Способ получения раствора нативного гемоглобина

 

ОПИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕНИЯ пц 58 9984

Союз СоеетскИ

4оциалистнческик

Республик

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (61) Дополнительное к авт. свид-ву (22) Заявлено 16.02.76 (21) 2323121/28-13 с присоединением заявки № (23) Приоритет (43) Опубликовано 30.01.78. Бюллетень № 4 (45) Дата опубликования описания 14.02.78 (51) М. Кл.з А 61К 35/18

Госудйрственный комитет

Совета Министров СССР по делам изобретений и открытий (53) УДК 615.45:612.11. .11 (088,8) (72) Авторы изобретения

Г. Я. Розенберг, А. А. Хачатурьян, Е. П. Вязова, Н. А. Рогачева, Ю. Г. Иванов, Г. М. Морозова, В. М. Шлимак, Р. С. Сергеева, А. М. Зейналов, М. А. Ажигирова, Н. Н. Мельниковская, E. С. Бойко, H. А. Федоров, В. Б. Козинер и В. С. Ярочкин

Центральный ордена Ленина научно-исследовательский институт гематологии и переливания крови (71) Заявитель (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ РАСТВОРА НАТИВНОГО

ГЕМОГЛОБИНА

Изобретение относится к области выделения белков из объектов биологического происхождения и может быть использовано для получения гемоглобина, не содержащего прокоагулянтов.

Известен способ получения раствора нативного гемоглобина, заключающийся в том, что к эритроцитарной массе при 10 — 12 С добавляют от 4 до 12 г Р-пропиолактона 1 л осадка эритроцитов, смесь выдерживают 25 мин, затем ценгрифугируют и раствор очищают.

Выход целевого продукта составляет 6 — 7%.

Однако известный способ не обеспечивает высокой концентрации и чистоты целевого продукта.

Целью изобретения является повышение концентрации и чистоты целевого продукта.

Это достигается тем, что обработку проводят тетрахлорэтиленом при нагревании смеси от +4, +6 С до +35, +38 С в течение

10 — 15 мин.

Пример. К эритроцитной массе, отмытой

4 раза 0,9%-ным раствором хлористого натрия, добавляют при температуре +5 С охлажденный до той же температуры тетрахлорэтилен в соотношении 1: 1. Смесь перемешивают при +5 С в течение 10 мин, затем температуру повышают до 37 С и продолжают гемолиз еще 35 мин, Для разделения компонентов смеси (органический растворитель, стромы, раствор гемоглобина) ее центрифугируют 20 мин при 2000 об/мин и +4 Ñ.

По окончании центрифугирования раствор гемоглобина, находящийся в верхней части ценгрифужного стакана, сливают, фильтруют через фильтр «Миллипор» (GS) и диализуют против раствора Кребса.

10 Ниже приводятся характеристики гемоглобина, полученного предлагаемым способом.

При исследовании прокоагулянтной активности гемоглобина с помощью теста потребления протромбина по Квику, разница между

15 контрольной (донорская кровь+физиологический раствор) и опытной (донорская кровь+

+раствор Нв) пробами отсутствует, что свидетельствует о полном удалении стромальных веществ, обладающих тромбопластической

20 активностью.

Исследование кислородно-диссоциационных кривых гемоглобина (при 20 С в 0,1 М фосфатном буфере рН 7,2) дает значения:

1gP-ОΠ— — 0,78 + 0,02 и и = 2,8+- 0,2, соответст25 вующие характеристикам нативного гемоглобина.

Содержание мег-гемоглобина в полученных образцах ниже 5%.

589984

Концентрация гемоглобина у, Осмотнческое давление мм вод. ст.

15

216

448

776

1256

Формула изобретения

Составитель С. Малютина

Техред H. Рыбкина Корректор Т. Добровольская

Редактор Г. Лановая

Заказ 3275/10 Изд. Мз 202 Тираж 693 Подписное

НПО Государственного комитета Совета Министров (ССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, 5К-35, Раугпская наб., д. 4/5

Типография, пр. Сапунова, 2

Молекулярный вес гемоглобина, определенный методом светорассеяния, равен 65000+

+ 4500.

Определение осмотического давления гемоглобина в различных концентрациях на мембранном осмометре при 37 С в физиологическом растворе NaC1 дает следующие значения:

Молекулярный вес, подсчитанный на основании данных по осмотическому давлению в диапазоне концентраций от 0,5% до 1,5 /о, равен 64000 (+ 10%).

Относительная вязкость полученного раствора гемоглобина при его концентрации, равной 10 /о, при 20 С составляет 1,4.

Полученный предлагаемым методом гемоглобин нетоксичен при внутривенном введении мышам в дозе до 9 г/кг веса, переносим крысами при плеторическом переливании в количестве до 4 г/кг веса тела, выведение его с мочой происходит аналогично гемоглобину, очищенному методом центрифугирования.

В опытах на изолированном сердце кролика с перфузией коронарных сосудов гемоглобином получен ответ на основной, принципиальный вопрос: показано, что раствор гемоглобина способен связывать, переносить и отдавать тканям кислород.

Артерио-венозное различие по кислороду составляет в среднем 3,5 об. .

Раствор гемоглобина был испытан на кошках, у которых путем обменных переливаний

4 замещали собственную кровь на раствор гемоглобина. Объем замещения составлял от 2 до 3 по отношению к объему собственной кро5 ви, При этом у животного оставалось собственных эритроцитов от 0,2 до 1 млн., а показатель гематокрита был равен 1 — 5.

Раствор гемоглобина поддерживал жизнь животного от 2 до 6 ч, при этом перенос газов осуществляется в основном за счет рас16 творенного гемоглобина, По показателям артериального и венозного давления минутного объема сердца и периферического сосудистого сопротивления, раствор гемоглобина поддерживает в удовлетворительном состоянии гемодинамику в течение времени наблюдения (2 ч) .

Использование предлагаемого способа получения нативного гемоглобина дает возможность получения высоких концентраций

20 (30 ) гемоглобина, исключить этап центрифугирования при больших ускорениях, что значительно упрощает технологию, сокращает время, затрачиваемое на процедуру очистки и позволяет получать практически неогра25 ниченные количества гемоглобина.

Способ получения раствора нативного гемоглобина, включающий обработку эритроцитов органическим растворителем с последующим отделением органической фазы, о т л и ч а ю35 шийся тем, что, с целью повышения концентрации и чистоты целевого продукта, обработку проводят тетрахлорэтиленом при нагревании смеси от +4, +6 С до +35, +38 С в течение 10 — 15 мин.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

1. Патент Франции М 2202102, кл. А 61К

27/10, 1973.