Способ выделения n"- -вос-аминокислот

 

ОПИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

368240

Союз Советскит

Социалистических

Республик

Зависимое от авт. свидетельства №

М. Кл. С 07с 101/02

С 07с 99/12

Заявлено 02Х1.1970 (№ 1444749/23-4) с присоединением заявки №

Приоритет

Опубликовано 26.1.1973. Бюллетень № 9

Дата опубликования описания 4.IV.1973

Комитет па делам ивобретений и открытий при Совете Министров

СССР

УДК 547.466.07 (088.8) Авторы изобретения

Заявитель

Н. А. Брусенцов, В. С. Груздев и Ю. П. Швачкин

Институт экспериментальной эндокринологии и химии гормонов АМН СССР

СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ N" -Вос-АМИНОКИСЛОТ

Изобретение относится к способу выделения хроматографических чистых N"-Boc-аминокислот из смесей, образующихся при неполном присоединении трет-бутилоксикарбонильных (— Вос — )-групп к аминогруппам в процессе получения N" -защищенных аминокис-лот, который может быть использован в синтезе инсулина и других полипептидов на полимерных носителях.

Известен способ выделения хроматографи- 10 чески чистых N"-Вос-аминокислот из их смесей с соответствующими незащищенными аминокислотами путем превращения сырого продукта в дициклогексиламмониевые соли с .последующей кристаллизацией и выделением свободных N -Вос-аминокислот. Выход

71 — 83%.

С целью упрощения процесса и повышения выхода целевого продукта предлагается спиртовой раствор неочищенных N" -Вос-аминокис- 20 лот (N" -Вос-L-Thr, N" -Вос-O-Bzl-L-Thr, N"Boc-No - Tos-L-Arg, N" -Вос-No -NO,-L-Arg, N" -Вос-L-Asn, N" -Вос-L-Gln, N" -Вос-1 -Phe, N" -Вос-1-Val, N" -Вос-;-OBzl-L-Gln, N" -BocО-Bzl-L-Ser, N" -Вос-N- -L-Gys, N " -Вос-OBzl- 25

L-Tyr, N -Вос-Gln, N" -Вос-S-Bzl-l.-Cys, метиловый эфир N" -Вос-Ь-His, N -Вос-L-His, N" -Boc-N-D„-L-His, N " -Bos-1 -Zen, N" -ВосЬ-Аlа) обрабатывать сульфированным сополимером полистирола с дивинилбензолом а0

ЬН+-форме (КУ-2, Дауэкс-50WX 2, Дауэкс50WX 4, Дауэкс-50WX 8, амберлит 1К-120), взятым в 0,001 †-кратном, предпочтительно 1,5 — 3-кратном избытке по отношению к общему количеству смеси, и процесс проводить при 1 — 40 C, предпочтительно при

20 — 25=C, и рН среды 2 — 5, предпочтительно

2,5 — 3,5.

При непрерывном получении хроматографически чистых N -Вос-аминокислот из смесей процесс целесообразно проводить на прямоточных сорбционных колоннах рециркуляцией катионита в каждой колонне либо в одной противоточной многосекционной колонне с псевдоожиженным слоем катионита.

Предложенный способ проще известного, поскольку исключаются операции перекристаллизации и получения дициклогексиламмониевых солей. Выход 98 — 100% (на количество N -Вос-аминокислоты, содержащейся в смеси). Получаемые в виде сиропа хроматографически чистые продукты могут быть использованы в синтезе инсулина. При регенерировании смолы, кроме того, получают гидрохлориды соответствующих аминокислот с незащищенными аминогруппами с выходом

80 — 90% (на количество аминокислоты с незащищенной аминогруппой, содержащейся в смеси).

368240

Ионообмепная реакция происходит в условиях, исключающих возможность уменьшения оптической активности препаратов.

Способ прост, поскольку реакция происходит при атмосферном давлении, умеренной температуре, п не требует специального оборудования, Во всех примерах испочьзуют смолу КУ-2 в

Н+-форме, с величиной сшивки 8 — 10О/о и обменной емкостью 4,9 — 5,1 мг-экв/г или смолу

Дауэкс-50WX в Н+-форме с величиной частиц

100 — 200 ме и.

Для анализа полученных соединений используют тонкослойную хроматографию на силикагеле, Пример 1. Выделение N" -Вос-L-Thr из смеси с 1 -треонином.

1,06 г смеси, состоящей из 0,43 г (40,5 /О)

1-треонина и 0,63 г (59,5 p) N"-Вос-L-Thr, растворяют в 300 мл метилового спирта, прибавляют 4,0 г ионообменной смолы КУ-2 или

6,0 г Дауэкс-50WX 8, перемешивают 4 час при

20 — 25 С, в конце реакции рН раствора равен 3. Смесь фильтруют, смолу промывают на фильтре 3)(10 мл метиловым спиртом.

Объединенные фильтр аты упаривают при

40 С на вакуумном роторном испарителе и высушивают в вакуум-эксикаторе над фосфорным ангидридом до постоянного веса. Выход N" -Вос-L-Thr, получаемой в виде медленно кристаллизующегося сиропа, 0,625 г (99О/о).

Rr 0,4 (хлороформ-метиловый спирт-уксусная кислота, 85: 10:5). По литературным данным т. пл. 76 — 80 С, (а) o —— 2,52 (с=0,98, метиловый спирт) .

К отработанной ионообменной смоле прибавляют 120 мл раствора 0,05 н. соляной кислоты в метиловом спирте (1: 1), перемешивают 3 час, фильтруют, промывают смолу на фильтре 3)(10 мл 0,05 н. метанольным раствором соляной кислоты. Объединенные фильтраты упаривают при 40 C в вакууме и высушивают в вакуум-эксикаторе над гранулированным КОН до постоянного веса. Выход гидрохлорида 1-треонина 0,51 г (91О/о).

Пример 2. Выделение N" -Boc-L-Phe из смеси с 1 -фенилаланином.

0,62 г N -Вос-1-Phe, содержащего 3 /о 1--фенилаланина, растворяют в 100 мл метилового спирта, прибавляют 2,0 г ионообменной смолы

КУ-2 или 2,0 г Дауэкс-50WX 4, перемешивают

3 час при 20 — 25 С (рН равен 3 в конце процесса) и обрабатывают затем, как в примере 1. Выход N" -Вос-1-Phe 0,60 г (100 /о). Продукт имеет вид сиропа, медленно кристаллизующегося при хранении. R< 0,75 (хлороформметиловый спирт-уксусная кислота, 85: 10: 5), по литературным данным т. пл. 79 — 80 С.

К отработанной ионнообменной смоле прибавляют 30 мл 0,05 н. соляной кислоты, перемешивают 2 час, фильтруют, промывают ионообменную смолу на фильтре 3)(10 мл 0,05 н. соляной кислотой и выделяют 0,022 г (99 /о), 5

Зо

60 б5 гидрохлорида L-фенилаланина, как указано в примере 1.

Пример 3. Выделение Вос-1 -Pro из смеси с L-пролином.

0,6 г Вос-1-Pro, содержащего 17 /, 1-пролина, растворяют в 250 мл метилового спирта, прибавляют 4,0 г смолы КУ-2 или 4,0 г

Дауэкс-50%Х 8, перемешивают 2 час при

20 — 25 С (в конце процесса рН 3,5) и обрабатывают реакционную смесь, как в примере 1.

Выход Вос-1-Pro 0,49 г (99 /p). Кг 0,32 (хлороформ-уксусная кислота, 95: 5). Rr 0,72 (ацетон-уксусная кислота, 98: 2).

К отработанной ионообменной смоле прибавляют 120 мл 0,05 н. метанольного раствора соляной кислоты (1: 1), перемешивают 3 час, фильтруют, промывают ионообменную смолу на фильтре 3)(10 мл метанольным раствором

0,05 н. соляной кислоты и выделяют 0,12 г (91 /О) L-пролина, как указано в примере 1.

П р и м ер 4. Выделение N" -Вос-1-Val из смеси с.1 -валином.

0,590 г N -Вос-1-Val, содержащего 9О/, 1-валина, растворяют в 75 мл метилового спирта, прибавляют 2,0 г смолы КУ-2 или 2,0 г

Дауэкс-50ЪЧХ 2, перемешивают 2 час при

20 — 25 С (в конце процесса рН 3) и обрабатывают смесь, как в примере 1.

Выход N"-Boc-,1 -Val, имеющего вид густого сиропа, 0,52 г (96 /о); (Rr 0,76 (хлороформ-метиловый спирт — уксусная кислота, 85: 10: 5); по литературным данным т. пл. 77 — 79 С.

К отработанной ионообменной смоле прибавляют 40 мл 0,05 н. соляной кислоты, перемешивают 2 час и поступают дальше, как указано в примере 2. Выход гидрохлорида L-валина 0,06 г (92 /о).

Пример 5. Общий способ выделения

N"-Boc-1-аминокислот из смесей с 1.-аминокислотами, содержащими незащищенные аминогруппы.

10,0 г смеси N" -Вос-L-аминокислоты с

L-аминокислотой растворяют в метиловом спирте, прибавляют 30,0 г ионообменной смолы КУ-2 или 30,0 г Дауэкс-50WX 4, перемешивают 4 час при 20 — 25 С и в процессе перемешивания отбирают пробы для хроматографии. Перемешивание прекращают, когда на хроматограмме обнаруживают единственное пятно, соответствующее N -Вос-1 -аминокислоте. В конце процесса рН раствора 2,5 — 5,0.

Смесь фильтруют, промывают смолу на фильтре 3)(100 мл метиловом спиртом. Объединенные фильтры упаривают при 40 С в вакууме и высушивают в вакуум-эксикаторе над фосфорным ангидридом до постоянного веса.

Выход N -Вос-1 -аминокислоты 100 /о.

Общий способ выделения гидрохлорида

1 -аминокислоты, К отработанной иопообменной смоле прибавляют метанольный раствор 0,05 н. соляной кислоты (1: 1), перемешивают 3 час, фильтруют, три раза промывают смолу на фильтре метанольным раствором 0;05 н. соляной кислоты, объединенные фильтраты -упаривают

368240

Составитель Л. Иоффе

Техред Т. Курилко

Редактор Т. Шарганова

Корректор Е. Сапунова

Заказ 665/6 Изд. № 200 Тираж 523 Подписное

ЦНИИПИ Комитета по делам изобретений и открытий при Совете Министров СССР

Москва, )К-35, Раушская наб., д. 4(5

Типография, пр. Сапунова, 2 при 40 С в вакууме и высушивают в вакуумэксикаторе над гранулированным КОН до постоянного веса. Выход гидрохлорида .1 -аминокислоты 95 /о.

Предмет изобретения

1. Способ выделения N " -Вос-аминокислот из реакционных смесей, отличающийся тем, что, с целью упрощения процесса и повышения выхода целевого продукта, спиртовой раствор реакционной смеси обрабатывают сульфированным сополимером полистирола с дивинилбензолом в Н+-форме, взятым в 0,001—

50,0-кратном избытке по отношению к количе5 ству смеси, и процесс проводят при 1 — 40 С и рН среды 2 — 5.

2. Способ по и. 1, отличающийся тем, что процесс проводят в присутствии 1,5 — 3-кратного избытка ионообменной смолы при 20—

lo 25 С и рН 2,5 — 3,5.