Способ получения антимикробного геля

Изобретение относится к области медицины, а именно к биологически активным гелям, используемым в качестве антимикробных средств (систем доставки антибиотиков) для профилактики и лечения инфекции области хирургического вмешательства в травматологии и ортопедии, в том числе перипротезной инфекции. Способ получения антимикробного геля включает смешение исходных компонентов, в качестве которых используют поливинилпирролидон в количестве от 10 до 30 мас.%; гентамицина сульфат, фосфомицин и воду, а также облучение смеси γ-излучением с использованием изотопа ⁶⁰Со с получением геля вязкостью от 1 до 20 Па×с, причем поливинилпирролидон в количестве 80-85 мас.% от исходного количества перед смешением предварительно подвергают термической обработке при температуре 160-180°С в течение 1-8 часов, а затем полученный термически сшитый поливинилпирролидон растворяют в дистиллированной воде с получением полимерного тиксотропного геля, в который добавляют гентамицина сульфат в количестве от 0,5 до 1,5 мас.% и фосфомицин в количестве от 5,0 до 10 мас.%, далее в полученную смесь добавляют оставшееся количество термически несшитого поливинилпирролидона, после чего смесь подвергают γ–облучению дозой 10-15 кГр. Изобретение обеспечивает получение тиксотропного воспроизводимого гидрогеля с повышенной концентрацией фосфомицина, обеспечивающего пролонгированное действие его антимикробной активности в течение не менее 9 дней. 2 табл., 1 ил.

 

Область техники, к которой относится изобретение

Изобретение относится к области медицины, биотехнологии, а именно к получению биологически активных гелей (гидрогелей), используемых в качестве антимикробных средств (систем доставки антибиотиков) для профилактики и лечения инфекции области хирургического вмешательства в травматологии и ортопедии, в т.ч. перипротезной инфекции.

Уровень техники

Для современной травматологии и ортопедии характерно большое количество реконструктивных операций, при которых пациенту в оперированный сегмент опорно-двигательного аппарата устанавливают имплантаты. Это могут быть компоненты эндопротеза, пластины, винты, интрамедуллярные стержни и другие металлоконструкции. В случае развития инфекции области хирургического вмешательства, у данной категории больных существует высокий риск инфицирования установленной металлоконструкции, в таких случаях говорят о развитии глубокой имплантат-ассоциированной инфекции или, при установке эндопротеза - о перипротезной инфекции. Эндопротезирование крупных суставов является одной из наиболее успешных и экономически эффективных операций, улучшающих качество жизни пациентов, однако риск развития инфекции оперированного сустава у данной категории пациентов сохраняется пожизненно. Ежегодно в мире проводится более 1 миллиона артропластик тазобедренного сустава, их количество постоянно растет [Albuhairan, В. Antibiotic prophylaxis for wound infections in total joint arthroplasty / B. AlBuhairan, D. Hind, A. Hutchinson 2008 // The Journal of Bone and Joint Surgery. - 2008. - V 90-B. - №7. DOI: 10.1302/0301-620X.90B7.20498]. Однако высокая вероятность инфицирования, способная возникнуть при этих вмешательствах, обусловлена тем, что эндопротез, как и любой другой абиогенный материал, лишен естественной, иммунной защиты, осуществляемой главным образом системой мононуклеарных фагоцитов (макрофагов), что облегчает микроорганизмам его колонизацию и, как инородное тело, подвергается отторжению со стороны организма. Инфицирование и нагноение послеоперационной раны у пациентов с эндопротезом крупного сустава в подавляющем большинстве случаев приводит к необходимости удаления его компонентов, а у 25-30% пациентов инфекционный процесс даже после санирующих операций приобретает рецидивирующее течение и может приводить к последствиям, вынуждающим удаление протеза, к развитию хронического постимплантационного остеомиелита и стойкой утрате трудоспособности. Стоимость лечения перипротезной инфекции в 5-7 раз превосходит стоимость самой первичной операции, при этом значительно снижается качество жизни пациентов. Перипротезная инфекция является серьезной проблемой и в России. По данным регистра РНИИТО им. Р.Р. Вредена на протяжении нескольких лет данная инфекция уверенно занимает второе место среди причин ревизионного эндопротезирования [Тихилов Р.М., Шубняков И.И., Коваленко А.Н., Черный А.Ж., Муравьева Ю.В., Гончаров М.Ю. Данные регистра эндопротезирования тазобедренного сустава РНИИТО им. Р.Р. Вредена за 2007-2012 годы / Р.М. Тихилов [и др.] // Травматология и ортопедия России. - 2013. - 3. - С. 167-190.]. Таким образом, остро стоит проблема профилактики инфекции области хирургического вмешательства при реконструктивных ортопедических операциях, включая эндопротезирование суставов, а также в разработке средств и способов, повышающих эффективность лечения данного осложнения.

Согласно современным представлениям решение проблемы происходит по нескольким направлениям [ C.L., Scarponi S., Gallazzi E., D., Drago L. Antibacterialcoatingofimplantsinorthopaedicsandtrauma:classificationproposalinanevolvingpanorama. JOrthopSurgRes 2015; 10:157]:

- пассивная обработка/модификация поверхности имплантата без использования какого - либо фармакологически активного вещества;

- активная обработка/модификация поверхности фармакологически активными бактерицидными агентами (например, покрытия, содержащие серебро или йод);

- использование локальных средств во время операции непосредственно перед установкой имплантата.

Современная концепция антимикробной профилактики подразумевает подавление активности микроорганизмов на момент выполнения операции. В то же время, высокая актуальность разработки средств для локальной антимикробной терапии в травматологии и ортопедии продиктована недостаточной концентрацией антибиотиков в очаге остеомиелита и перипротезной инфекции при системном введении препаратов и, как следствие, низкой эффективностью лечения данных осложнений [Божкова С.А., Новокшонова А.А., Конев В.А. Современные возможности локальной антибиотикотерапии перипротезной инфекции и остеомиелита (обзор литературы). Травматология и ортопедия России. 2015; (3):92-107]. Известно, что ведущими возбудителями данного типа инфекции являются стафилококки, включая метициллинорезистентные штаммы, однако участие в этиологии инфекции грамотрицательных бактерий: семейство Enterobacteriaceae, неферментирующие бактерии - Pseudomonas Aeruginosa, Acinetobacter spp., приводит к крайне низкой эффективности лечения [Божкова С.А., Касимова А.Р., Тихилов Р.М., Полякова Е.М. Рукина А.Н., Шабанова В.В., Ливенцов В.Н. Неблагоприятные тенденции в этиологии ортопедической инфекции: результаты 6-летнего мониторинга структуры и резистентности ведущих возбудителей. Травматология и ортопедия России. 2018;24(4):20-31.], что необходимо учитывать при разработке средств для лечения.

Локальными носителями лекарственных препаратов могут являться биодеградируемые полимерные матрицы в любом исполнении - гели, губки, пленки. Несмотря на достаточно широкий выбор полимерных материалов, форм их применения, с точки зрения профилактики перипротезной инфекции предпочтительным является использование гелей, которыми можно покрывать поверхности ортопедических имплантатов любой формы. Выбор геля в качестве матрицы является предпочтительным и при лечении любых имплантат-ассоциированных инфекций после реконструктивных операций на опорно-двигательном аппарате.

Наибольший интерес представляют гидрогели на основе поливинилпирролидона (ПВП), широко применяемого в фармацевтической промышленности. При этом ПВП на сегодняшний день остается предметом исследований для конкретных применений.

Из уровня техники известны способы получения гелевых фармацевтических композиций, включающие синтез и модификацию свойств полимеров с использованием внешних воздействий, в частности, термической обработки и различного рода излучения с высокой энергией волны. При радиационном воздействии в результате химических реакций между макромолекулами полимера могут быть получены гели со специфическими свойствами [Bashir A., Sudhair A.,Zafar I, Shumaila B. Syntesis of Cross Linked PVP Hydrogels and its Use for the Control Release of Anti-Asthmatic Drugs. Middle-east J. Sci. Res, 2013, 14(2), 273-283, DOI: 10.5829/idosi.mejst.2013.14.2.7391], однако при этом обязательным является введение различных инициаторов для получения желаемого результата, зачастую не разрешенных к использованию, когда речь идет о продуктах, предназначенных для применения в медицине.

Из уровня техники известна фармацевтическая композиция для местного применения и способ ее получения (US 2013267486), содержащая антибактериальный агент, сополимер поливинилпирролидон-винилацетат (ПВП/ВА) в количестве от 30% до 60 мас.%, воду в количестве от 20% до 40 мас.%, летучий растворитель в количестве от 10% до 25 мас.%; и желирующий агент. В качестве антибактериального агента в фармацевтической композиции может быть использован широкий спектр известных веществ, например, гентамицин, неомицин, стрептомицин, цефподоксим проксетил, клиндамицин, линкомицин, эритромицин, бацитрацин, грамицидин(ы), ванкомицин, доксициклин, миноциклин, окситетрациклин, фусетрафициклин, тетрациклин, фуситетрациклин. кислота, сульфацетамид, метронидазол, пероксид бензоила и дапсон, фармацевтически приемлемая соль вышеупомянутых агентов и их смеси.

Однако данная композиция представляет собой сложную многокомпонентную композицию, включая, различные желирующие агенты, органические растворители (летучие), которые не разрешены для применения в травматологии и ортопедии, при этом могут присутствовать в остаточном количестве в фармацевтической композиции. Кроме того, в материалах описания изобретения отсутствует указание на достигаемую вязкость композиции, что является существенным для обеспечения пролонгированной (не менее 9 дней) активности входящих в композицию активных компонентов.

Из уровня техники известно антимикробное средство для профилактики имплант-ассоциированной инфекции и способ его получения (Патент РФ №2535156, МПК А61К 31/79, А61К 31/7036, А61К 31/498, А61К 47/48, А61Р 31/04), представляющее собой водный раствор среднемолекулярного поливинилпирролидона, содержащий антимикробные препараты: антибиотик (гентамицин) и антисептик (диоксидин), при следующем соотношении компонентов: гентамицина сульфат - 0,96 г, диоксидин - 1,0 г, среднемолекулярный коллидон медицинский (молекулярной массой 30000D) - 10,0 г, вода дистиллированная - до 100,0 мл. Профилактика имплант-ассоциированной инфекции заключается в интраоперационном орошении имплантата перед его установкой в костную ткань и дополнительном орошении тканей в области хирургического вмешательства антимикробным средством с последующим ушиванием послеоперационной раны, что приводит к эрадикации имеющейся в ране микрофлоры и заживлению раны первичным натяжением.

Однако в данном изобретении представлено антимикробное средство в форме раствора, при этом отсутствует описание деталей способа приготовления антимикробного средства, которые являются существенными для получения состава, обеспечивающего пролонгированный эффект антимикробного геля. В частности, отсутствие сшивки молекул веществ, входящих в его состав (в связи с использованием композиции в виде раствора), не может обеспечить достаточную вязкость, и в случае большого количества раневого отделяемого и необходимости установки дренажа будет приводить к быстрому выведению антимикробных компонентов из области хирургического вмешательства. Кроме того, отсутствуют данные об активности предлагаемого средства в отношении устойчивых к метициллину штаммов стафилококков, к штаммам грамотрицательных бактерий.

Из уровня техники известен антимикробный гидрогель и способ его получения (Легонькова О.А., Терехова Р.П., Божкова С.А., Ахмедов Б.Г., Асанова Л.Ю., Полякова Е.М., Чилилов А.М.. Влияние γ-излучения на антимикробные свойства гелей на основе поливинилпирролидона, Все материалы. Энциклопедический справочник, Издательство: Наука и технологии ООО, 2018, №12, С. 26-30), содержащий поливинилпирролидон (ПВП) с молекулярной массой 30000, фосфомицин, гентамицин и воду. Гидрогель готовят растворением ПВП (в концентрациях 10, 15, 50% (мас.)) в дистиллированной воде при интенсивном перемешивании, с последующим добавлением фосфомицина и гентамицина в концентрациях от 0,4 до 5,0 мас.%, полученную смесь подвергают γ-излучению (источником ⁶⁰Co) до достижения поглощенной дозы 15, 30 и 40 кГр. Воздействие γ-излучения приводит к увеличению вязкости гидрогеля. При этом было продемонстрировано, что величина дозы γ-излучения в целом не влияет на антимикробную активность образцов гелей с разным содержанием антибиотиков. Кроме того, в публикации продемонстрирован синергетический эффект от совместного действия антибиотиков при увеличении концентрации фосфомицина до 5%. Кроме того, также было отмечено, что при использовании ПВП в количестве 50 мас.% была получена высокая вязкость гидрогеля, затрудняющая его применение для лечения перипротезной инфекции.

В известном способе использованы биодеградируемый носитель на основе поливинилпирролидона (ПВП) и комплекс из двух антибиотиков. Однако данный способ не позволяет получать гелевую композицию с воспроизводимыми параметрами вязкости от 1 - до 20 Па×с. При повторении способа с фиксированными режимами и концентрациями антибиотиков (1,2 мас.% гентамицина и 5 мас.% фосфомицина) получаемые композиции характеризовались разными значениями вязкости, в т.ч выходящими за указанный диапазон значений, что отрицательно сказывалось на стабильности вязкоупругих свойств получаемых композиций (гидрогелей), и соответственно, на обеспечении ее стабильного пролонгированного действия. Известное решение демонстрирует высокую антибактериальную активность, однако в отдельных случаях - при наличии «сложных» хирургических инфекций, данной концентрации бывает недостаточно (зона подавления микроорганизмов при использовании гидрогеля по известному способу остается уменьшенной по сравнению с гидрогелем, полученным по заявляемому способу). Увеличение концентрации фосфомицина без изменения режимов способа не обеспечивает получение воспроизводимых параметров вязкости композиции от 1 - до 20 Па×с. В этой связи требуется разработка нового воспроизводимого способа получения гелевой композиции, содержащей увеличенную концентрацию фосфомицина, и имеющей вязкость 1 - до 20 Па×с, предпочтительно 5 - 20 Па×с, обеспечивающую длительное присутствие антибиотиков в ране.

Известно также, что характеристикой структуры геля и проявления его физико-механических свойств является эффективная вязкость (ее наибольшее (η₀) и наименьшее значения (η_мин)), существенно влияющая на «выход» импрегнированных тех или иных веществ, применение которых необходимо для достижения поставленных перед исследователями задач.

Наиболее близким к заявляемому изобретению является антимикробный гидрогель (Легонькова О.А., Васильев В.Г., Божкова С.А., Терехова Р.П., Оганнисян А.С., Григорьев М.М., Винокурова Т.И., Чилилов А.М., Ахмедов Б.Г.. Свойства поливинилпирролидоновых гелей после стерилизующих воздействий. Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии, №11, 2019) содержащий поливинилпирролидон (ПВП) с молекулярной массой 30000 и концентрацией от 10 до 30 мас.%, фосфомицин концентрацией 5,0 мас.%, гентамицин концентрацией 1,2 мас.% и воду, характеризующийся вязкостью от 1 до 20 Па⋅с. Для радиационной сшивки используют γ-излучение (Со60) в дозах 15 и 30 кГр. При этом для приготовления гидрогелевой системы сначала ПВП растворяют в воде, затем 15 масс % раствора ПВП без добавления лекарственных добавок облучали γ- лучами с интенсивностью 30 кГр, затем в полученную систему добавляли гентамицин (1,2 мас.%) и фосфомицин (5 мас.%). В данной статье описана возможность получения гидрогеля с вязкостью от 1 до 20 Па⋅с, однако многократное повторение способа при фиксированных параметрах, не обеспечивает воспроизводимость получаемого гидрогеля по вязкости. Таким образом, все перечисленные выше недостатки характерны и для данного способа. Кроме того, в известном способе используется относительно высокая доза облучения, что не безопасно для обслуживающего персонала.

Технической проблемой, решаемой заявляемым изобретением, является разработка способа получения антимикробного геля, лишенного перечисленных выше недостатков, представляющих собой формонеустойчивый гель, обладающий широким спектром антимикробной активности в отношении ведущих возбудителей ортопедической инфекции в течение не менее 9 суток.

Раскрытие изобретения

Техническим результатом изобретения является получение тиксотропного воспроизводимого гидрогеля (препарата) с повышенной концентрацией фосфомицина, обеспечивающего пролонгированное действие его антимикробной активности (не менее 9 дней).

Технический результат достигается за счет использования приемов и режимов способа, которые позволяют получать гидрогель с содержанием фосфомицина до 10% и воспроизводимыми параметрами вязкости от 1 до 20 Па×с, предпочтительно 5 - 20 Па×с, обеспечивающими длительное присутствие антибиотиков в ране. Получаемый гидрогель имеет антибактериальную активность широкого спектра действия, а именно, активность в отношении грамположительных бактерий, включая устойчивые к метициллину штаммы Staphylococcus aureus и Staphylococcus epidermidis, в отношении грамотрицательных бактерий, включая представителей семейства Enterobacteriaceae, и неферментирующих бактерий.

Технический результат достигается при реализации способа получения антимикробного геля, включающего смешение исходных компонентов, в качестве которых используют поливинилпирролидон в количестве от 10 до 30 мас.%; гентамицина сульфат, фосфомицин и воду, а также облучение смеси γ-излучением с использованием изотопа ⁶⁰Со с получением геля вязкостью от 1 до 20 Па×с. Согласно способу поливинилпирролидон в количестве 80-85 мас.% от исходного количества перед смешением предварительно подвергают термической обработке при температуре 160-180°С в течение 1-8 часов, затем полученный термически сшитый поливинилпирролидон растворяют в дистиллированной воде с получением полимерного тиксотропного геля, в который добавляют гентамицина сульфат в количестве от 0,5 до 1,5 мас.% и фосфомицин в количестве от 5,0 до 10 мас.%, после чего в полученную смесь добавляют оставшееся количество термически несшитого поливинилпирролидона, и γ-облучению подвергают полученную смесь дозой 10-15 кГр.

Таким образом, изобретение позволяет получать препарат в виде формонеустойчивого стабильного геля, содержащего активные компоненты, вязкость которого в зависимости от концентрации поливинилпирролидона является воспроизводимой величиной. Получаемый гель обладает тиксотропностью, восстанавливающий свои вязкостные свойства после механического воздействия, возникающего при его нанесении на обрабатываемую поверхность, что способствует пролонгированному выделению антимикробных агентов в течение не менее 9 дней.

В результате реализации изобретения получают тиксотропный антимикробный формонеустойчивый гель, включающий термически- и радиационно-сшитый поливинилпирролидон с распределенными в нем активными веществами (гентамицина сульфат и фосфомицин).

Изобретение расширяет арсенал средств, направленных на предупреждение развития и лечение перипротезной инфекции за счет высокой вязкости и широкого спектра активности в отношении ведущих возбудителей данного осложнения.

Осуществление изобретения

Ниже представлено более детальное описание заявляемого способа, которое демонстрирует возможность его осуществления с достижением заявленного технического результата.

При реализации способа получения антимикробного геля на первом этапе часть (80-85 мас.% от исходного количества) среднемолекулярного поливинилпирролидона в сухом виде подвергают термической обработке при температуре 160-180°С в течение 1-8 часов, которая может быть реализована с помощью любых известных из уровня техники средств. Данный режим приводит к образованию сшитого поливинилпирролидона, обладающего значительными водопоглощающими свойствами. Далее сшитый поливинилпирролидон растворяют в дистиллированной воде (в соотношении, например, 1:4) с получением полимерного геля с вязкостью, превышающей 20 Па×с, в который добавляют антимикробные препараты (гентамицина сульфат, фосфомицин). Добавление антимикробных препаратов приводит к резкому снижению значения вязкости системы. Вязкость системы после добавления указанных препаратов может достигать значения 1 Па×с и менее. В полученную смесь добавляют оставшееся количество поливинилпирролидона (не сшитого), при этом вязкость системы увеличивается и после воздействия γ-излучением дозой 10-15 кГр достигает значений от 1 до 20 Па×с. В качестве источника γ-излучения используют изотоп ⁶⁰Со.

Существенным в заявляемом изобретении помимо указанной последовательности действий и выбранных режимов обработки смеси, является также выбор концентрации антибиотиков, включая увеличенное количественное содержание фосфомицина, в комплексе с концентрацией ПВП. При использовании концентраций за пределами указанных минимальных значений образование гелевой структуры не происходит. Очевидно, что лекарственные препараты, хотя и содержат в своем составе ряд активных функциональных групп, тем не менее, не участвуют в процессе сшивания, по сути являются пластификаторами, не взаимодействующими с полимерной матрицей, выполняющими свои функции на надмолекулярном уровне, и таким образом, за счет стерического фактора ингибируют процесс сшивки полимерной матрицы.

Заявляемое изобретение отличается простотой приготовления композиции, отсутствием необходимости применения повышенных доз облучения, стабильными упруго-вязкостными свойствами. Его применение позволяет получить эффективные препараты медицинского назначения широкого спектра антимикробного действия. Заявляемый антимикробный гель является предпочтительным для применения при наличии «сложных» хирургических инфекций, а также при реконструктивных операциях в травматологии-ортопедии для профилактики инфекции области хирургического вмешательства - интраоперационно путем нанесения на имплантат перед его установкой; для лечения инфекции интраоперационно - для обработки тканей в области очага инфекции перед ушиванием операционной раны.

Получаемый антимикробный гель характеризуется следующим качественным и количественным составом: поливинилпирролидон (молекулярной массой 30000D) - 10-30 мас.%; гентамицина сульфат - 0,5-1,5 мас.%; фосфомицин - 5,0-10 мас.%; вода дистиллированная - остальное (до 100%).

Способ получения геля с повышенным содержанием фосфомицина, включая режимы термообработки и γ-облучения, был разработан по итогам проведенных исследований, результаты которых представлены ниже. При этом в процессе исследования были проведены сравнительные испытания гелей, полученных по заявляемому способу (способ 1) и способу - прототипу (способ 2), в основе которого лежало радиационное облучение исходного состава.

В частности, для приготовления геля по способу 2 получали водный раствор среднемолекулярного поливинилпирролидона с молекулярной массой 30000, затем 15 мас.% полученного раствора ПВП (без добавления лекарственных добавок) облучали γ-лучами с интенсивностью 30 кГр, затем в полученную систему вводили 1,2 мас.% гентамицина, и 5 мас.% фосфомицина и оставшийся водный раствор ПВП, после чего смесь стерилизовали с получением гидрогеля. В качестве источника γ-излучения использовали изотоп ⁶⁰Со. Полученный гидрогель характеризовался нестабильными вязко-упругими свойствами, по сути, являясь структурированным раствором при отсутствии тиксотропности. В ряде повторений вязкость была меньше 1 Па×с.

Примеры приготовления геля по заявляемому способу (способу 1) представлены в таблице 1.

Таблица 1

		Примеры
Параметры	1	2	3	4	5	6	7 (прототип)
ПВП, мас.%	10	15	20	30	5	40	15
Термообработанный ПВП, мас.% от общего кол-ва ПВП	80	80	85	83	70	90	_
Гентамицина сульфат, мас.%	1	1,2	0,5	1,5	0,3	2	1,2
Фосфомицин, мас.%	5	6	7	10	3	15	5
Температура термообработки, °С	180	160	170	180	150	200	-
Время термообработки, ч	4	4	5	1	3	7	-
Доза γ-излучения, кГр	10	15	10	15	5	20	30
Вязкость, Па×с	1,20±0,12	1,50±0,15	11,5±1,15	18,0±1,8	0,05±0,01	Гель не образуется	1,0±0,9 Па×с

Было обнаружено, что концентрации ПВП в составе заявляемого геля ниже 10 мас.%, не обеспечивают требуемой вязкости конечного препарата, а также после воздействия температурой и γ-излучением эффективная вязкость 30%-ого раствора поливинилпирролидона была ниже, чем в случае 15%-ого раствора, что объясняется эффектом экранирования, а после испытаний происходило явление синерезиса (выделение воды из геля), поэтому увеличение концентрации поливинилпирролидона более 30 мас.% в составе композиции приводило к ухудшению свойств получаемого геля.

В более ранних исследованиях было показано, что использование гентамицина сульфата (1,2 мас.%) в комбинации с фосфомицином (5,0 мас.%) обладает достаточно широким спектром антимикробного действия. Однако в случае инфекций, вызванных госпитальными штаммами грамотрицательных бактерий, таких как Klebsiella pneumoniae и Pseudomonas aeruginosa, такого действия может быть недостаточно. В связи с чем, были проведены исследования антимикробной активности гидрогеля с более высокими значениями фосфомицина (от 5 до 10 масс %) при значениях гентамицина от 0,5 до 1,5 мас.%, и было обнаружено, что композиция, приготовленная по заявляемому способу демонстрирует увеличение антимикробной активности по сравнению со способом по прототипу. Например, композиция, содержащая большую, чем в прототипе концентрацию фосфомицина (7 мас.%), несмотря на меньшую, чем в прототипе концентрацию гентамицина (0,5 мас.%) демонстрирует увеличение антимикробной активности в 2 раза в отношении Klebsiella pneumoniae АТСС 33495 (см. Пример 3, фиг. 1).

Определение антимикробной активности образцов проводили по методу диффузии в агар. Критерием оценки антимикробной активности служил диаметр зоны подавления роста микрофлоры: до 10 мм - микроорганизмы не чувствительны к нанесенному в лунку препарату; до 15 мм - малая чувствительность культур; до 25 мм - зона задержки расценивается как показатель чувствительности микроорганизмов; более 25 мм - свидетельство высокой чувствительности микроорганизмов (Методические рекомендации Министерства здравоохранения, 1989 г.). На рисунке отчетливо видно, что диаметр зоны задержки роста вокруг лунки с заявленным гелем значительно больше, чем вокруг лунки с гелем прототипом. Это указывает, на более выраженный бактерицидный эффект нового геля.

Далее, для подтверждения сохранения широкого спектра активности геля, получаемого новым способом, согласно примерам 1-4, в качестве тест-культур использовали Staphylococcus aureus АТСС 25923, Klebsiella pneumoniae АТСС 33495. Staphylococcus aureus MRSA ATCC 43300, Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853, Staphylococcus epidermidis ATCC 14990. Тестовые взвеси бактерий приводили к оптической плотности 0,5 по McF (10⁸ КОЕ/мл). Оценку антимикробного действия выполняли через 18-20 часов.

В результате установлено, что исследованные образцы, полученные заявленным способом, практически полностью на всей площади чашки Петри подавляли рост тестовых штаммов стафилококков, включая метициллинорезистентный, а также продемонстрировали значимые зоны подавления для культуры грамотрицательных бактерий - Klebsiella pneumoniae (35 мм) и Pseudomonas aeruginosa (48 мм), что свидетельствует о высокой бактерицидной активности исследуемых образцов геля в отношении широкого спектра возбудителей, в том числе и госпитальных (фиг. 1). Отсутствие роста возбудителей на чашках наблюдали в течение 10 суток, до момента высыхания питательной среды.

Таким образом, при малых концентрациях антибиотиков отсутствует синергетический эффект от одновременного применения фосфомицина и гентамицин сульфата, развитие которого начинается с концентрации 5% по фосфомицину и 0,5 по гентамицину сульфату. При значениях концентраций, гентамицина сульфат более 1,5 мас.% и фосфомицина более 10 мас.% обеспечивается высокая бактерицидная активность, однако не происходит образование тиксотропного воспроизводимого геля с пролонгированным действием антимикробной активности не менее 9 дней.

Изучение влияния различных доз γ-излучения на реологические свойства водных растворов поливинилпирролидона с антибиотиками и воспроизводимость параметров вязкости получаемого гидрогеля показало, что использование дозы γ-облучения 10-15 кГр приводит к достижению вязкости, которая обеспечивает необходимые реологические свойства, приводя к образованию формонеустойчивого тиксотропного стерильного геля, что является приемлемым для применения в ортопедии при лечении перипротезной инфекции. При этом дозы, выбранные из интервала значений 10-15 кГр, одновременно с увеличением вязкости оказывают стерилизующий эффект. Использование дозы γ-облучения ниже 10 кГр не приводит к гелеобразованию, выше 15 кГр - повышает лучевую нагрузку на обслуживающий персонал.

Проведенные исследования показали, что проведение термической обработки порошка поливинилпирролидона при температуре 160-180°С в течение 1-8 часов в технологическом процессе приготовления антимикробного геля обеспечивает получение требуемых параметров вязкости. Термообработанная масса ПВП (2 г.) после измельчения в ступке растворялась в 7,82 г дистиллированной воды с образованием однородной массы гелеобразной консистенции. Вязкость составляла 25,0±0,3 Па×с при скорости сдвига 10 с^-1. В полученную полимерную матрицу вводили раствор антибиотиков: гентамицина сульфат 4,8 мл и фосфомицина 0,8 г. Наблюдалось резкое снижение значения вязкости до 1,6±0,2 Па×с. С целью повышения вязкости в композицию добавляли 0,4 г поливинилпирролидона без термообработки. Готовое антимикробное средство стерилизовали в гамма-установке при комнатной температуре дозой 15 кГр. Вязкость полученной системы составила 5,2±0,5 Па×с. При снижении температуры обработки ПВП до 140°С и увеличении времени обработки до 10 часов, при добавлении воды гель не образовывался, что привело к нецелесообразности проведения исследований влияния температуры и времени термического воздействия на реологические свойства получаемого препарата. При увеличении температуры выше 180°С после добавления воды получали гомогенно неоднородный гель.

Исследования тиксотропных свойств систем, полученных по примерам 1-7 показали следующий результат. По примерам 1-4, 7 характер вязкостно-скоростной зависимости системы показывает уменьшение значения вязкости геля при механическом воздействии на систему. Зависимость вязкости от скорости сдвига через час и через одни сутки после первичного измерения демонстрировала проявление тиксотропных свойств геля, о чем свидетельствуют восстановление вязкости уже через час на 70% от исходного значения, что означает восстановление трехмерной структуры и обеспечение замедленного «высвобождения» активных веществ в отличие от растворов. В случае примеров 5, 6 гелевой структуры не образовывалось.

Пролонгированность действия антимикробного геля была исследована на модели примера 2, полученной из суточной культуры Staphylococcus aureus АТСС 25923. Микробную взвесь готовили в количестве 0,2 мл. Эксперимент проводили при 3-х посевных дозах тест-культуры используя образцы, полученные заявленным способом. Результаты исследования представлены в таблице 2.

Таблица 2.

Посевная доза тест культуры, КОЕ/мл	Размер зон угнетения роста тест-штаммов микроорганизмов, мм
1 сут	2 сут	7 сут	9 сут
108	70	60	55	40
106	75	65	55	45
102	80	70	60	50

В случае примеров 1, 3, 4 антимикробная активность имеет те же зоны подавления.

Установлено, что заявляемый гель вне зависимости от посевной дозы сохраняет высокую антимикробную активность в течение 9-и суток и более.

Кроме того, в результате проведенных экспериментов было установлено, что способ получения гидрогеля γ-облучением по прототипу не обеспечивает воспроизводимость геля с вязкостью 1-20 Па×с. Получаемые системы характеризовались разными значениями вязкости - либо превышающими верхнюю границу заявленного диапазона в несколько десятков раз, либо получаемые системы обладали очень низкой вязкостью. В отличие от способа-прототипа, заявляемое изобретение позволяет получать гель, вязкость которого является воспроизводимой величиной, значение которой зависит от задаваемой концентрации поливинилпирролидона (от 1 до 20 Па×с). Было проведено 10 повторных испытаний на каждую концентрацию поливинилпирролидона, при этом относительное отклонение среднего значения вязкости не превышало 15% для каждой концентрации.

Таким образом, заявленным способом получают формонеустойчивый тикстопропный стерильный гель с широким спектром антимикробных свойств при увеличенной зоне подавления в течение не менее 9 суток и технологически воспроизводимыми свойствами.

Способ получения антимикробного геля, включающий смешение исходных компонентов, в качестве которых используют поливинилпирролидон в количестве от 10 до 30 мас.%; гентамицина сульфат, фосфомицин и воду, а также облучение смеси γ-излучением с использованием изотопа ⁶⁰Со с получением геля вязкостью от 1 до 20 Па×с, отличающийся тем, что поливинилпирролидон в количестве 80-85 мас.% от исходного количества перед смешением предварительно подвергают термической обработке при температуре 160-180°С в течение 1-8 часов, затем полученный термически сшитый поливинилпирролидон растворяют в дистиллированной воде с получением полимерного тиксотропного геля, в который добавляют гентамицина сульфат в количестве от 0,5 до 1,5 мас.% и фосфомицин в количестве от 5,0 до 10 мас.%, далее в полученную смесь добавляют оставшееся количество термически несшитого поливинилпирролидона, после чего полученную смесь подвергают γ–облучению дозой 10-15 кГр.