Способ получения ридулозодифосфаткарбоксилазы-оксигеназы

 

ОПИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИ ЕТЕЛЬСТВУ

Севэ Севетскик

Социалистических

Реавублик оп691461 (51)М. Кл.2

С 07 0 7/02//

A 61 К 37/48 (6!) Дополнительное к ает. сеид-ау (22) Залвлемо 090877 (21) 2528758/23-04 с лрнсоедммеммем заявки Йо

Государственный комитет

СССР но вел ам нзобретеннй н открытий (23) Приормтет .Олублнковамо 15.10.79. бюллетень Ю 38 (53) УДК 5 7 7. 15. 0 7 (088. 8) Дата опубликования описания 15.10.79 (72) Авторы изобретения

Н.Г.Доман, Т.A Ñåèòoâà и Н,Г.Русинова (71) Заявитель

Институт биохимии им. А.Н. Eaxa AH СС (54 ) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ РИБУЛОЗОДИФОСФАТКАРБОКСИЛАЗЫОКСИГЕЧАЗЫ

Изобретение относится к области биохимии и медицины, а именно к способу получения высокоочищенных ферментных препаратов, конкретно к способу очистки рибулозодифосфаткарбоксилазы-оксигеназы, Настоящий способ может быть использован в производстве ферментных препаратов для научных исследований.

Рибулозодифосфаткарбоксилаэа (3-фосфо-D-глицерат-карбокси-лиаза, димеризующая, КФ 4 .1.1. 39) является ключевым ферментом восстановительного пентоэофосфатного цикла и ката- . лизирует в процессе фото- и хемосинтеэа образование 2 молей фосфоглицериновой кислоты иэ 1 моля С0 и 1 моля D-рибулоэо-l,5-дифосфата.

Рибулозодифосфаткарбоксилазаоксигеназа заключена в листьях высших растений в виде растворимого белка, составляющего 30-40% всех других растворимых белков растения, Считалось, что этот фермент обладает лишь функцией карбоксилирования, Однако в 1973 г, была обнаружена вторая его функция — оксигеназная.

Рибулозодифосфатоксигенаэа каталиэирует йеобратимое окисление рибулозодифосфата до 2-фосфогликолевой кислоты и 3-фосфоглицериновой кислоты, Отделение рибулоэодифосфаткарбоксилаэы от рибулоэодифосфатоксигеназы оказалось безуспешным; зто служит доказательством того, что один и тот же фермент катализирует обе реакции (1), В литературе описан ряд способов очистки рибулозодифосфаткарбоксила" зы из автотрофных организмов; растений, водорослей, микроорганизмов (21.

Эти способы предусматривают использование дорогостоящих приборов и реактивов, таких как скоростная центрифуга для зонального градиента сахарозы, установка Ап соп сефароэа, ДЭАЭ-целлюлоза, ДЭАЭ-се адекс и т.д.

Известен также способ очистки рибулозодифосфаткарбоксилазы иэ шпината (3) ° Этот способ включает следующие операции, 1. Гомогениэация сырья в буфере с рН 7 4, 2. Выделение хлоропластов иэ листьев шпината дифференциальным центрифугированием в изотоническом растворе сахарозы, 691461

3. Получение экстракта белка из выделенных хлоропластов после их разрушения.

4, Очистка фермента из экстракта посредством Фракционироваиия сульфатом аммония, диализа и двухкратной хроматографии на сефадексе G †.200. . Недостатком известного способа . является невысокий выход целевого продукта. Процесс выделения рибулозодифосфаткарбоксилазы требует боль.:Шого "количества листовой биомассы, многостадиен, сложен для воспроизведения технологической стадии выделения хлоропластов. В результате

;получают фермент только лишь с карбоксилазной функцией и невысокой удельной активностью, Целью опйсываеМого способа .явля. Ется разработка метода одновременного получения фермента с 2 кагалитическими функциями - рибулозодиФ эсфаткарбоксилазной и рибуяозо.дифосфатоксигеназйой — a одном технологическом процессе с повышеннОй активностью фермента и увеяйченным выходоМ готового продукта из дешевого и доступного сырьяволосйеца ситникового. Указанная ."цель"достигается за счет того, что для"пслучепия целевого йрадукта используют в .качестве сырья волос Йец ситниковый, содержащий рибулозодиФосфаткарббксилазу-оксигенаэу, и предлагаемую, комбинацию стадий Очистки рибулоз одиФосФаткарбоксилазы-оксигенаэы в сочетании со следующими условйями проведениsi стадий очистки.

1.,ГомогениэаЦию сырья проводят в буфере с рН 8-8.,2.

2, Очистка .рибулозодифосфаткар- боКсйлазы»оксигеназы осуществляется йаследовательн@ми стадиями: а) гель-филътрацией экстрюста из листьев через сефадекс 6 -50; б) обработкой экстракта сульфатом стрептомицина; в) фракционированием экстракта сульфатом аммония;

r) обессоливанием на сефадексе

G - -50; д) гель-фильтрацией на сефадексе G-200, Согласно изобретению описывает ся упрощенный процесс получения рибу тозодифосфаткарбоксилазы-оксигеназы (КФ 4.1.1.39) из автотрофных организмов с высоким выходом целевого продукта с двумя каталитическими Функциями из волоснеца (ломксфолосник) ситникового Eevmus (psalm>t os4achss) junceus заключающийся в получении гомогената из сырья В буфере с рН 8,0-8,2 и последующем выделении фермента последовательными стадиями: а) гельфильтрацией экстракта на сефадексе .G " 50; б) обработкой сульфатом стрептомицина; в) фракционированием, 60

Полученную темно-зеленую массу фильтруют через полотно, затем центрнфугируют в течение 40.мин при

23000()- . Для более полного выде- ления растворимых белков осадок два раза промывают исходным буфером.

После первого промывания осадка дополнительно извлекают 5-6 белка, сульфатом аммония; г) обессоливанием на сефадексе G-50; д) гельфильтрацией на сефадексе G -200.

Предпочтительно процесс проводят следующим образом;

Все операции по очистке фермента проводят на холоду, Листья волоснеца ситникового гомогениэируют в буферной смеси следующего состааа: трис-НСЕ 0,05 М, рН 8,0-8,2;

f() Nace .0,2 М; эДтА 0,005 м; Mgces 0,01M; дитиотреитол 0,01 М. Гомогенат подвергают центрифугированию при 23000 . в течение 30-40 мин, Далее с целью освобождения белка от низкомолекулярных прймесей проводят гель-фильтрацию полученного экстракта через колонку с сефадексом 6-50, уравновешенную тем х<е буферОМ, в котоРом проводили гомогениэацию. Да)атее, с целью удаления нуклеиновых кислот, 1 белковую фракциЮ обрабатывают свежеприготовленнь м 10%-нйм раствором сульфата стрептомицина, который добавляют re каплям:до:конечной кон центрации l%.. Осадок ".Удаляют центрифугировайиж и нящосадочную жидкость пащщрг ают фракций онированию сульфатом. аммония:. Фракцию, полученную в предМах 36 -443 насйщения, центрифугируют,, осадок растворяют

В мннкмальноМ..количестве буфера следующего состава: трис-Нсе О, 02 5 м, рН 8,0-8,2; ЯаСВ О,:1 N; ЭДТА 0,005 М; ЩСВS. 0,01 М; дитнотреитол

0,01 M. Раа тзор обесссдщвают на

35 колонке с сефадексОм 6-50, уравновешенной тем же буфе).:ой. Конечную стадию очистки црсцюдят, Посредством хроматографий обессоленной белковой фракции иа сефадексе,. 6-200, урав40 новешенном той же буферной системой, в которой проводят обессалйвание.

Фракции, содержащйе фермент, объединяют. Получают гомогенный препарат фермента, который можно хранить в замороженном или лифилизованном состоянии.

Волоснец ситниковый выращйВают в оранжерее на почве или в водной культуре на смеси Прянишникова, Навеску листьев (120 г) 3-недельных проростков волоснеца ситникового гомогенизируют в кратном объеме трио-НСе -буфера (рН 8,1) низкой ионной силы (0,05 М), содержащего

0,2 M хлористый натрий, 0,005 М

ЭДТА, 0,01 М хлористый магний, 0,01 М .дитиотреитол.

69) 461 после. второго 1-2% белка от исходного.

Над6садочную жидкость (экстракт из листьев), содержащую растворимые белки листа, далее подвергают очистке от нйэкомолекулярных веществ небелковой природы путем фильтрования через колонку (100 х 4,0 см) с сефадексом G- 50, уравновешенную буфером, в котором проводят разрушение листьев. В результате Фильтрации гомогената через сефадекс G-50 выделяют два компонента. Все растворимые белки элюируются в составе первого компонента, Для удаления нуклеиновых кислот к белковой фракции, полученной после фильтрования на сефадексе G-50, постепенно по каплям добавляют

10%-ный (свежеприготовленный) сульфат стрептомицина до конечной концентрации осадителя 1%. Сульфат стрептомицина готовят в буфере, который используют для получения экст- ракта Из листьев волоснеца ситникового. Через 30 мин осадок отделяют центрифугированием в течение 20 мин при 16000 ч.. Осадок отбрасывают, а надосадочную жидкость используют для фракционирования белков сульфатом аммония.

Перекристаллизованный и растертый в порошок сульфат аммония добавляют к белковому раствору до 36% насыщения (количество сульфата аммония рассчитывают по номограмме), З5 выдерживают 60 мин и центрифугируют

20 мин при 16000 . Далее таким же образом получают фракцию белка в пределах 36-44% насыщения и после центрифугирования для . удаления 4() сульфата аммония из ферментного препарата осадок белков растворяют в минимальном объеме (2 мл) 0„025 М трис-НС6 -буфера (рН 8,0), содержащего 0,1 М хлористым натрий, 0,005 М 45

ЭДТА, 0,01 М хлористый магний, 0,01 M дитиотреитол, и фильтруют через колонку (25 х 1,2 см) с сефадексом

G-5О, уравновешенную тем же буфером, со скоростью 0,1 мл/мин. Бел- 5<» ковые Фракции собирают.

Обессоленный на колонке с сефадексом G-50 белковый раствор в количестве 3 мл (200 мг белка) наслаивают на колонкУ (100 х 2,2 см), с сефадексом G-200, уравновешенную тем же буфером, которым проводили обессоливание. Элюирование белков с колонки проводят со скоростью

0,1 мл/мин, Фракции по 2 мл собирают при помощи автоматического коллектора фракций. Фракции 35-44 с ферментативной активностью объединяют. Фермент хранят при ÎоС, или о в замороженном состоянии при -20 С, или высушивают лиофильно, Табл, 1 65 иллюстрирует описанный пример выделения фермента, В табл. 2 дана характеристика ферментных препаратов в процессе хранения.

Свежеполученная рибулозодифосфаткарбоксилаза в 0,025 М трис-.НовЂ

-буФере (pH 8,0), содержащем 0,1 М хлористый натрий, 0,005 М ЭДТА, 0,01 М хлористый магний и 0,01 дитиотреитол была стабильна в тече1 о о ние 3-4 недель при О С и при -20 С в течение 5=6 месяцев. Лиофильно высушенную рибулоэодифосфаткарбоко ксилазу можно хранить при -20 С в течение 6 месяцев, Рибулозодифосфатоксигенаэа в

0,025 М трис-НСС-буфере (рН 8,0), содержащем 0,1 М хлористый натрий, 0,005 И ЭДТА, 0,01 М хлористый магний и 0,01 M дитиотреитол, при хранении в течение полугода при -20 С теряет перВоначальную активность.

Однако нагревание фермента в присутствии 50 мМ хлористого магния и 0,1 И дитиотреитола при 50 С в течение 5 мин восстанавливает исходную активность.

Состав ферментной смеси для определения активности рибулозодифосфаткарбоксилазы (мкмоль/мл): хлористый магний 10,0; дитиотреитол 10,0;

ИаНС " G 50,0 в 0,05 М трис-НСРбуфере (рН 8, 1); рибулозо-1, 5-дифосфат 0,5; рибулозодифосфаткарбоксилаза не более 0,05-0,1 мг белка, Контролем служит также реакционная смесь, но без рибулозо-1,5-дифос фата.

Состав ферментной смЕСи для определения активности рибулоэодифосфатоксигеназы на полярографе ЛП-7 (мкмоль/мл): хлористый магний 10,0; дитиотреитолi 0,4; рибулоэо-1,5-дифосфат 1,2; рибулозодйфосфатоксигенаэа 0,71 мгу трис-HCI? -áóôåð (рН

9,3-200,0) °

Одна единица рибулозодифосфаткарбоксилаэы карбоксилирует 1 мкмоль рибулоэодифосфата до 2 мкмоль фосфоглицериновой кислоты при 30 С в

1 мин, Одна единица рибулоэодифосфатоксигенаэы оксигенирует 1 мкмоль рибулозодифосфата до 1 мкмоль фосфогликол ят а H 1 мкмол ь фосфоглицер ат а при

30 С в 1 мин °

Гомогенность выделенной рибулозодифосфаткарбоксилазы-оксигенаэы доказана следующими методами: l) седиментационного равновесия на аналитической ультрацентрифуге sр псо модель Е; в малом слое с применением теневой оптики; ?) при электрофореэе в 7,5%-ном полиакриламидном геле; 3) с помощью электронной микроскопии негативно окрашенного препарата.

691461

Таблица 1

0,160

Сефадекс G-50

1164,8 96,21.

Сульфат стрептомицина

1005,2 83,09

Насыщение (МН4) 50

0,35

398,4 32,95

216,0 17,79

Насыщение (ЙН4 )2 SO4

0,36-0,44

Сефадекс 8-50

200,0

168,2

16,59

13,89 15

0,50

2,45

Сефадекс 8-200

Таблица 2

Количество единиц фермента

Рибулозодифосфат карбоксилаэа .Рибулозодифосфат.оксигенаэа

409 0

2, 45-2,55

Свежеполученный

Размороженный после хранения при

-20 С

Свежеполученный

390,0

80,0

2,20-2 р 30

0,50

Размороженный после хранения при -20 С 0,50

80,0

60.ЦИНИПИ Заказ 6144/19 Тираж 513 Подписное

Филиал ППП Патент, г. Ужгород, ул. Проектная,4, Гомогенат из листьев 1210,3 100,0.Формула изобретения

Способ получения рибулоэодифосфаткарбоксилазы-оксигенаэы (КФ 4. 1. .l.39} иэ автотрофных организмов, 4> включающий гомогенизацию сырья и стадии очистки: фракционирование сульфатом аммония и гель-фильтрацию на сефадексах,.отличающийся тем, что, с целью получения фермента с двумя каталитическими функцияьы, упрощения процесса и увеличения выхода целевого продукта, в качестве автотрофного организма испоЛьзуют листья волоснеца (ломкокодосник) ситникового И виэ(psythsrф т.ась э) ипсецэ, гомогени.эацйю сырья проводят в буфере с рН .8,0-8,2 с последующей очисткой го-. могената путем гель-фильтрации на сефадексе 8-50, обработки сульфатом стрептомицина, фракционирования сульфатом аммония, обессоливания на сефадексе G- 50 и гельфйльтрации на сефадексе 6-аоо.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе . (, Ап&аав T. 7., огппв Х.Н., Totber N.E, RibuCose chpbosp8ate охи епаэе Т.svnthesis of phosptloqLscoKate bv fraction iprotein of 6eaves-.

"3iocbernistrs,"1973,g., й.

2. Anderson L.å. RibuEose-<,5-diphosphate са t)ox (!ase from к ru5rurn, hhetÈods in бп7чгпо(!ops.ч.42. Раппе,iOT5 457-ФВ5, 3. Тпown P,% An irnpr oved method ог iso а1 оп о1 сагЪохМ1этм ды.-"Biocbern str >", 19 68, 4 ¹ S, 9о 8 (прототип) .