Способ выделения цефалоспорина с

 

тв V.» ф

ОП И САНИ Е

ИЗОЬЕЕТЕНИЯ

К ПАТЕНТУ

Союз Советских

Социалистических

Республик

Зависимый от патента №

Заявлено 05.Х1 1967 (№ 1200750/23-4) Кл, 12р, 4/01

Приоритет 05.XII.1966, № 17309/66, Швейцария

МПК С 07d 99/24

Комитет па делам изобретений и открытий при Совете Министров ссср

УДК 615.799.9(088.8) Опубликовано 14ЛХ.1970. Бюллетень № 29

Дата опубликования описания 8.XII.1970

Автор изобретения

Иностранец

Вальтер Фозер (Швейцария) Иностранная фирма

«Циба А. Г.» (Швейцария) Заявитель

СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ ЦЕФАЛОСПОРИНА С

ll

Известен способ выделения цефалоспорина

С из ферментационных растворов, содержащих его вместе с цефалоспорином N, заключающийся в том, ч1о очищенный ферментационный раствор пропускают через катионит, содержащий сильнокислые группы в Н+-форме, доводя рН до 2,8 — 4, отделяют катионит от подкисленной среды и пропускают через анионит для полного отделения неорганических анионов, в частности хлоридов, используя для аниопита соли слабых алифатических насыщенных одноосновных кислот.

При работе на иопообменниках большая часть цефалоспорина С уничтожается.

Для уменьшения потерь цефалоспорина С предложен способ, при котором цефалоспорин

С выделяют из разбавленного водного раствора, в особенности ферментационной жидкости, в форме производного, который является особенно способным к переработке в сильнодействующие против бактерий соединения, отводящиеся от 7-аминоцефалоспорановой кислоты, например от 7-фенилацетиламинцефалоспорановой или 7-тиенилацетиламиноцефалоспорановой кислоты.

Способ заключается в том, что разбавленный водный раствор, например культуральную жидкость, содержащий цефалоспорин С, подвергают обработке тринптробензолсульфокислотой или смесью пикрилхлорида и сульфита металла, а затем известным способом выделяют полученный при этом N-тринптрофенилцефалоспорин С.

Способ может быть использован и для очистки сырого цефалоспорпна С; растворяют сырой продукт в воде или другом растворителе и раствор обрабатывают как описано. Так>ке этот способ мо>кпо применять и для очистки производных цефалоспорнна С, имеющих свободную аминогруппу в боковой цепи, например сложных эфиров цефалоспорина С.

Если новый способ применяется для очистки содержащегося в ферментационных растворах цефалоспорина С, реакцию можно проводить в культуральном фильтрате или непосредственно в полученной при ферментации культуральной жидкости.

20 Реакцию с тринитробензолсульфокислотой проводят при комнатной температуре рН

7 — 10, предпочтительно от 8,5 до 9. Прибавляют тринитробензолсульфокислоту в твердой или растворенной форме при перемешивании

25 к раствору, содержащему цефалоспорин С, и держат рН во время реакции в течение

1 — 2 час на указанном уровне. Раствор тринитробензолсульфокислоты получают, пред282174 почтительно, подвергая пикрплхлорид реакции обмена с с льфитом, например сульфитом натрия, калия илп аммония. аствор может быть употреблен без дальнеишей переработки.

Тринитробензолсульфокислогу можно получать непосредственно в растворе, содержащем цефалоспорин С, прибавляя к раствору, например, пикрилхлорид и сульфит натрия.

По окончании реакции рН доводят до — 3, предпочтительно 1,8 — 2 и отделяют тринипгрофенилцефалоспорин С путем экстракции прп помощи не смешиваемого с водой растворителя или смеси растворителей. Например при помощи не смешиваемого с водой спирта, в особенности низшего алканола с 4 — 6 атомами углерода — н-бутилового, амплового спирта, например п-амилового, н-гексилового спирт>, 2-этил-н-бутилово|о. илп бензилового, плп сложного эфира, в особенности сложного низшего алкилэфира низших алкановых кислот —— уксусной, пропионовой, масляной, например сложного бутилового эфира уксусной кислоты.

А также при помощи не смешиваемого с водой кетона, в особенности дпнизшего алкилкетона, например диэтилкетона, метилизобутилкетона; или незамещенного или замещенного, в особенности хлорированного, углеводорода, например хлорированного алкана —— метиленхлорида, хлороформа, этиленхлорнда; нли смесей этих растворителей.

Далее органический экстракт обрабатывают водой при рН 5 — 6 и снова экстрагнруют тем же органическим растворителем прп рll

1,8 — 2 с последующим выделением целевого продукта известным способом.

Пример l. К, 370 л культуральпой жидкости, содержащей цефалоспорин С, прилпьают раствор из 2,72 кг щавелевой кислоты в

10 л воды и 0,9 л раствора одинаковых по объему частей воды и концентрированной серной кислоты, обеспечивая рН 3. После прибавления 8 кг «целатома» (диатомовой земли) массу фильтруют через фильтр-пресс.

Прозрачный фильтрат (320л) содержит 1,57г цефалоспорина С на 1 л. Влажный остаток па фильтре (62 кг) отбрасывают.

Фильтрат приливают к раствору 920 г 2, 4, 6-тринитробензолсульфоновокислого натрия с рН 7,5, который получают, растворяя 796 г безводного сульфита натрия в 3,35 л деионизированной воды, прибавляя 1 кг льда и раствор 1,425 кг, пикрилхлорида за 15 мин в

4,35 л ацетона при перемешиванип. рН смеси растворов доводят при перемешивании до 9,0 концентрированным раствором едкого натра.

Реакционную массу выдерживают в течение

4 час при температуре 26 С и .рН 8,5 — 8,7.

Прозрачный красный реакцпонный раствор, содержащий 2, 4, 6-тринптрофенилцефалоспорин С, экстрагируют при,рН 1,5 — 2,0, которое устанавливают 5н. серной кислотой посредством противоточного экстрактора метилизобутилкетонов. Получают 190 л экстракта метилизобутилкетона. его экстрагируют при помощи противоточного экстрактора 0,2М фосфатбуфером с рН 8. Получают 95 л водного экстракта с рН 6. Из него экстрагируют 2, 4, 6тринитрофенилцефалоспорин С еще раз метплпзобутилкетоном при pl 1 2.

1loëó÷åííûå 50 л органического раствора экстрагируют при рН 6 трижды, употребляя по 4 л воды, Полученный так водный экстракт (12 л) охлаждают от 0 до 4 С, доводят рН до 2,0 6н. соляной кислотой, отсасывают остаток и промывают его ледяной водой. После сушки остается 751 г сырого 2, 4, 6-тринитрофенилцефалоспорина С. Из фильтрата получают еще 269 г продукта.

Тонкослойная хроматограмма на силикагеле

1 в системе и-бутанол — ледяная уксусная кислота — вода (75: 7,5: 21) показывает для 2, 4, 6-трини1рофенилцефалоспорина С относительно пикриновой кислоты, как сравнительного вещества, R> 0,5!. Наряду с этим, можно обна20 ружить пятна сильнее или слабее полярных

4, 6-тринитрофенилсоединений.

Превращение производного в 7-аминоцефалоспорановую кислоту (7-ACA) можно проводить следующим образом.

25 A. 200 г сырого 2, 4, 6-трини грофенилцефалоспорина С суспендируют в 2 л метилизобутнлкетона и приливают раствор 200 г дифенилдиазометана (полученного окислением бензофенонгидразона двуокисью марганца) в 600 мл

З0 метилизобутилкетона. После 1,5 час краснофиолетовый раствор вливают в 10 мл петролейного эфира. При этом осаждается сырой сложный дибензгидрилэфир 2, 4, 6-тринитрофенплцефалоспорина С в виде светло-желтоЗ о порошка. Осадок отсасывают на нутч-филь Iðå, промывают цетролейным эфиром и сушат в вакууме при 40 С. Продукт показывает в тонкослойной хроматограмме на силикагеле в системе толуол — ацетон (8: 2) при рН 0,53, 40 Выход 280 г сложного диэфира чистотой в

44%, в соответствии с выходом 62% относительно имеющегося в культуральном фильтрате цефалоспорина С.

Б. 9,6 г полученного по пункту А сложного

45 дибензгидрилэфира растворяют в 260 мл абсолютного метиленхлорида. После охлаждения раствора до — 18 С приливают 5 мл безводного пиридина и после этого прикапывают при перемешивании в течение 10 мин раствор

50 7,8 г фосфорпентахлорида в 100 мл абсолютного метиленхлорида. Перемешивают еще

45 мин при температуре от — 12 до — 10 С и после этого приливают в течение 5 мин 64 мл охлажденного до — 10 Ñ метанола. Раствор

55 перемешивают 40 мин при — 10 С и затем

1 час при +10 С. После этого приливают при перемешивании 110 мл 2н. соляной кислоты.

Разделяют фазы и экстрагируют водную фазу

100 мл метиленхлорида. Объединенные фазы

60 метпленхлорпда осторожно испаряют в вакууме. После сушки в глубоком вакууме получают смолистый коричневый остаток сырого сложного бензгидрплэфир а 7-аминоцефалоспорановой кислоты (7-ACA).

65 В. Сложный бепзгидрилэфир 7-ЛСЛ раство282174

5 ряют B 5 лгл анизола, приливают при охлажцеппг! 14 ггл трифгоруксусной кислоты, оставляют реагпровать 3U ггии прп 20 — 30 С и после этого приливают охлажденную до — 10 Ñ смесь 25 лгл триэтиламина и 180 лл метанола, рl-1 10%-ной водной суспензии составляет 2,3.

1 оводят рН до 3,5 триэтиламином (6 лгл), охлаждают до — 18 "С и реакционную смесь оставляют кристаллизоваться. Кристалличес! ий осадок о гделяют отсасыванием на путче, промывают метанолом, метиленхлоридом и диэтилэфиром и сушат в глубоком вакууме.

11олучают 7-аминоцефалоспорановую кислоту с чистотой 83,3%. Выход 1,62 г (63,5%, считая па дибензгидрилэфир 2, 4, 6-тринитрофенилцефалоспорина С).

l! р им ер 2. К 10 л культурального фильтрата с содержанием 1340 лгг цефалоспорина ! на 1 л и l90 лгг азота, входящего в состав первичных аминогрупп на 1 л, полученного

Ч>г!.ггьтрацией ферментационного раствора при приоавлении 2% целатома как посредника фпльграции, вносят 60 г 2, 4, 6-тринитробензолсульфокислоты и после установления рН

8,7 выдерживают 2 час при том >ке значении р11. После этого приливают к реакционному раствору 250 г «гифлосуперцеля» и доводят рl-1 при перемешивании с концентрированной соляной кислотой до 4,3. Желтый осадок отсасывают на нутч-фильтре вместе с «гифлосуперцеля». К прозрачному фильтрату прилива!о! 3 л сложного уксусного эфира, рН знагение доводят до 2 соляной кислотой, фазы разделяют и слегка эмульгированную фазу сложного уксусного эфира осветляют фильтрацией в присутствии 50 г «гифлосуперцеля».

Ь однуго фазу экстрагируют еще трижды, употребляя по 1 л сложного уксусного эфира.

К объединенным экстрактам сложного уксусного эфира приливают 1 .г воды и значение рН доводят до 6,5 раствором едкого натра. Фазы разделяют. Фазу сложного уксусного эфира экстрагируют еще трижды при рН

6,0, угготребляя по 0,5 л эфира. К объединенным водным экстрактам прилива!от 1 л сложного уксусного эфира и p1l доводят до 2,0 соляной кислотой. Фазы разделяют и водную фазу экстрагируют еще трижды, употребляя по 0,5 л сложного уксусного эфира. Объединенные экстракты сложного уксусного эфира промывают дважды, употребляя 00 0,3 л насыщенного раствора хлористого натрия, сушат безводным сульфатом натрия и концентрируют до 0,5 л. К этому концентрированному раствору 2, 4, 6-тринитрофенилцефалоспорина С приливают при слабом охлаждении

0,2 л 47,5%-ного раствора дифенилдиазометапа в петролейном эфире. После выдер>кки в течение 45 ггии при комнатной температуре осаждают сложный дибензгидрилэфир 2, 4, 6трипитрофенилцефалоспорина С внесением в

3,5 л петролейного эфира. Осадок отсасывают на путч-фильтре и сушат при 40 С в вакууме.

Выход 51,2 г с содер>капнем 40,4 jo (т. е, 76,2% от теоретического, считая на имеющий55

5

6 ся в культуральном фильтрате цефалоспорина С).

Пример 3. 11,76 г ппкрплхлорпда суспендируют в 36 ггл и-бутанола и прибавляют раствор 6,6 г безводного сульфита натрия в

72 лгл воды. После 30-минутного перемешивания рН 6,5 красную реакционную смесь, содержащую 15 г натриевой соли 2, 4, 6-тринитробензолсульфоновой кислоты, приливают к

6 л водного раствора обогащенного цефалоспорина С (вычисленное содержание натриевой соли цефалоспорина С 12,;5 г; содержание азота, входящего в состав первичных аминогрупп, 1,9%). Доводят рН до 9 раствором едкого натра и потом держат его в течение

1 час при 8,5 — 8,7. После этого приливают к реакционную раствору 1 л смеси и-буталацетата — и-бутанола (1:1) и доводят рН до 2,0 соляной кислотой. После 10 лгии разделяют фазы. Водную фазу экстрагируют еще дважды, употребляя по 500 лгл смеси и-буталацетата — и-бутанола. Объединяют органические экстракты, доводят рН до 5,5 раствором едкого натра и экстрагируюг их 300, потом

200 и, наконец, 100 лгл воды. Все водные растворы еще раз экстрагируют при рН 2 указанной выше смесью и-бутилацетата — и-бутанола (100 .мл, потом дважды 50 мл) и органические экстракты еще раз при рН 5,5 водой (100 лгл, потом дважды 50 мл). К 200 лгл водного раствора прибавляют 10 г «гифлосуперцеля», охлаждают до 0 — 4 С и доводят рН до 1,8 — 2,0 2н. соляной кислотой. При этом осаждается 2, 4, 6-тринитрофенилцефалоспорин С. Lro вместе с посредником фильтрации отсасывают на нутч-фильтре, промывают ледяной деионпзированной водой и сушат 15 час при 40 С. Выход 18,07 г 2, 4, 6-тринитрофенилцефалоспорина С на 10 г «гифлосуперцеля».

В тонкослойной хроматограмме на силикагеле в той же самой системе, как в примере 1, кроме R 0,51, видны еще пятна сильнее полярных и меньше полярных тринитросоединений.

Продукт можно переводить в сложный дпбензгидрплэфир следующим образом.

Полученный продукт суспепдируют в 180 лгл и-бутилацетата и вводят 36 г дифенилдпазометана в 180 лг>г и-бутанола. Суспензию перемешивают 3 час, «гифлосуперцель» отсасывают и прозрачный фильтрат выливают в

1800 лгл петролейного эфира (т. кип. 50 — 70 С) в течение 20 лгии. Отсасывают на нутч-фильтре светло-желтый осадок сырого сложного дибензгидрилэфира 2, 4, 6-тринитрофенилцефалоспорина С, промывают петролейным эфиром и сушат его при 40 С в вакууме. Выход

24,7 г (66%, т. е. 65,3%, считая на имеющийся в исходном растворе цефалоспорин С).

Пример 4. Растворяют 17,3 г пикрплхлорида в 35 лгл í-бугплацетата, вводят раствор

9,8 г безводного сульфита натрия в 60 лгл воды и сильно перемешивают в течение 15 лши.

Фаза бутилацетата при этом становится бесцветной, а водная фаза, содержащая 22 г нат282174

Предмет изобретения

С оста в итель С. Поля кова

Редактор Л. Г. Герасимова Техред Л. В. Куклина Корректор Н. Л, Вронская

Заказ 3516/18 Тираж 480 Подписное

ЦНИИПИ Комитета по делам изобретений и открытий при Совете Министров СССР

Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Типография, пр. Сапунова, 2 риевой соли 2, 4, б-трибензолсульфокпслоты,— интенсивно красной. Прплпва ют красный раствор к 6 л сырого, содержащего цефалоспорин С водного раствора (вычислено 12 г, содержание первичных аминогрупп 1,3% ), доводят рН до 9 раствором едкого патра и перемешивают 2 час при рН 8,5 — 8,7. Процесс ведут аналогично примеру 3. Получают 21,8г сырого 2, 4, 6-тринитрофенилцефалоспорина С на 40 г «гифлосуперцеля».

Этерифицирование в сложный эфир посредством 43,6 г дифенилдиазометана аналогично примеру 3 получают 28,65 г сложного дибензгидрилэфира 2, 4, 6-тринитрофенилцефалоспорина С (55 /о, т. е. 64,6% от теоретического).

Способ выделения цефалоспорина С, отличтощийся тем, что, с целью упрощения процесса, разбавленный водный раствор, содер>каший цефалоспорин С, например культуральную жидкость, подвергают обработке тринитробензолсульфокислотой или смесью пикрилхлорида и сульфита металла при рН 7 — 10, полученный при этом N-тринитрофенилцефалоспорин С выделяют извесгным способом, например путем экстракции органическим растворителем, не смешиваемым с водой, таким как спирт, сложный эфир, или смесью этих

15 растворителей при рН 1 — 4.