Белковый электрофорез в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия (SDS-ПААГ).

Электрофорез проводили в разрешающем геле (состав: 30% акриламида; 1,5 M Tris (pH 8,8); 10% SDS; 10% аммония персульфата; TEMED (tetramethylethylenediamine) 1 мкл/мл) и концентрирующем геле (состав: 30% акриламида; 1M Tris (pH 6,8); 10% SDS; 10% аммония персульфата; TEMED 1 мкл/мл) в различных буферных растворах (верхний - 5Х трис-глициновый буферный раствор pH 8,3 (состав:1,25 мМ Tris; 1,25 M глицина; 0,5 % SDS), нижний - 1Х трис-ацетатный буферный раствор pH 8,0 (состав: 40 мМ Tris- HCl; 40 мМ уксусной кислоты; 2 мМ EDTA (этилендиаминтетрауксусная кислота). Биологический материал смешивали с буферным раствором для нанесения, кипятили 5 минут и наносили в верхний концентрирующий гель. SDS-ПААГ вели при напряжении ~10В/см в концентрирующем геле, ~180В в разрешающем геле. Окраску гелей проводили при помощи раствора Кумасси G-250.

Пример 5. Очистка рекомбинантного белка VP40-ВЭ в денатурирующих условиях.

Очистку рекомбинантного белка VP40-ВЭ, содержащего полигистидиновый блок, проводили аффинной хроматографией на Ni-хеллатной смоле, согласно протоколу фирмы-производителя (Qiagen). Полученные клеточные лизаты штамма E.coli - продуцента и очищенный рекомбинантной белок анализировали методом белкового электрофореза по методу Лэммли (Laemmli UK. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. / Nature. 1970; 227(5259):680-685) в SDS-ПААГ. В качестве контроля использовали полученный аналогичным способом лизат клеток E.coli штамма BL21/DE3(+), содержавший векторную плазмиду pET21. Электрофоретическая подвижность в 12% SDS-ПААГ (см. пример 4) синтезируемого белка - 36114,68 Да совпадала с теоретическими расчетами. Концентрацию рекомбинантного белка измеряли визуально по данным электрофореграммы (рис. 5) и при помощи набора «Bio-Rad Protein Assay Kit» в соответствии с рекомендациями производителя на спектрофотометре при длине волны 495 нм и оценивали путем калибровки по овальбумину в 4 М растворе мочевины (pH 8,0).

Пример 6. Твердофазный иммуноферментный анализ (ТИФА).

Для проведения непрямого ТИФА использовали полистироловые планшеты (Nunk). Сенсибилизацию ячеек рекомбинантным белком VP40-ВЭ (в концентрации 6 мкг/мл) или инактивированным препаратом ВЭ в разведении (1/1000) выполняли в объеме 100 мкл 0,05 М натрий-фосфатного буферного раствора (рН 8,0) с 4 М мочевины. Сорбцию проводили при 22°C в течение 18 часов. Дополнительную блокировку сорбционной активности осуществляли 1%-ным раствором казеина в ТСБ-Т (трис-солевой буфер с твином, содержащий 0,15M NaCl; 0,02M трис-HCl рН 7,4; 0,05% Твин-20) в течение 45 минут при 37°С. Затем раствор казеина удаляли и инкубировали антиген со специфическими антителами (мышиными, человеческими или козьими) в течение 1 часа при 37°С или 18 часов при 4°С в 0,5%-ном растворе казеина в ТСБ-Т. После трехкратной отмывки ТСБ-Т буфером в лунки добавляли по 100 мкл пероксидазного конъюгата антивидовых антител (Sigma) - Gout anti mouse, Gout anti human или белок G, меченный пероксидазой для козьих антител, в рабочих разведениях в 0,5%-ном растворе казеина в ТСБ-Т. Инкубировали 1 час при 37°С. Отмывку лунок осуществляли трехкратно с ТСБ-Т. Проявление проводили в течение 30 минут при 37°С с использованием жидкого субстрата на основе ТМБ (3,3’,5,5’-Tetramethylbenzidine). Блокировали реакцию добавлением 100 мкл 1 N HCl на каждую лунку и измеряли ОП субстратно - индикаторной смеси на спектрофотометре «Unisan» при длине волны 450 нм. В качестве отрицательного контроля использовали вирус Марбург (ВМ, штамм Рорр) (сконцентрированный, очищенный из суспензии инфицированной культуры клеток Vero и инактивированный кипячением в течение 2 мин в растворе, содержащем 5 % β-меркаптоэтанола и 1 % додецилсульфата натрия (SDS) с дальнейшим прогреванием при 60⁰С в течение 1 часа, как описано для ВЭ (Чепурнов А.А., Мерзликин Н.В., Рябчикова Е.И. и др. Получение очищенного вируса Эбола. / Вопросы вирусологию 1994. Т.39. № 6. С. 254-257). В качестве положительного контроля для ВМ использовали сыворотку крови человека, переболевшего лихорадкой Марбург (Никифоров В.В., Туровской Ю.И, Калинин П.П. и др. Случай лабораторного заражения лихорадкой Марбург. / Микробиология. 1994.№ 3. С. 104-110).

Пример 7. Иммуноблоттинг.

Препараты рекомбинантного белка VP40-ВЭ и инактивированного ВЭ после электрофореза переносили на нитроцеллюлозную мембрану («Millipore», США) на аппарате Transpor («LKB», Швеция) в течение 1,5 часов при напряжении 80 В в 0,025М трис-HCl буфере, содержащем 0,192 М глицина (рН 8,3) и 20% этанола. Места неспецифического связывания насыщали 1%-ным раствором казеина в ТСБ-Т буфере (состав: трис-солевой буфер с твином, содержащий 0,15M NaCl; 0,02M трис-HCl рН 7,4; 0,05% твин-20) при 37°С в течение 2 часов. Затем мембрану или отдельные полоски, содержащую рекомбинантный и вирусные белки инкубировали со специфическими антителами 4 часа при 20-22°С в буфере ТСБ-Т, содержащем 0,5% казеина. После отмывки в ТСБ-Т буфере мембраны обрабатывали антивидовыми антителами, меченными пероксидазой хрена (Sigma) - Gout anti mouse, Gout anti human или белок G, меченный пероксидазой для козьих антител в рабочих разведениях в 0,5%-ном растворе казеина в ТСБ-Т в течение 2-х часов при 37°С. Затем мембрану промывали ТСБ-Т буфером и проявляли в растворе хромагена (1 мг/мл 3,3 диаминобензидин тетрагидрохлорида в 50 мМ трис-HCl буфере (pH 7,4), содержащем 0,145 М NaCl, 20% этанола и 0,03% перекиси водорода). Реакцию останавливали отмыванием полосок в дистиллированной воде. Специфическое взаимодействие антител с белками проявлялось в виде ярких коричневых полос.

Пример 8. Иммунохимическое исследование рекомбинантного белка VP40-ВЭ.

8.1. Оценка степени очистки рекомбинантного белка VP40-ВЭ.

В результате из одного литра биомассы штамма E.coli - продуцента было получено 10 мл очищенного белка с концентрацией 6 мг/мл. Методом белкового электрофореза (см. пример 4) оценивается степень очистки рекомбинантного белка VP40-ВЭ. Электрофореграмма сравнения местоположения белка VP40 в инактивированном препарате ВЭ и очищенного белка VP40-ВЭ представлена на рис. 6.

8.2. Иммунизация мышей рекомбинантным белком VP40-ВЭ.

Для иммунизации использовали трех мышей линии Balb/c (самок весом 22 г) из вивария ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор». Схема иммунизации представлена в табл. 2. Общая доза антигена на одну мышь составила 90 мкг/мл. Кровь была взята посредством декапитации животных, усыпленных парами хлороформа, на 34-е сутки после первой иммунизации, соответственно.

Таблица 2

Схема иммунизации мышей линии Balb/c рекомбинантным белком VP40 вируса Эбола

№ п/п	сутки иммунизации	концентрация белка (антигена) мкг/мышь	раствор для разведения антигена
1	0	30	50%-ный НАФ в физ. растворе
2	13	30	50%-ный ПАФ в физ. растворе
3	20	30	50%-ный ПАФ в физ. растворе
взятие крови	34

Примечание: исходная концентрация очищенного рекомбинантного белка VP40-ВЭ - 6 мг/мл; группа из трех мышей; метод иммунизации - внутрибрюшинный; НАФ - неполный адъювант Фрейнда (Difco); ПАФ - неполный адъювант Фрейнда.

8.3. Исследование иммуногенности рекомбинантного белка VP40-ВЭ.

Титр антител в сыворотках крови иммунизированных мышей определяли методом ТИФА (см. пример 6), используя рекомбинантный антиген в рабочей концентрации 6 мкг/мл. Для подавления неспецифического сигнала связывания антител с рекомбинантным белком, сыворотки крови истощали лизатом клеток E.coli, полученным в разведении 1/1000. Как видно из результатов ТИФА, представленных на графике (рис. 7), титр антител в сыворотках крови, собранных при декапитации трех мышей на 34-е сутки после иммунизации, на гомологичном антигене (рекомбинантном белке VP40-ВЭ) составил 1/204800.

8.4. Исследование антигенности рекомбинантного белка VP40-ВЭ.

При исследовании антигенных свойств рекомбинантного белка VP40-ВЭ использовали моноклональные мышиные антитела (МКА) 1Е6 и 4А2 специфичные к белку VP40 инактивированного ВЭ, полученные как описано (Казачинская Е.И. Получение моноклональных антител и рекомбинантных белков для иммунодиагностики опасных инфекций человека. / Автореф. дисс. доктора биол. наук. Кольцово, 2010, 57 с.), препарат очищенных козьих IgG, имеющих титр нейтрализующих антител 1/1000 и полученных при иммунизации животных инфекционным вирусом как описано (Зубавичене Н.М. Получение и изучение свойств козьих и овечих лечебно-профилактических иммуноглобулинов против болезни Эбола. / автореф. канд.диссертации. 2001. Кольцово), а также сыворотки крови десяти здоровых пациентов в возрасте 25-60 лет, серопозитивных по БВВЭ и давших свое письменное согласие на исследование. Забор крови у пациентов проводился к.м.н. Деминой А.В. с разрешения Этического комитета Угандийского вирусологического исследовательского института (Уганда, г. Энтеббе) во время командировки в Уганду от Университета им. Бен-Гуриона (г. Беер-Шева, Израиль).

Антигенность препарата рекомбинантного белка VP40-ВЭ как способность взаимодействовать со специфическими антителами в иммуноферментных реакциях была исследована методами ТИФА (см. пример 6) и иммуноблоттига (см. пример 7).

Например, на рис. 7 представлен график титрования сыворотки крови от трех мышей иммунизированных рекомбинантным белком VP40-ВЭ на инактивированном ВЭ. Титр антител составил 1/51200. Аналогичным образом антигенность рекомбинантного белка VP40-ВЭ была исследована в ТИФА с антителами, специфичными к ВЭ.

На рис. 8 представлен график титрования мышиных моноклональных антител (МКА), специфичных к инактивированному ВЭ и полученных как описано (Казачинская Е.И. Получение моноклональных антител и рекомбинантных белков для иммунодиагностики опасных инфекций человека. / Автореф. дисс. доктора биол. наук. Кольцово, 2010, 57 с.), на инактивированном ВЭ и рекомбинантном белке VP40-ВЭ. Титр антител составил от 1/3200 до 1/102400, в зависимости от антигена. Специфичность взаимодействия подтверждается результатом иммуноблоттинга МКА с белками VP40 (рис. 9). На рис. 10 представлен график титрования IgG козы, иммунизированной инфекционным ВЭ. Титр IgG козы составил на рекомбинантном белке VP40 и инактивированном ВЭ 1/51200 и 1/25000, соответственно. Результат титрования сывороток крови десяти реконвалесцентов представлен в табл. 3. Титр антител составил от 1/400 до 1/12800, в зависимости от антигена. При этом наблюдался фон (в разведении от 1/50 до 1/200) перекрестного взаимодействия сывороток крови людей, переболевших лихорадкой Эбола на инактивированном вирусе Марбург, а также перекрестное взаимодействие сыворотки рековалесцента (в разведении 1/100), переболевшего лихорадкой Марбург на инактивированном ВЭ. Эти результаты соотносятся с литературными данными о частичной гомологии N-концевой части нуклеопротеинов филовирусов и возможности перекреста антител, специфичных к нуклеопротеину филовирусов (Sanchez A., Kiley M.P., Klenk H.D., Feldmann H. Sequence analysis of the Marburg virus nucleoprotein gene: comparison to Ebola virus and other non-segmented negative-strand RNA viruses. / J Gen Virol. 1992;73 ( Pt 2):347-57; Natesan M. Jensen S.M., Keasey S.L. et al. Human Survivors of Disease Outbreaks Caused by Ebola or Marburg Virus Exhibit Cross-Reactive and Long-Lived Antibody Responses. / Clin Vaccine Immunol. 2016;23(8):717-24. doi: 10.1128/CVI.00107-16). Методом иммуноблоттинга показано, что мышиные антитела, специфичные к рекомбинантному белку VP40-ВЭ, узнают аналогичный вирусный белок в препарате инактивированного ВЭ (рис. 11). Взаимодействие рекомбинантного белка VP40 с антителами (козьими и человеческими), специфичными к ВЭ, представлено на рис. 12 и рис. 13.

Таким образом, заявляемое техническое решение позволяет получить ДНК конструкцию pЕТ21a-VP40VE, кодирующую ген VP40 вируса Эбола (штамм Zaire, изолят Mayinga). Трансформированная рекомбинантной плазмидой культура клеток E.coli BL21/DE3(+) при индукции IPTG осуществляет биосинтез полипетида с молекулярной массой 36114,68 Да. На N-конце рекомбинантный белок VP40-ВЭ содержит полигистидиновый тракт для аффинной очистки. Данный подход позволяет получать высокоочищенный рекомбинантный белок VP40-ВЭ, предназначенный для индукции в организме мышей линии Balb/c антител, узнающих в иммунохимических реакциях вирусный белок VP40 ВЭ, а также взаимодействующий с мышиными моноклональными антителами, поликлональными козьими и человеческими антителами, специфичными к инактивированному и инфекционному вирусу, соответственно (т.е. обладающий иммуногенными и антигенными свойствами).

Таблица 3

Результат титрования в ТИФА сывороток крови людей, переболевших лихорадкой Эбола

№ п/п	антигены
вирус Эбола	рекомбинантный белок VP40	вирус Марбург
1	1/3200	1/800	1/100
2	1/400	1/400	<1/50
3	1/3200	1/1600	1/100
4	1/3200	1/3200	1/100
5	1/3200	1/400	1/100
6	1/1600	1/1600	1/50
7	1/3200	1/400	1/100
8	1/1600	1/800	1/100
9	1/3200	1/800	1/100
10	1/12800	1/12800	1/200
11	1/100	<1/50	1/24300

Примечание: 1 - 10 - сыворотки крови реконвалесцентов, полученные от десяти здоровых пациентов в возрасте 25-60 лет в анамнезе серопозитивных по БВВЭ (ссылка в примере 8, пункт 8.4). Титр антител определяли при средней арифметической значения ОП (при трехкратном повторе титрования) с учетом фона системы значение ОП = 0,15; положительным считали значение ОП в два раза и более выше ОП фона системы. В качестве отрицательного контроля антигена для титрования сывороток крови людей, переболевших БВВЭ, использовали инактивированный вирус Марбург (ссылка в примере 6). 11 - в качестве положительного контроля для вируса Марбург использовали сыворотку крови человека, переболевшего лихорадкой Марбург (ссылка в примере 6). Антигены использованы в рабочем разведении 1/1000. Антивидовой конъюгат с пероксидазой Gout anti human (Sigma) использован в разведении 1/6000.

--->

Перечень последовательностей

<110> Федеральное бюджетное учреждение науки «Государственный научный центр

вирусологии и биотехнологии «Вектор» Федеральной службы по надзору в сфере

защиты прав потребителей и благополучия человека (ФБУН ГНЦ ВБ

«Вектор» Роспотребнадзора)

<120> Рекомбинантная плазмидная ДНК pЕТ21-VP40VE, содержащая ген

матриксного белка (VP40) вируса Эбола и рекомбинантный белок VP40-ВЭ,

полученный в результате экспрессии гена белка VP40 вируса Эбола с

использованием рекомбинантной плазмидной ДНК pЕТ21-VP40VE

и обладающий иммуногенными и антигенными свойствами

<160> SEQ ID NO 1

<210> SEQ ID NO:1

<211> 333

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Аминокислотная последовательность рекомбинантного белка VP40-ВЭ,

полученного в результате экспрессии гена матриксного белка VP40

вируса Эбола (штамм Zaire, изолят Mayinga) в бактериальной системе

экспрессии E.coli в составе рекомбинантной ДНК-конструкции pЕТ21-VP40VE.

<400> 1

MRRVILPTAP PEYMEAIYPV RSNSTIARGG NSNTGFLTPE SVNGDTPSNP 50

LRPIADDTID HASHTPGSVS SAFILEAMVN VISGPKVLMK QIPIWLPLGV 100

ADQKTYSFDS TTAAIMLASY TITHFGKATN PLVRVNRLGP GIPDHPLRLL 150

RIGNQAFLQE FVLPPVQLPQ YFTFDLTALK LITQPLPAAT WTDDTPTGSN 200

GALRPGISFH PKLRPILLPN KSGKKGNSAD LTSPEKIQAI MTSLQDFKIV 250

PIDPTKNIMG IEVPETLVHK LTGKKVTSKN GQPIIPVLLP KYIGLDPVAP 300

GDLTMVITQD CDTCHSPASL PAVIEKHHHH HH* 333

<---

1. Рекомбинантная плазмидная ДНК pЕТ21-VP40VE, предназначенная для экспрессии гена VP40 вируса Эбола и получения рекомбинантного белка VP40-ВЭ, имеет размер 6366 п.н. и содержит в своем составе:

- ген bla (координаты с 599 по 1459 п.н.) в качестве генетического маркера, определяющего устойчивость к ампициллину клеток бактерии E.coli, трансформированных рекомбинантной плазмидой pЕТ21-VP40VE;

- участок начала репликации ori (координаты с 1630 по 2218 п.н.)

- промотор фага T7 (координаты с 5117 по 5135 п.н.), обеспечивающий экспрессию последовательности гена VP40 вируса Эбола в прокариотических клетках E.coli;

- лактозный репрессор (координаты с 3648 п.н. по 4730 п.н.) - ДНК-связывающий белок, который ингибирует экспрессию генов E.coli и обеспечивает экспрессию целевого рекомбинантного белка VP40-ВЭ после добавления индуктора изопропил-β-D-1-тиогалактопиранозида (IPTG);

- уникальные сайты узнавания рестрикционными эндонуклеазами, имеющие следующие координаты: NheI (5204 п.н.) и XhoI (6205 п.н.);

- ген VP40 вируса Эбола (штамм Zaire, изолят Mayinga) 981 п.н. с 4479 по 5459 нуклеотид геномной РНК), встроенный в экспрессионную кассету по сайтам рестрикции NheI (5204 п.н.) и XhoI (6205 п.н.), который кодирует 327 аминокислотных остатков (а.о.) вирусного белка VP40;

- последовательность (18 п.н.), кодирующая полигистидиновый (6xHis) политракт из шести гистидинов на N-конце кодируемого белка для последующей очистки его с помощью метода аффинной Ni-хроматографии.

2. Рекомбинантный белок VP40-ВЭ, полученный в результате экспрессии гена VP40 вируса Эбола (штамм Zaire, изолят Mayinga) в бактериальной системе экспрессии E.coli в составе рекомбинантной ДНК-конструкции pЕТ21-VP40VE по п. 1 формулы, имеющий расчетную молекулярную массу 36114,68 Да и аминокислотную последовательность SEQ ID NO:1 длиной 333 а.о., включая 6xHis и стоп-кодон:

MRRVILPTAP PEYMEAIYPV RSNSTIARGG NSNTGFLTPE SVNGDTPSNP 50

LRPIADDTID HASHTPGSVS SAFILEAMVN VISGPKVLMK QIPIWLPLGV 100

ADQKTYSFDS TTAAIMLASY TITHFGKATN PLVRVNRLGP GIPDHPLRLL 150

RIGNQAFLQE FVLPPVQLPQ YFTFDLTALK LITQPLPAAT WTDDTPTGSN 200

GALRPGISFH PKLRPILLPN KSGKKGNSAD LTSPEKIQAI MTSLQDFKIV 250

PIDPTKNIMG IEVPETLVHK LTGKKVTSKN GQPIIPVLLP KYIGLDPVAP 300

GDLTMVITQD CDTCHSPASL PAVIEKHHHH HH* 333,

и обладающий иммуногенными и антигенными свойствами и предназначенный для индукции в организме мышей линии Balb/c антител, узнающих в иммунохимических реакциях вирусный белок VP40 ВЭ, а также взаимодействующий с мышиными моноклональными антителами, поликлональными козьими и человеческими антителами, специфичными к инактивированному и инфекционному вирусу соответственно.