Способ количественного определения гормонального препарата в мясных тканях

 

О П И С А Н И Е оп 438928

ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

Союз Советских

Социалистических

Республик (61) Зависимое от авт. свидетельства (22) Заявлено 07.09.72 (21) 1827733/28-13 с присоединением заявки № (32) Приоритет

Опубликовано 05.08.74. Бюллетень № 29

Дата опубликования описания 20.1.75 (51) М. Кл. G Oln 33/12

Государственный комитет

Саеета Министрае СССР па делам иеобретений и открытий (53) УДК 637.516(088.8) (72) Авторы изобретения

Л. Ф. Адигамов и М. Ф. Нестерин

Институт питания АМН СССР (71) Заявитель (54) СПОСОБ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ

ГОРМОНАЛЬНОГО ПРЕПАРАТА В МЯСНЪ|Х ТКАНЯХ

Изобретение относится к мясной промышленности, а именно к способу количественного определения диэтилстильбэстрола в мясе и субпродуктах.

Известен способ количественного определения гормональных препаратов в мясных тканях путем экстракции препарата из тканей, гидролиза, его перераспределения в растворителях, хроматографической очистки и последующего денситометрического исследования.

Однако такой способ не обеспечивает достаточной чувствительности и надежности анализа.

Для устранения указанного недостатка в предлагаемом способе экстракцию осуществляют в 2 этапа: в поле центробежных сил и на адсорбционной колонне, гидролиз проводят в растворе неорганической кислоты с добавлением растворителя, а хроматографическую очистку ведут последовательно распределительным и адсорбционным методами.

Предлагаемый способ осуществляют следующим образом.

Берут три пробы (по 250 г) мясной ткани (мышц, печени или почек). Экстракцию, гидролиз и первый этап очистки в системе

СНСIЗ вЂ” НеΠ— NaqCOq — NaOH проводят для каждой из трех проб отдельно. Тщательно измельченную ткань дважды экстрагируют в центробежном экстракторе 96%-ным этанолом (500 мл). После фильтрования через бумажный фильтр ткань смешивают с равным по весу количеством целита — 545, переносят на экстракционную колонну (0,8 6,0 см) и вновь экстрагируют 96% -ным этанолом (1000 мл на

250 г ткани). К 1500 мл объединенного этанольного экстракта каждой пробы добавляют

50 мл 2 н. НСI, выпаривают до объема 100—

1О 150 мл и проводят очистку в системе хлороформ — вода — углекислый натрий — гидрат окиси натрия. К гидролизату добавляют 100 мл хлороформа и 300 мл воды. После встряхивания и разделения слоев хлороформную фа15 зу переносят в делительную воронку и промывают 100 мл воды. Экстракцию хлороформом и его промывание повторяют еще дважды (по

50 мл хлороформа). Водные фазы отбрасывают. Хлороформные фазы объединяют и их

20 дальнейшую обработку последовательно проводят в трех делительных воронках. Первая воронка содержит 20 мл 10% -ного Иа2СО3, вторая и третья воронки по 40 мл 1%-ного

NaOH. После встряхивания и разделения фаз

25 СНСIе-слой и Nà CO -слои отбрасывают. Объединенные NaOH слои подкисляют 2 í. HCI и трижды экстрагируют 30 мл хлороформа.

При наличии желтой окраски конечных хлороформных экстрактов обработку в системе

30 Na>CO — NaOH повторяют, 438928

Составитель С, Белая

Редактор Л. Гончарова

Техред 3, Тараненко Корректор Н. Аук

Заказ 3711/15 Изд. № 126 Тираж 651 Подписное

ЦНИИПИ Государственного комитета Совета Министров СССР по делам изобретений и открытий

Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Типография, пр. Сапунова, 2

В дальнейшем экстракты трех проб (соответствующей ткани) объединяют и выпаривают в вакууме. Сухой остаток растворяют в

30 мл 70 /о метанола и интенсивно встряхивают в делительной воронке с 8 мл гексана.

Гексан дважды промывают равным объемом

70о/о метанола и отбрасывают. Метанольные экстракты объединяют и выпаривают в вакууме; водный остаток после подкисления 2 н.

НС1 дважды экстрагируют хлороформом (по

30 мл). Водную фазу отбрасывают. Хлороформ обезвоживают, выпаривают до объема

1 — 2 мл и наносят на колонку силикагеля Л (0,6к,8,0 см) . Элюирование проводят (0,5 мл/мин) 20 мл хлороформа (фракция 1, не содержащая диэтилстильбэстрол) и 30 мл

1 этанола в хлороформе (фракция 2, содержащая диэтилстильбэстрол). Фракцию 2 выпаривают на роторном испарителе до минимального объема и наносят на пластину силуфола. Хроматографируют в системе растворителей эфир — бензол (1: 4). Пластину силуфола облучают в УФ-свете в течение 30 мин, вырезают полосу хроматограммы (4 ;15 см) с проявленными пятнами специфического продукта фотохимической реакции — 3,4,5,6,12,13гексагидро-3,6-диоксо - 9,10-диэтилфенантрен; денситометрируют в отраженном свете на экстинкционно-регистрирующем приборе ЕЮ-6.

При отсутствии условий для денситометрии количественное определение после хроматографии на бумаге (в системе бензол — метанол — вода, 5:7:3) или в тонком слое силикагеля (этанол — бензол, 1: 9) проводят спектрофотометрическим или фл1оорометрическим методами. Спектрофотометрически (при Х

910 нм) измеряют (после УФ-облучения в смеси 96%-ный этанол — 1,8 /о-ной К НР04, 1: 1) окрашенный в желтый цвет продукт фотохимической реакции; флюорометрически определяют 3,6-дигидрокси-9,10-диэтилфенантрен (возбуждение флюоресценции при Х

360 нм, измерение при Х 400 нм).

Предмет изобретения

1. Способ количественного определения гормонального препарата в мясных тканях, например диэтилстильбэстрола, путем экстракции препарата из ткани, гидролиза, перерас15 пределения в растворителях, хроматографической очистки и последующего денситометрического исследования, отличающийся тем, что, с целью повышения чувствительности и надежности анализа, экстракцию осу20 ществляют в два этапа: вначале в поле центробежных сил, а затем с помощью адсорбции, гидролиз проводят в растворе неорганической кислоты с добавлением растворителя, а хроматографическую очистку ведут последова25 тельно распределительным и адсорбционным методами.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что перераспределение гидролизата проводят последовательно в двух системах растворите30 лей: вначале в системе хлороформ †вода †углекислый натрий †гидр окиси натрия, а затем в системе метанол †гексан †хлоро.

3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что денситометрическое исследование

35 проводят с применением фотохимической реакции.