Способ получения токсоплазменного антигена

 

Союз Советских

Социалистических

ОП ИСАН И Е пц533376

ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

Республик (61) Дополнительное к авт. свид-ву (22) Заявлено 31.08.73 (21) 1966651/15 с присоединением заявки № (23) Приоритет

Опубликовано 30.10.76. Бюллетень № 40

Дата опубликования описания 17.11.76 (51) М. Кл А 61В 10/00

Государственный комитет

Совета Министров СССР по делам изобретений и открытий (53) УДК 619.616.9.993. .! (088.8) (72) Авторы изобретения (71) Заявители

Ж. К. Омаров, А. А. Боровиков и В. М. Красов

Научно-исследовательский ветеринарный институт и институт зоологии АН Казахской ССР (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ТОКСОПЛАЗМЕННОГО АНТИГЕНА

Изобретение относится к области иммунохимии, в частности к способам получения биологических диагностических препаратов, а именно — антигена для серологической диагностики токсоплазмоза.

Известны способы получения антигенов для диагностики токсоплазмоза из инвазионного материала путем экстракции его эфиром и спирт-эфирно-фенольной смесью.

Однако этот способ трудоемок и длителен, при этом антиген, получаемый по известному способу, не дает четких положительных серологических реакций с сыворотками крови спонтанно или экспериментально зараженных токсоплазмой сельскохозяйственных и диких животных.

Наиболее близким по технической сущности и достигаемому эффекту к предлагаемому изобретению является способ, включающий извлечение и отмывку токсоплазм от клеточных элементов исходного сырья, дезинтеграцию клеток токсоплазм ультразвуком и выделение из полученного ультразвукового лизата антигенной фракции изоионным фракционированием.

Однако этот способ также оказался неприемлемым для получения антигена из токсоплазм, так как получаемые антигенные препараты проявляют в серологических реакциях недостаточно выраженную специфичность: они дают положительные результаты не только с гомологичными токсоплазменными сыворотками крови, но и с антисывороткой на нативный перитонеальный экссудат здоровых белых мышей, что указывает на наличие в антигенах балластных веществ, снижающих их активность и специфичность.

Цель изобретения состоит в разработке экспресс-способа получения стандартного однородного антигена с высокоактивными и специфическими свойствами, пригодного для использования в нескольких иммунологических реакциях: в реакции связывания комплемента (РСК), реакции непрямой гемагглютинации (РНГА) и реакции иммунодиффузии в агаровом геле (РП-гель) для серологической диагностики токсоплазмоза.

Постановленная цель достигается тем, что в известном способе, включающем извлечение

2о и отмывку токсоплазм от клеточных элементов исходного сырья, дезинтеграцшо токсоплазм обработкой ультразвуком и выделение антигенной фракции изоионным фракционированием. ультразвуковую дезинтеграцшо

25 клеток токсоплазм проводят 2 — 3-. . кратно с отделением лизата оболочек токсоплазм и выделением из него антигенной фракции изоионным фракционированием при дополнительном воздействии на лизат ультразвуком с позв следующей очисткой антигепной фракции от

8М376 неспецифических балластных веществ добавлением к ней антисыворотки.

Способ получения антигена заключается в следующем.

Для проведения способа необходимы следующие реактивы и растворы: натрий хлористый (х. ч.), едкий натр (х. ч.), серная или соляная кислота (х. ч.), 0,25, 0,5 и 1 н. растворы едкого натра, 0,25, 0,5 и 1 н. растворы серной или соляной кислоты 0,85 /ю-ный раствор хлористого натрия (физиологический раствор) .

Получение исходного сырья.Материалом для получения токсоплазменного антигена служит перитонеальный экссудат белых мышей, зараженных эталонным штаммом токсоплазм или одним из вирулентных штаммов, выделенным от сельскохозяйственных животных. Для этого белых мышей весом

16 — 18 г партиями по 200 — 250 голов заражают перитонеальным экссудатом от исходных штаммных токсоплазменных мышей. Экссудат для заражения разводят стерильным физиологическим раствором так, чтобы в поле зрения микроскопа (увеличение 15 40) были видны

1 — 3 токсоплазмы. Доза заражения мышей—

0,2 мл. На 4 — 5 день после заражения мышей наркотизируют эфиром и стерильным шприцом из брюшной полости извлекают перитонеальный экссудат. Брюшную полость каждой мыши дополнительно промывают 0,5 мл физиологического раствора. Собранный материал проверяют на наличие токсоплазм и отсутствие посторонней микрофлоры путем микроскопирования мазков. После проверки экссудат центрифугируют в стерильных пробирках в течение 30 — 45 мин при 3 — 4 тыс. об/мин, Надосадочную жидкость удаляют.

Осадок содержит токсоплазмы и примесь лейкоцитов и гистиоцитов перитонеального экссудата мышей. Чтобы избавиться от этих клеточных балластных компонентов осадок ресуспензируют в 5 — 10 мл физиологического раствора и затем многократно пропускают через тонкую иглу шприца для разрушения клеточных элементов экссудата. К полученной взвеси добавляют 10 — 15 мл физиологического раствора, снова пропускают через иглу шприца и после этого центрифугируют при 2—

3 тыс. об/мин в течение 45 — 60 мин. Надосадочную жидкость отбрасывают, а обработку осадка повторяют еще 2 — 3 раза, после чего отмытый осадок токсоплазм пригоден для приготовления антигена.

Градуированная дезинтеграция т о к с о п л а з м. Дезинтеграцию осуществляют в поле ультразвуковых волн низкочастотного диспергатора (УЗДН) градуированно в три приема: первые две обработки проводят в физиологическом растворе, последнюю — основную — в дистиллированной воде.

В стеклянный сосуд с водяным охлаждением вносят 1 — 2 г отмытых токсоплазм, заливают 50 — 100 мл физиологического раствора и создают в контактной среде ультразву60

15 — 20-минутным центрифугированием при

8 — 10 тыс. об/мин.

Надосадочную жидкость (лизат IV) снова прогревают ультразвуком до оптимальной температуры 35 — 40 С, медленной нейтрализацией 0,5 — 1,0 и. раствором серной кислоты

4 ковые колебания частотой 22 — 35 кгц и акустической мощностью 20 — 50 вт/см в течение

5 — 10 мин. Взвесь частично разрушенных токсоплазм центрифугируют при 8 — 10 тыс. об/мин в течение 15 мин. Надосадочную жидкость (лизат 1) сливают, а к осадку добавляют 50 †1 мл физиологического раствора и обработку токсоплазм повторяют также при частоте 22 — 35 кгц, но мощности 50 — 75 вт/см и уже в течение 30 — 40 мин, Взвесь разрушенных токсоплазм центрифугируют при 8—

10 тыс. об/мин 15 мин. Надосадочную жидкость (лизат II), представляющую собой солерастворимую протоплазматическую часть токсоплазм, отделяют от осадка оболочек ток. соплазм, который промывают в дистиллированной воде 2 — 3-х кратным центрифугированием при вышеуказанном режиме. Отмытый осадок ресуспензируют в 20 — 30 мл дистиллированной воды, среду усредняют 0,25 — 0,5 н. раствором едкой щелочи в пределах рН 8,0—

8,2, переносят в сосуд для озвучивания и обрабатывают ультразвуком частотой 22—

35 кгц, мощностью 40 — 60 вт/см 5 — 10 мин.

Небольшое количество нерастворившегося осадка отделяют от жидкой части центрифугированием.

Полученная надосадочная жидкость — водный раствор оболочек токсоплазм (лизат

I I I) — является материалом для получения специфического токсоплазменного антигена.

Ультразвуковое изоио нное фокусирование и выделение специфической антигенной фракции. ФракЗ5 ционирование ультразвукового лизата III начинают с фокусирования балластных фракций, которые могут содержаться в лизате при недостаточно полной предварительной очистке токсоплазм и недостаточно тщательном граду4О ированном разделении токсоплазм ультразвуком на лизат II I и неспецифические протоплазматические лизаты 1 и II. Для этого лизат 111 переносят в химический стакан на

50 — 100 мл и подвергают 2 — 3-минутному воз45 действию ультразвуковой частотой 22 — 35 кгц и мощностью 50 — 75 вт/см (без применения охлаждающей системы!), что приводит к быстрому прогреванию обрабатываемой среды до оптимальной для последующего фракцио5Î нирования температуры 35 — 40 С. Электрометрическим титрованием с помощью рН-метра и 0,5 — 1,0 н. раствора едкого натра лизат III подщелачивают до рН 10,5 — 11,5, в пределах которых фокусируется в виде мел55 ких хлопьев небольшое количество осадка— антигенная фракция «А». Для полноты осаждения стакан с лизатом 111 дополнительно выдерживают в термостате при 37 С 20—

30 мин. Сформировавшийся осадок отделяют

533376

10

5 доводят рН среды до 9,0 — 9,5 и фокусируют антигенную фракцию «В;>. Лизат IV выдерживают в термостате 20 — 30 мин, а затем центрифугируют. Из надосадочной жидкости (лизат V) аналогичным образом при рН 6,8—

7,2 осаждают третий осадок — антигенную фракцию «С» и получают основной, очищенный лизат VI, из которого ультразвуковьп| изоиш|ым фракционированием выделяют при рН 3,5 — 5,5 специфическую антигенную фракцию «Р». П"сле центрифугирования специфическую фракцию «D» с помощью ультразвука растворяют в 20 — 30 мл дистиллированной воды при рН 8,0 — 8,2 и проводят последующую ее очистку.

Иммунохимическая очистка специфической антигенной фракции «D» проводится с помощью антисыворотки на нативный перитонеальный экссудат белых мышей (на балластные вещества). Ее получают путем иммуниза ции кроликов нативным перитонеальным экссудатом здоровых белых мышей. Мышам интраперитонеально вводят по 0,2 мл насыщенного раствора хлористого натрия. Через

30 мин насыщенный раствор вводят повторно в дозе 0,4 — 0,5 мл. По истечении одного часа от момента первого введения насыщенного раствора мышей наркотизируют, вскрывают и затем из брюшной полости извлекают шприцем экссудат. Собранный материал центрифугируют при 3 тыс. об,Ъ|ин в течение 30 мин.

Полученный материал вводят 4 раза кроликам в возрастающих дозах с интервалом в

2 — 3 недели между первой и второй инъекциями и в одну неделю между последующими (1 цикл иммунизации). При первой инъекции материал вводят в смеси с дополнителем

Фрейнда под кожу боковой поверхности туловища кролика. Остальные 2 — 3 инъекции материала производят внутримышечно без дополннтеля Фрейнда. Реиммунизацию (II цикл иммунизации) проводят через 30 — 40 дней с момента последнего введения материала. Она состоит из одной или двух инъекций материала без дополнителя в мышцу бедра с интервалом 4 — 5 дней между введениями. На 7, 14 и 21 дни после последнего введения материала у животных берут кровь и проверяют титр сыворотки в РСК или РП в агаровом геле.

Полный цикл иммунизации 4 — 5 месяцев, после чего антисыворотка готова для очистки специфической фракции «Р», Специфическую антигенную фракцию «D» проверяют на чистоту преципитацией с антисывороткой на нативный перитонеальный экссудат белых мышей (на балластные вещества). К пробиркам с прогрессивно уменьшающимся количеством антигенной фракции (0,05, 0,1, 0,2, 0,4, 0,6, 0,8 и 1,0 мл) добавляют по

0,5 мл цельной или разведенной (в зависимости от титра) антисыворотки на балластные вещества. Смесь в пробирках тщательно перемешивают и инкубируют при 37 С в течение

1,5 — 2 час, а затем помещают на 18 — 24 час в холодильник при 4 С. Контролями служат

»0

Зо

G0

6 антисыворотка и антигенная фракция с физиологическим раствором. Реакция на балласт считается положительной, если в одной или нескольких пробирках отмечается преципитат (осадок) . Если преципитат отсутствует во всех пробирках (отрицательная реакция), то антигенную фракцию сразу же используют в качестве специфического токсоплазменного антигена. В случае положительной реакции (наличия преципитата) по пробирке с максима чьным количеством преципитата высчитывают необходимое количество антисыворотки для осаждения балласта и добавляют ее ко всему объему антигенной фракции. Смесь также инкубируют 1,5 — 2 час в термостате и выдерживают 18 — 24 час в холодильнике. Образовавшийся преципитат отделяют центрифугпрованием в течение 20 — 30 мин при 8—

10 тыс. об/мин, Из надосадочной жидкости ультразвуковым изоионным фокусированием при рН 3,5 — 5,5 выделяют очищенную специфическую антпгеш|ую фракцшо.

Приготовление и стандартизация токсоплазменного антигена.

Осадок очищенной от балласта антигенной фракции «D» промывают в дистиллированной воде 2 — 3-х кратным ультразвуковым растворением при рН 0,8 — 8Я и переосаждением при рН 3,5 — 5,5. Отмытый осадок растворяют в

20 — 30 .,:л дистиллированной воды при рН

8,0 — 8,2. Этот раствор антигенной фракции является специфическим токсоплазменным антигеном.

Стандартизацшо антигена проводят по серологической активности титрацией с гиперимунными токсоплазменнымп сыворотками, Оптимальный рабочий титр антигена в РСК и РНГА 1: 20 — 1:160, а для РП в агаровом геле — исходное разведение. Чувствительность токсоплазменного анп|гена по обнаружению специфических токсоплазменных антител в сыворотке крови гипериммунных, экспериментально зараженных и спонтанно больных животных характеризуется в РСК в разведении сыворотки 1:5 1:640 и в РНГА — 1:40—

1: 2560, а в РП в агаровом геле — одной линией преципитации.

Для стабилизации антиген лиофилизируют в рабочем титре с защитной средой. В высушенном виде, в ампулах, он представляет собой мелкопористую таблетку белого цвета, легко растворяющуюся в дистиллированной воде и физиологическом растворе. Срок годности лиофилизированного антигена 2 — 3 года.

Приготовлеш ый по описанному способу токсоплаз icHYûé антиген и"пытан комиссионУо, апрсбпрован и ВГНКИ и в широком производствен|ом опыте и показа7 высокую специфичнссть прп серологической диагностике токсоплазмоза.

Формула изобретения

Способ получения токсоплазменного антигена для серологической диагностики, вклю533376

Составитель А. Алексеенок

Техред В. Рыбакова

Редактор Е. Дайч

Корректор Л. Котова

Заказ 2364/1 Изд. 0е 1735 Тираж 630 Подписное

ЦНИИПИ Государственного комитета Совета Министров СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Ра шская наб., д. 4/5

Типография, пр. Сапунова, 2 чающий извлечение и отмывку токсоплазм от клеточных элементов исходного сырья, дезинтеграцию токсоплазм обработкой ультразвуком и выделение антигенной фракции изоионным фракционированием, отличающийся тем, что, с целью повышения специфической активности антигена, ультразвуковую дезинтеграцию клеток токсоплазм проводят 2 †3кратно с отделением лизата оболочек токсоплазм и выделением из него антигенной фракции изоионным фракционированием при дополнительном воздействии на лизат ультразвуком с последующей очисткой антигенной фракции от неспецифических балластных ве ществ добавлением к ней антисыворотки.