Способ определения триглицеридов в веществах

 

Союз Советскнк

Сокналнстнчвсккх гспубпнг Ц Q Q g P Я Т Я Я Д Я (i) 505382

К и АТЕНТУ (61) Дополнительный к патенту (51) М. Кл. G 01N 31/14 (22) Заявлено 19.06.73 (21) 1933651/28-13

Государственный комитет

Совета Министров СССР ла делам изобретений н открытий (23) Приоритет — (32) 19.06.72 (31) P 2229849.3 (33) ФРГ

Опубликовано 28.02.76. Бюллетень № 8 (53) УДК 543,9(088.8) Дата опубликования описания 14.07.76 (72) Авторы изобретения

Иностранцы

Аугуст Вильхельм Валефельд, Ханс Меллеринг, Вольфганг Грубер, Эрик Бернт и Петер Решлау (ФРГ) Иностранная фирма с<Берингер Маннхайм ГмбХ» (ФРГ) (71) Заявитель (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ТРИГЛИЦЕРИДОВ

В ВЕЩЕСТВАХ

Изобретение относится к способам определения триглицеридов в веществах и может быть использовано как при анализе пищевых продуктов, так и в медицинских целях.

Известен способ определения триглицеридов в веществах, например пищевых продуктах, предусматривающий их ферментативное омыление путем добавления к пробе липазы и последующее измерение количества образовавшегося глицерина.

Недостаток ферментативного расщепления по известному способу состоит в том, что омыление протекает продолжительное время и, кроме того, при осуществлении этого способа необходимо использовать значительные количества дорогого фермента. Для того чтобы реакция протекала в приемлемый промежуток времени, необходимо в одну пробу добавлять около 1 мг фермента. Время реакции превышает 30 мин, поэтому способ мало пригоден для проведения быстрых лабораторных исследований, в частности при частых определениях. Наконец, выделившаяся в свободном состоянии кислота жирного ряда образует с ионами кальция и магния нерастворимые мыла, которые, если не проводить центрифугирование, приводят к помутнению и, следовательно, искажению результатов измерения.

С целью упрощения и уменьшения времени определения предложено наряду с липазой к пробе добавлять карбоксилэстеразу и алкилсульфат щелочного или щелочноземель5 ного металла, содержащего в алкильном остатке от 10 до 15 атомов углерода. Алкилсульфат рекомендовано добавлять в количестве от 0,001 до 0,1% (вес/объем), а омыление проводить при рН от 6 до 9. При этом жела10 тельно наряду с карбоксилэстеразой и алкилсульфатом в пробу дополнительно вводить альбумин сыворотки в количестве от 0,1 до

2,0 мг/мл.

15 Количество липазы, необходимое для одного определения, составляет около 20 мкг. Определение проводят при комнатной температуре.

B качестве липазы предпочтительно исполь20 зовать липазу из Rhizopus arrhizus, а в качестве карбоксилэстеразы (БС 3.1.1.1) карбоксилэстергидролазу — препарат, получаемый из печени млекопитающих, в частности из печени свиньи.

25 Однако применение могут находить также и другие карбоксилэстеразы. Вполне достаточно использовать приблизительно 100 мкг эстеразы на одно определение.

505382

3 ,4

Среди алкилсульфатов желательно использовать соли щелочных металлов, так как они не образуют нерастворимого мыла с выделяющимися жирными кислотами.

При добавлении альбумина сыворотки в 5 пробу можно использовать алкилсульфаты щелочноземельных металлов, например додецилсульфат в количестве до 0,001% (вес/oRем). Количества более 0,1% приводят к образованию пены и некоторому замедлению реак- 10 ции. По этой причине нецелесообразно применять алкилсульфат в таких количествах.

Определение можно проводить при рН от

6 до 9. Оптимальная область рН лежит между

7 и 8,5, что позволяет проводить омыление и 15 измерение количества образовавшегося глицерина в одной реакционной смеси.

Ионы кобальта и/или магния оказывают активирующее действие на липазу и эстеразу и поэтому могут быть добавлены к реакционной 20 смеси для еще большего ускорения реакции.

В качестве буферов могут быть использованы все эффективные в указанной выше области значений рН буферы, кроме фосфатного. Пригодными буферами являются триэта- 25 ноламиновый, амидазольный, вероналовый, глициновый, трис-буфер, а также, что менее желательно, амидольный, боратный и коллидиновый.

Пример 1. Готовят состоящий из пяти З0 компонентов реактив, который можно хранить в течение 1 — 2 дней.

Компонент

Состав

1 0,1 М триэтаноламиновый буфер 85 (рН 7,6), содержащий 3 ммоля сернокислого магния, 1,5 мг/мл альбумина сыворотки крупного рогатого скота и 0,1 мг/мл додецилсульфата натрия. 40

II Раствор, содержащий 6 ммолей

НАДН, 33 ммоля АТФ " и

11 ммолей фосфоэнолпирувата в дистиллированной воде.

Ш Суспензия кристаллов, содержа- 45 щая 2 мг/мл лактатдегидрогеназы и 1 мг/мл пируваткиназы.

IV Раствор, содержащий 0,2 мг/мл липазы из Rhizopus arrhizus u

4,0 мг/мл карбоксилэстер азы. 50

V Суспензия кристаллов, содержащая 2 мг/мл глицеринкиназы, Смешивают 2,9 мл компонента I, 0,1 мл компонента IIи0,,02 мл компонента III, и смесь нагревают до 25 С. Затем добавляют 55

0,1 мл сыворотки, которая содержит триглицериды, подлежащие определению, и полученную смесь выдерживают 5 мин при указанной температуре.

После этого к реакционной смеси добавля- 60 ют 0,1 мл компонента IV, смесь выдерживают 15 — 20 мин при указанной температуре и

" Никотинамидадениндинуклеотид в гидрированной форме.

"" Аденозинтрифосфат. 65 сразу же после этого определяют поглощение при 366 им или 340 нм. Найденное значение обозначают Еь После этого к пробе добавляют 0,02 мл компонента V и через 10 мин опять определяют поглощение. Измеренное значение обозначают Е2. Через 10 мин снова определяют поглощение и полученное значение обозначают Ез.

Расчет проводят по уравнению:

ЬЕ = (Е, — Е,) — (Е, — Е,).

Общее содержание глицерина в триглицеридах (в мг на 100 мл) равно ЛЕ.89,1.

Вышеописанное определение повторяют 9 раз, причем каждый раз прибавляемое количество сыворотки уменьшают на 0,01 мл.

При нанесении на график полученных значений ЛЕ по отношению к добавленному количеству сыворотки получают прямую линию (см. чертеж).

Из найденных значений рассчитывают пропорциональность cr = 0,9986. Сравнение

cr (идеальн.) =1000 показывает высокую точность метода.

Пример 2. Опыт, описанный в примере 1, повторяют с использованием стандартного раствора триглицеридов.

В опыте 1 в реакционную смесь не добавляют карбоксилэстеразу и додецилсульфат, в опыте 2 — додецилсульфат, а в опыте 3— карбоксилэстеразу.

Результаты определения количества триглицеридов представлены в таблице как процентное отношение экспериментально полученных значений к тем концентрациям триглицеридов, которые добавлены в реакционную смесь.

Количество триглицеридов по отношению к исходному, %

Додецилсульфат

Опыт, %

Эстераза

16

24

78

101

Формула изобретения

1. Способ определения триглицеридов в веществах, например пищевых продуктах, предусматривающий их ферментативное омыление путем добавления к пробе липазы и последующее измерение количества образовавшегося глицерина, отличающийся тем, что, с целью упрощения и уменьшения времени определения, наряду с липазой к пробе добавляют

Приведенные данные показывают, что при соблюдении выбранных условий в отношении концентрации липазы лишь соответствующая предлагаемому способу комбинация компонентов пригодна для количественного определения.

505382

zoo.200.<оо.080 .аи.020

10/ f0

r/ 0

Составитель Н. Минеева

Редактор Н. Спиридонова

Техред Т. Курилко

Корректор О. Тюрина

Заказ 1504/16 Изд. ¹ 1168 Тираж 1029 Подписное

ЦНИИПИ Государственного комитета Совета Министров СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Типография, пр. Сапунова, 2

5 карбоксилэстеразу и алкилсульфат щелочного или щелочпозсмельного металла, содержащего в алкильном остатке от 10 до 15 атомов углерода.

2. Спосоо по п. 1, отл и ч а ю щий с я тем, что наряду с карбоксилэстеразой и алкилсульфатом в пробу дополнительно вводят альбумин сыворотки.

3. Способ по пп. 1 и 2, отличающийся тем, что омыление проводят при рН от 6 до 9.

4. Способ по пп. 1 — 3, отличающийся тем, что алкилсульфат добавляют в количе5 стве от 0,001 до 0,1% (вес/объем).

5. Способ по пп. 1 — 4, о тл и ч а ю шийся тем, что альбумин сыворотки добавляют в количестве от 0,1 до 2,0 мг/мл.