-аминофосфонистые кислоты для избирательного ингибирования ферментов и способ их получения

 

<и>717062

ОПИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

4оюз Советсиик

Социалистических

Республик (6! ) Дополнительное к авт. свид-ву (53)М. Кл.2

С 07 F 9/48A 61 К 31/66 (22) Заявлено 180777 (21) 2507581/23-04 с присоединением заявки М (23) Приоритет

Государственный комитет

СССР по делам нзобретеннй. н открытий

Опубликовано 250280. Бюллетень 8= 7 (53) УДК S47. 341.. 07 (088. 8) Дата опубликования описания 2502.80 а -,ддщ „ д,„.

A.È. Бирюков, Т.И. Осипова, P.Ì. Хомутов и Е.Н. Хурс (72) Авторы изобретения

Институт молекулярной биологии AH СССР (7! ) 3aявитель (54) А -АМИНОФОСФОНИСТЫЕ КИСЛОТЫ ДЛЯ ИЗБИРАТЕЛЬНОГО

ИНГИБИРОВАНИЯ ФЕРМЕНТОВ И СПОСОБ ИХ

ПОЛУЧЕНИЯ

Изобретение относится к области химии фосфорорганических соединений с С-P связью, а именно к новым

6. -аминофосфонистым кислотам общей

Формулы я — сн — R

I 5

° мНт О ок где R — метил, изопропил, ф-метилтиозтил или р-карбоксизтил, которые могут быть использованы для избирательного ингибирования ферментов,. и способу их получения, При использовании специфичности синтеза a отношении аминокислотных субстратов ранее были использованы такие производные аминокарбоновых кислот, как эфиры, амиды или гидразиды (1), Было отмечено, что зти производные аминокислоты не участвуют в реакции активации.

Было также обнаружено, что замена в субстратной аминокислоте карбоксильной группы на фосфонильную приводит к уменьшению сродства на 2-3 порядка (2) и такие аминофосфоновые кислоты не активируются синтетазами °

Целью изобретения является расширение ассортимента соединений, ис» пользуемых для избирательного ингибирования ферментов, а также разра,ботка способа их получения.

Поставленная цель достигается описываемыми 4 -аминофосфонистыми кислотами приведенной общей формулу, 10 которые представляют собой новый класс аналогов аминокислот. и могут быть исйользованы для избирательного ингибировайия ферментов. Обнаружено, что д, -аминофосфонистые кислоты

15 обладают Высоким сродством к амино» ацил-ТРНК-синтетазам и являются субстратами ATP-РР обмена.

В настоящее время известнй только немногочисленныей, -алкил-илий (2О -арил- А -аминофосфонистые кислоты, которые получают взаимодействием альдегидов или кетонов с фосфорноватистой кислотой и соответствующими аминами (3) .

25 d -Аминофосфонистые кислоты с незамещенной аминогруппой, их свойства и способ получения в литературе не описаны.

L -Аминофосфонистые кислоты приЗО веденной формулы получают новой

717062 (24% j 4 -аминоиэобутилфосфонистой кислоты, т. пл. 205-210. С (изопропанол-вода) .

Найдено,Ж С 35,50 H 8,98, Р 22,13; . N 9,82

C@H O NP

ВычисЛено,Фз С 35,0)Н 8,76, .

P 22,60) N 10,20

И - 0,49, (восходящая хроматография на пластинах Силуфол УФ, система изопропанол: конц. аммиак: вода (7:1:2), проявление нингидрином, молибдатом аммония);О р - -0,92 (электрофореэ на бумаге ФН-18, буфер 0,05 М ацетат натрия, рН 4,1, 1 напряжение 4000 вольт, проявление нингидрином, молибдатом аммония).

При"окислении бромоМ в солянокислом растворе единственным продуктом является р -аминоизобутилфосфоновая

,кислота.

20.

Аналогичным образом получают другие А -аминофосфонистые кислоты, данные элементного анализа и физикохимические характеристики которых

25 представлены в табл. 1.

Т а бл и ц а 1

Элементный анализ

СН> U =-0,90 Йайденоф С 22;23 Н 7, 43 P 28;27 12,.56

20 208- 0 35

213

С НвО,РИ

Вычислено,Ъ С 22,00;Н 7,35;Р 28,41, 12,81

СН ЯСЙ СНИЦ„ - НайденоВ: С 28,67;Н 7,35",Р.18,10;8,12

=т- О, 91 С HuOaPN8

Вычисленсй С 28,40; Н 7,10; Р 18,35; 8,29

40 201- О, 52

204

СйоНСЙ

U„=+0,95 Найдено, %: С 29, 10; Н 6, 15, P 18, 70, 8, 63

С Н(рО PN

30 165- 0,19

168 Вычислейо,В C 28,75> Н 5,99;Р 18,52 3,40

6 -Аминофосфонистые кислоты рас— сматриваются как новый класс анало- гов аминокарбоновых кислот. Замена карбоксильной группы аминокислоты на "фосфоййльйуй"1 руййу nnpИ""сох ЙНЪ"нии остальных элементов структуры мало сказывается на сродство даже к .таким высокоспецифичнйм ферментам, какими являются ам ноацил-тРНК-синте- бО тазы, ключевые ферменты биосйнтеза белка в клетке. Благодаря этому А амийофосфонистые кислоты, аналоги реакцией - взаимодействйем оксима альдегида с безводной Фосфорноватистой кислотой при температуре 25-35 С в атмосфере инертного газа.

Пример 1. р -АминоизобутилФосфонистая кислота.

К 2,64 r (0,04 моль) безводной

Фосфорйоватистой кислоты при хоро- шем перемешивании прибавляют в атмосфере аргона в течение 20 мин

1,74 г (0,02 моль) оксима изомасляно

i"î альдегйда, поддерживая температуру реакционной смеси при 25-35 С.

Перемешйвают 1 ч .(до прекращения са-мораэогревания реакционной смеси) и оставляют на 24 ч при 20 С. Затем разбавляют равным объемом воды и наносят на колонку (15,2 2,9 см) с сульфосмолой Дауэкс 50 8, (100200 меш. Н+- форма). Колойку проьжвают сначала водой до бтсутствия в элюатах поглощения при 207 нм и нейтральной реакции, а затем 1 н. водным раствором аммиака. Фракции, даюйие йоложительную реакцию с нийгидрином, объединяют, упаривают досу ха в вакууме и получают 0,65 г субстратных аминокислот, являются избирательными и эффективными ингибиторами этих ферментов.как показали йспытани я, проводившиеся на очищенных

Препаратах валил- и метионил-тРНКсинтетаз из Е. соЬ, При этом 0;

-аминоиэобутилфосфонистая кислота рассматривается как аналог валина, ad. -амино- -метилтнопропилфосфонистая кислота" --" как аналог метионина. данные по испытанию представлены в табл 2.

717062

Таблица2

Ингибирование аминоацил-тРНК-синтетаз

А -аминофосфонистымн кислотами

2 10 4 (3 10-) R= (сн) сн2 10

6 10-4. (3,4 10 ) R = СН,ЯСН,СН

Формула изобретения

Как видно из табл. 2 аналоги ва лина и метионина действительно специфически влияют на синтетаэную реакцию, обладая в то же время высоким сродством к соответствующим ферментам.

Ферменты, кофактором которых " служит пиридоксалъ-5-фосфат, в особенности трансаминазы, играют важную роль в превращениях аминокислот. При этом субстратом многих трансаминаз является глутаминовая ЗО кислота. Аналог последней, Ы,-амино-1 -карбоксипропилфосфонистая кислота, оказалась конкурентным по отношению к глутаминовой кислоте ингибитором реакции; каталиэируемой аспар- 3Я тат-глутамат-трансаминаэой из сердца свиньи.

Пример 2. Ингибирование валил-тРНК-синтетазы А -аминоизобутилфосфонистой кислотой. 40

Валил-тРНК-синтетазу получают из

E. соИ . Валиновую тРНК оч1пцают иэ суммарной тРНК К. соЬ В. Для опре-. деления активности фермента используют лТФ-На соль д -валин (125 кюримоль); P — пирофосфат натрия

Ы.

16 кюри-моль) и †.меркаптоэтанол.

Ингибирование реакции аминоацилирования проводят при 37 С в течео ние 15 мин. 50 мкл (5 10 М) раствора -аминоизобутилфосфонистой кис- 5О лоты вносят в инкубационную пробу непосредственно перед добавлением фермента. В инкубационной гробе содержалось в пересчете на 1 мл:

40 мкмоль трис-НС1 (pH 7,8), 5 мкмоль 55 ацетата магния, 72 мкмоль хлорис того аммония, 6 мкмоль -меркаптоэтанола,, 2 мкмоль АТФ, 4 нмоль С т4

-l. -валина, 0,3 мг тРНК и 0,005 мг фермента. Определяют скорость аминоацилирования тРНК.

Ингибирование метионил-тРНК-синтетазы проводят аналогично примеру 2.

tl р и м е р 3. Ингибирование аспартат-глутамат-трансаминазы из сердца свиньи * -амино- у -карбоксипропилфосфонистой кислотой. лспартат-глутамат-трансаминазу, (КФ 2,6,1,1), (AT) получают из сердца свиньи,Используют jt-аспарагиновую, :Ь -глутаминовую и б -кетоглутаровую кислоты. Активность AT определяют прямым оптическим методом, регистрируя изменения оптической плотности при 260 нм (поглощение енольной формы щавелевоуксусной кислоты) в ходе ферментативной реакции:

Ch -кетоглутаровай кислота + „;-аспарагиновая кислота лТ 1-глутаминовая кислота + щавелевоуксусная кислота.

Ингибирование проводят в стандартных условиях определения активности, при рН 8,2, 25 С. К 2 мл

0,25 трис-НС1 буфера, содержащим

5 10 " моль щавелевоуксусной кислоты, 5 10 моль Ь -глутаминовой кислоты и 10 моль А -амино-1-карбоксипропилфосфонистой кислоты, добавляют

2 10 " моль фермента. Уменьшение пог- . лощения при 260 нм измеряют s течение одной минуты. лналогичным образом определяют активность лТ"и " при других соотношениях Ь -глутамйновой и < -амино- g -карбоксипропилфосфонистой кислот.

Полученные данные используют для определения конкурентного по отношению к Ь -глутаминовой кислоте ингибирования и для оценки сродства ингибитора к ферменту, которое было всего в 8-10 раз хуже, чем для субстрата, 1 -глутаминовой кислоты.

1. А -лминофосфонистые кислоты общей формулы

Н.

Я-СН вЂ” R

I II

NH O OH где R -метил, иэолропил, -метилтио717062

Составитель Л. Карунина

Редактор С. Лазарева Техред М„Келемеш Корректор М. Демчнк

Заказ 9752/29 Тираж 495 Подписное

ЦНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, $-35, Раушская наб.>, д. 4/5

Филиал ППП Патент, г. Ужгород, ул. Проектная, 4 этил или -карбоксиэтил, для избирательного ингибирования ферментов, 2.Способ получения соединений йо п.l,ç а к л ю ч а ю шийся в том, что оксим альдегида подвергают взаимодействию с безводной фосфорноватИстой кислотой при температуре 2535 C s атмосфере инертного газа.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

f. Ва м Нна 7Ъ.,Chvtchev Й.Ч.,КИот Аоч R М., И1аВЕВВч L.L. УЕЬЬЬЕ МЕМ 19й 22 2Ì-2И.

2, An8e con TW.СИел. Bio6 УлСе ас11оп, 1970 2, 53-55.

3. Патент Chla 9 3506579, кл. 252-107, опублик. 1970,