Способ получения алкалоидов спорыньи

 

Союз Советскик

Социал истическик

Республик (51) М. Кл.з

А 61 К 31/4

Государственный комитет (53) УДК Л67 .044..29 (088.8) h0 делам изооретеннй и открытий

Иностранцы

Ева Боровски, Клаус Браун, Клаус Бройель, Крист

Вернер Граверт, Детлеф Грегер, Лизелотте Хене, Э

Моника Мюллер, Гизела Нордманн, Рудольф и Клаус-Дитер Фольцке (ГДР) Иностранное предприятие

«ФЕБ Арцнаймиттельверк Дрезден» (ГДР) (72) Авторы изобретения ите рге, да Кету:,„, Ку иручКе - -

ВааЛаю д (71) Заявитель (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АЛКАЛОИДОВ СПОРЫНЬИ ин, инира илпеаряют уют кстаккисают це— 9 кстакт ейкстuceps т в ни3

Изобретение относится к химико-фармацевтической промышленности и касается микробиологического получения алкалоидов спорыньи, которые могут быть использованы в медицине, неврологии и гинекологии.

Известен способ получения алкалоидов спорыньи путем выращивания продуцента штамма Claviceps purpurea на питательной среде с последующей экстракцией целевого продукта органическим растворителем 11) .

Однако данный способ обеспечивает недостаточно высокий выход целевого продукта. Выход алкалоидов 2,2 — 3,8 мг л.ср.

Цель изобретения — повышение выхода целевого продукта.

Цель достигается тем, что в качестве продуцента используют штамм У МЕТ PA

130 Claviceps purpurea (Fr) Tul, подвергают т5 экстракции культуральную жидкость или мицелий и фильтрат культуральной жидкости, экстракцию ведут низшим эфиром алкилкарбоновой кислоты при рН 8 — 9, экстракт концентрируют, осаждают из него хлороформом кристаллический аддукт эргометрин-хло- о роформ и переводят его в соль, а алкалоидный фильтрат после выделения эргометрина подвергают хроматографической очистке, 2 элюируют, выделяют из элюата эргото далее переводят его в а.гдукт эрготок ароматический углеводород и гидрирую

Кроме того, в качестве низшего э алкилкарбоновой кислоты используют э а цетат.

При этом к культуральной жидкости ред экстракцией низшим эфиром алкил боновой кислоты предварительно добав

10 вес.о о сульфата аммония, экстраги этилацетатом при рН 8 — 9 и отделяют ракт.

Культуральную жидкость перед экс цией низшим эфиром алкилкарбоновой лоты разбавляют водой, отфильтровы мицелий, фильтрат экстрагируют эти татом или хлористым метиленом при рН и, отдел я ют экстр а кт.

Кроме того, мицелий предварительно э рагируют ацетоном, полученный экст подкисляют до рН 2 — 3, очищают петр ным эфиром и отделяют водную фазу ракта.

Для получения алкилоидов спорынь пользуют штамм У МЕТ РА 130 С1ач q

purpurea (Fr) Tul, который выращива питательной среде, содержащей неор а

845827

55 ческие соединения азота, сахар, органические кислоты, неорганические соли в погруженном виде, образуя при этом алкалоиды группы эрготоксина, а также эргометрин.

Далее с помощью твердых или жидких сред можно достигнуть большее число спор. Образовавшийся эрготоксин и эргометрин содержится в окружающей мицелий ферментационной среде. Полученный фильтрат культуральной жидкости экстрагируют назшим эфиром алкилкарбоновых кислот предпочтительно этилацетатом при рН 8 — 9. Выделяющуюся после фильтрации биомассу в зависимости от остаточного содержания алкалоидов экстрагируют ацетоном. Полученный путем фильтрации прозрачный экстракт после установления рН 2 — 3 помощью водных кислот, предпочтительно фосфорной кислоты, очищают петролейным эфиром или петролейным эфир-ксилолом, отделяют водную фазу с помощью водного раствора аммиака, устанавливают рН 8 — 9, экстрагируют низшими алкиловыми эфирами карбоновых кислот, предпочтительно этилацетатом, и полученные экстракты промывают водой.

Алкалоиды спорыньи экстрагируют из подщелоченной аммиаком культуральной жидкости без предварительного отделения биомассы при добавлении сульфата аммония с помощью низших алкиловых эфиров карбоновых кислот, предпочтительно этилацетата, и путем экстракции с помощью разбавленных водных кислот, предпочтительно фосфорной кислоты, а также проводят экстракцию при рН 8 — 9 этилацетатом, освобождая от примесей. Очищенные экстракты алкалоидов выпаривают при температуре не менее 30 С и полученные концентраты после конечной очистки переводят в алкалоиды.

Для получения чистых алкалоидов концентраты неочищенных алкалоидов растворяют в 1 — 3 об.ч. хлороформа, хранят растворы при 10 С, отделяют выкристаллизовывающийся, обедненный пигментом аддукт эргометрин-хлороформ и переводят в соли, предпочтительно в гидромалоинат. Полученный госле отделения эргометрина фильтрат при

30 С концентрируют путем адсорбции и последующей десорбции по Batch-способу или по способу колоночной хроматографии при использовании окиси алюминия в предпочтительном соотношении 1:20 или в соотношении 1:5, в расчете на общее количество алкалоида в концентрате алкалоидов при добавке активированного угля (соотношение адсорбирующих средств окись алюминия: активированный уголь 5:1) и низших алкиловых эфиров карбоновых кислот, предпочтительно этилацетата или хлорированных углеводородов, предпочтительно хлороформа или двухкомпонентных смесей растворителей друг с другом или с ароматическими углеводородами, предпочтительно бензолом, после выпаривания экстрактов или элюатов при t(30 С переводят в эрготоксин—

Б

1О

iS

25 зо

4О

45 эрготоксининовые смеси, последние путем кристаллизации из ароматических углеводородов, как бензол, толуол или ксилол, переводят в несодержащие эпимеров высокой чистоты кристаллические аддукты эрготоксин — ароматические углеводороды и последние при известных условиях превращают в соли присоединения кислот эрготоксина, предпочтительно этансульфонат.

Полученный эрготоксин гидрируют в присутствии менее активного никеля Ренея при

20 — 70 С, предпочтительно 60 С и давлении водорода 30 — 70 атм, предпочтительно

50 атм, в диоксане или при нормальном давлении и при 20 — 30 С, предпочтительно 25 С, в присутствии 5 — 10 /о-ного катализатора палладий на угле в водном диоксане по способу рециркуляции с образованием не содержащего пигменты 9,10-дигидроэрготоксина. Гидрированные основания переводят в терапевтически приемлемые соли присоединения кислот, предпочтительно гидромалеинат и этансульфонат.

Пример 1. Для культивирования спор каждый из консервантов, которые в обезжиренном молоке содержат лиофильно высушенные споры, приготовляют суспензию, которую переносят на 3 /p-ную агаровую среду (рН 6,0) с 15 /p пивного сусла, 0,5 /p дрожжевого экстракта, 0,5 /p (NH4) гРО, и 0,1 /p цитрата аммония, и в виде культуры косого агара выдерживают 14 дней при 19 С. В качестве затравочного материала для погруженных культур по этому способу получают в широкогорлых колбах (склянках) емкостью 1000 мл I ° 10 о спор/сосуд для культивирования, с помощью которых можно инфицировать гри надобности до 120.л питательного раствора.

Пример 2. Получение инокулята осуществляют с помощью суспензии спор, полученной аналогично примеру 1, которую в концентрации !.10 спор/мл переносят в жидкую среду, содержащую 151o пивного сусла и 2 /о дрожжевого экстракта. Культивирование проводят при 22 С в круглодонной колбе емкостью 500 мл с 120 мл жидкой среды на качающейся машине для встряхивания. Культура спустя 14 дней содержит

6 10 спор/колбу, которые применяются в качестве затравочного материала для ферментации алкалоидов.

Пример 3. Получение инокулята для культивирования спор осуществляют согласно примеру 1. В качестве питательной среды применяют 3 /p-ную агаровую среду (рН 6,8—

6,9), которая содержит 3 /о сахарозы, 0,3 /p

NaNO>, 0,1 /p, К РО„, 0,005 /о MgSO . HiO;

0,05 /о КС1, 0 001о/о Ге$0 7НгО и 1о/о воды набухания кукурузы. В стеклянных узкогорлых емкостях объемом 500 мл в культуре косого агара после культивирования в течение 14 дней при 24 С получают 3 10 спор/сосуд для культивирования, которые могут при845827 меняться для погруженных культур при синтезе алкалоидов.

Пример 4. Споры культуры затравочного материала, полученные согласно примеру 1, суспензируют и часть их в качестве инокулята распределяют в одинаковых количествах в вертикально стоящие круглодонные колбы (емкостью 500 мл), каждая из которых содержит по 120 мл среды предварительной культуры (10% сахарозы, 1,5% цитрата аммония, 0,1% C3(NO;), 0,025%

КНгРО, 0,01% КСl, 0,03% MgS01, 0,001%

FeSO4, 0,0004% ZnSO<, дистиллированная вода, рН 5,5, .стерилизация 30 мин

FeSO„0,0004%, 0,0004% ZnSO,, дистиллированная вода, рН 5,5, стерилизация 30 мин при 0,5 атм). Колбы встряхивают при 24 С на (круглой) качающейся машине для встряхивания (175 об/мин). Спустя 7 дней содержимое колбы в соотношении 1:10 пересевают в колбы Эрленмейера (емкостью 500 мл), из которых каждая содержит по 120 мл основной культуральной среды (20% сахарозы, 1% цитрата аммония, 0,1% Ca(NOg) p, 0,025% КН РО,, 0,01% KCl, 0,03% MgSO,, 0,001% FeS04, 0,0004% ZnSO,, дистиллированная вода, рН 5,5,стерилизация 30 мин при 0,5 атм). Эти колбы встряхивают, как указано ранее, при одинаковых условиях.

Спустя 14 дней с помощью реакции Урка определяют 2470 м г алкал оидов/л кул ьтуральной жидкости, в расчете на бималеинат эрготоксина. Аналоиды экстрагируют хлористым метиленом, разделяют с помощью тонкослойной хроматографии на пропитанном формамидином кизельгура и определяют УФспектрофотометрически. Находят 1280 мг эрготоксина и 340 мг эргометрина/л, из остатка выделяют два неизвестных нативных нептидных алкалоида и простые производные эрголина, как агроклавин, ханоклавин и т.д.

Проведенное параллельно этому определение выделенного путем вакуумной фильтрации мицелия и фильтрата показывает, что эргометрин полностью и сверх того 90% образовавшегося эрготоксина содержатся в фильтрате.

Пример 5. 10 стеклянных ферментеров (емкостью по 2 л) засевают приготовленный согласно примеру 2 культурой погруженных спор. Ферментеры содержат по 1,3 л питательного раствора А с 10% сахарозы, 1,5% цитрата аммония, 0,05% КНяРО, 0,03% MgSO „0,001% АБО, и 0,0004%

ZnSO, в водопроводной воде (рН 5,5; стерилизация 30 мин при 0,5 атм). Ферментацию осуществляют при 24 С и при перемешивании со скоростью 400 об/мин, соответственно при аэрации 0,3 л воздуха/мин. Спустя 7 дней содержимое ферментора переносят в ферментор из высококачественной стали емкостью

18 л с 10 л питательного раствора В, содержащего 10% сахарозы, 1,4% лимонной кис-, лоты, 1,0% гидроокиси аммония (25%-ной), 0,05% C3(N04) х 0,025%, КН Р04, 0 01%

% ле ну а"/с о/о о/о де ,3, ру

Я» ьнт, н з

5.

7 ур ю

/о

КС1 0 03% MgS04 0 001% FeS04 и 0,000

ZnSO4 в водопроводной воде, рН 5,5. По культивирования при 24 С, 360 o6/ìи

2,5 л воздуха/мин на пятый день полов содержимого ферментора применяют в

s честве инокулята для ферментора из вы о кокачественной стали емкостью 63 л с 4 питательного раствора С, содержащего 2 сахарозы 1,75% лимонной кислоты, 0,07

КНаРО4,0 02% КС1, 0,03% MgS04, 0,00

FeSO4, 0,0012 ZnS04 в водопроводной в добавляют гидроокись аммония до рН стерилизуют 60 мин при 110 С. Культ перемешивают в течение 7 дней при 2 со скоростью 300 об/мин и аэрируют 2 воздуха/мин, при необходимости осущест (5 ют добавку антивспенивателя. Культура ная жидкость содержит при культивиро а нии 2640 мг всех алкалоидов/л. Провед ный согласно примеру 4 анализ показыва что в ней содержатся 1300 мг эрготокси а и 550 мг эргометрина.

Пример 6. Количество спор, получ ных согласно примеру 3, культуры затрав ч ного материала в качестве инокулята р в номерно распределяют в два ферментора высококачественной стали (емкостью 18 . каждый из которых содержит по 10 л тательного раствора А согласно примеру

Содержимое ферменторов перемешивают дней при 24 С со скоростью 360 об/мин и аэрируют 2,5 л воздуха/мин. Затем сод р жимое двух ферменторов переносят в ф рЗО ментор из высококачественной стали емк стью 250 л, который содержит 180 л питате. ьного раствора В согласно примеру 5, и ку. ьтивируют при 24 С, 160 об/мин и 0,5 воз

xa/л питательного раствора в минуту. Спустя 5 дней культуру переносят в фермент из высококачественной стали емкост

2000 л с 1400 л питательного раствора согласно примеру 5, однако питательн и раствор содержит дополнительно 0,0005

NlS0, Культивирование осуществляют п и

40 24 С, 160 об/мин и 0,6 л воздуха/л питателного раствора в минуту. При необходимоти во все ферменторы добавляют антивспниватель. На седьмой день культура содежит 2430 мг всех алкалоидов/л культурал45 ной жидкости. При аналитическом опредлении согласно примеру 4 найдено 1150, г эрготоксина и 490 мг эргометрина/л культральной жидкости.

Пример 7. 200 л культурально о фильтрата из соответствующего количест а о культуральной жидкости (по примеру 6, которую перед отделением мицелия разбаляют при перемешивании путем добавки вды в объемном соотношении 1:1, подщел чивают с помощью 25%-ного водного расвора аммиака до рН 8,5 и аналоиды эрг 5 токсина и эргометрина экстрагируют 50 о этилацетата при использовании двухстпенчатого устройства для экстракции, рботающего противотоком. Этилацетатнь й

84 5)8 )7 экстракт Kollti«HTpHpy!OT в вакууме при t(+30 С )о !!20 исходного объема, смешиВ Я 10 т 0 с T 3 To K и 0 сЛ с В ьй 3 P H B 11 I I H 51 с IB V м 51 обьсмныMH частями хлороформ!I, оставляют н3 1, ) ч llpH 4 С. дл5! ВыкристаллизовываНИ 11ДДХ КТ11 ЭРГОМСТP H 113 С Х IOPO())OP I!0 VI, отсасывают и получя!От 35,4 г желтоватого

3, t5IóKò3 эргометрина с хлороформом с 75О/оным выходом. 35,4 г аддукта эргометрина с хлороформом в присутствии активного угля нри нагревании растворяют в 3,1 л ацетона, добавляют K фильтряту рассчитанное количество раствора малсиновой кислоты в 3 tcтоне, полученный кристаллический оималеинат эргометрина отсасывают и вещество высушивают при 70 C. (1о !учают соль алкалоида в виде d -чистого. окрашенного от белого до желтоватого, KpHOT3ллич«ского порошка с 90 /(-ным выходом со стспсньк) чистоты с

98 — 100%. Удельное вращение (с1.) =- 50

Х) (С==1 в водс). После,1альнейшего концентрирования полмченногÎ содержа!цего эрготоксин фильтрата до 0,297 л хроматографирук)т при применении, в расчете на обшсс

КО !и !«ство 3.!кя IQHJIÎB В алка Iоидном Koll цснтрате, двадцатикратного количества окиси алюминия нейтральной стадии активности через колонну с помощью .этилацетата и эл!Оируки 3,8 л такого же растворителя.

Полу:енный после выпаривания досуха эл!аата В ьякууме при 1: 30 С остаток после выпаривания (74,2) путем растворения в

0,212 л бензола и стояния раствора в течение !5 I при 4 С преврашяют в адду)(т эрготоксина с бснзолом, выкристаллизовавшийся продукт отсасывают, промывают бснЗОЛОМ И ВЫСАДИ ИВЯ К)Т В B3 KVVVI IIÎVI ЭКСИ Кяторе. (1олучают 55,2 г d(,-чистого, белого

KPH0T3JI 1H I«oI(0I 0 ЯД .1, KT3 BP OToK« 1113 с 0011 эолом со степенью чистоты 95"/t!. Удельное вращение (4) == — -183 (с =-- 1.8 В СНС1 ), Э или перемен!Ива!От с двадцатикратным количеством окиси али)минин нейтра IBIIOH стадии активности, в расчете ня обшес количсстВО алка;10идОВ В алкялои;1нох1 концентрате, до тех пор, пока смесь нс становится

;,I0! eIIII0I0 цвета. После стояния в течение

15 мин экстрягируют трн раза по 3.82 3 этилацетатя, сгvlllclK)T oб ьединснпый экстракт при 30 С досуха, подвергают дальнейшей обработкс аналогH ÷!H Dl образом и получают 52,5 г d< чисгого белого кристаллического аддуктя эрготоксина с бензолом со степенью чистоты 95"/!). Удельное вращение (с(.) = — !83 !0==-1,8 в СНС13).

Хромятографиру!От при примснеl! HH, ь расчетс на общее кол!!честно алкалоидов в алкалоидном концеитрате, пятикратног0 K()личества окиси алюминия, Hoé!.p3;IüíoH cTcl

Ди и 3 KTH BHocTH II PH . 100 с! Г) ке Я ктн BH PÎB311110ro угля (адсорбционное соотношение окись алюминия: активированный угол 5:1) через колонну с помощью этилацетата и э)ноируют 4 л того же растворителя, при дальнейн!сй обработке поступают аналогичным об5

15 о

30 з

55 разом и получают 55 г d -чистого, белого кристалли !еского яддукта, эрготоксина с бензолом со степенью чистоты 96%. Удельнос вращение (с!) а = — -183 (с = 1,8 в СНС!з ), D

Перемешивают при использовании, в расчете на общее количество алкалоидов в алкалоидном концентрате, пятикратного количества окиси алюминия, нейтральной стадии активности llpH добавке активированного угля (адсорбционное соотношение окись алюминия: активированный уголь 5:1) в фильтрационном устройстве с перемешиванием с помощью 3 л этилацетата, экстрагируют еше два раза»о 2,5 л этилацетата, концентрируют объединенный экстракт при 30 С досуха, при дальнейшей обработке поступают аналогичным ооразом и получают 55 г dz-чистого, белого, кристаллического аддакта эрготоксина с бензолом со степенью чистоты

96%. Удельное вращение (с ) 2" = — 183 (с =

=1,8 СНС!з).

55,2 г аддукта эрготоксина с бензолом при легком нагревании растворяют в 830 мл аосолютного этанола, добавляют рассчитанное количество 0,5 молярного этанольного раствора (абсолютный этанол) этанолсульфокислоты и затем 4,2 л абсолютного эфира, полученный кристаллизат отсасывают, вец1ес!ВО высушивают при 70 С и получают с

95%-ным выходом с((,-чистый, белый, кристаллический эрготоксинэтансульфонат со степенью чистоты 98 †10

П р и v е р 8. 12 кг полученного путем фильтрации соответствующего количества культуральной жидкости мицелия в течение

3 ч при 20 С экстрагируют 18 л ацетона, отдел«нный путем фильтрации водноацетоповый экстракт доводят до рН 2 — -3 с помощью фосфорной кислоты и обезжиривают и очищают двукратный экстракцией 17 л ш..Tðîëåéíîго эфира и 11 л петролейный эфир/ксилол (объемное соотношение 1:1) .

Полученную алкалоидсодержашую тяжелую фазу экстрагируют при рН=8 — 9 (аммиачная Вода) до истошения в целом 7 л этилацетата, промывают водой в объемном соотношении 1:1 верхнюю фазу выпаривают нри >0 Ñ до 0,7 л, смешивают с 1,40 л хлороформа и после стояния в течение ночи при 4"C отделяют от выпавшего грязеподобного осадка. Фильтрат концентрируют при указа1шых условиях до объема 0,180 л, хроматографируют на 1,100 кг окиси алюминия (активная стадия 1) с помощью 2 л этилацетата, полученные элюаты выпаривают в вакууме досуха и остатки после высушивания растворяют в 1000 мл толуола (бензола или ксилола). После стояния в течение ночи при

4 С отделяют выделившееся вещество, высушивя!от в вакуумном эксикаторе и получают 14,0 r белого, кристаллического аддукта эрготоксина с толуолом со степенью чистоты 98 — 100 /о.

Пример 9. 10,0 л полученной согласно примеру 5 культуральной жидкости при пе845827

10 ремешивании и добавке 10 вес.о/о сульфата аммония при рН 9 и 20 С экстрагируют 25,0 л этилацетата, отбрасывают тяжелую биофазу, органическую фазу экстрагируют дважды по 5,0 л 2О/р-ной фосфорной кислоты, экстрагируют собранные водные фазы, в которых установлено рН 8 9 с помощью аммиачной воды, дважды по 5,0 л этилацетата, собранные органические фазы выпаривают до объема 200 мл при t(30 С, смешивают с 400 мл хлороформом остаток после выпаривания, отсасывают выкристаллизовавшееся после стояния на холоду при 4 С в течение ночи вещество, высушивают в вакуумном эксикаторе и получают 4,20 г (71,2О/р от теории) аддукта эргометрина с хлороформом со степенью чистоты 90,7 /о. Содержащий эрготоксин фильтрат, сконцентрированный при указанных условиях до 120 мл, хроматографируют на 300 г окиси алюминия) с помощью этилацетата, элюат выпаривают в вакууме досуха, остаток после высушивания растворяют в 30 мл бензола, оставляют на ночь при t(io С, выпавшее вещество отсасывают, высушивают в вакуумном эксикаторе и получают 7,95 г (73,6О/р от теории) белого, кристаллического аддукта эрготоксина с бензолом со степенью чистоты 91,6 /р.

Пример 10. 50 0 г полученного согласно примеру 7 аддукта эрготоксина с бензолом гидрируют в 0,7 л диоксана при 60 С под давлением водорода 50 атм, в обогреваемом вращающемся автоклаве с перемешиванием или при встряхивании, в присутствии никеля Ренея в течение 2 ч для получения 9,10-дигидроэрготоксина, отфильтровывают от катализатора, прозрачный фильтрат выпаривают в вакууме досуха, гидрированное основание оставляют выкристаллизовываться при 4 С в этилацетате, кристаллизат отсасывают и высушивают при 60 С. Получают 47,5 г (90"/ц от теории) d -чистого, кристаллического продукта эрготоксинового основания со степенью чистоты 90О/0. Удельное вращение (g) = — 45,6 (с=2 в пиридине). Полученное кристаллическое дигидроэрготоксиновое основание вносят в 200 мл метанола и рассчитанное количество 1 М метанольного раствора этансульфокислоты при перемешивании, причем спустя непро.должительное время выделяется кристаллическая соль алкалоида. После отсасывания и высушиваняя продукта получают 48,5 г (95 /О от теории) d -чистого, белого, кристаллического дигидроэрготоксин-этансульфоната со степенью чистоты 98 †10.

Пример 11. Гидрируют 7,20 г полученного согласно примеру 9 аддукта эрготоксина с бензолом в 250 мл 90 /ц-ного водного диоксана при 20 — 25 С при отсутствии света на 2,9 г 5О/р-ного палладия на угле в специальной циркуляционной аппаратуре, состоящей из емкости для гидрирования с трубопроводами питания и циркуляции, терморананем лба

4 ч ают выеле ток ватендаого ргоают шином теоого нью тва

130 сле ашО .

Ку5О/о ний (неняя стиска ичняя вый

ng) иткта, рма азчадна асетние ар,О) . с м), дна см. се-ко3,3 рислумеенфы ит. метром, эжектором, резервуаром для нения газа и лабораторного шланговог соса, при числе оборотов 138,5 ч, ни давлении эжектора 120 мм H>SO< ст и с диаметром жиклера 2 мм, в течени в 9,10-дигидроэрготоксин, отфильтровы от катализатора, прозрачный фильтрат паривают досуха на роторном испари под вакуумом при t = 30 С, сухой ост растворяют в 35 мл хлороформа, смеш ют с 35 мл диэтилового эфира и при и

1О сивном перемешивании полностью оса ют с помощью 30 мл насыщенного эфир раствора малеиновой кислоты дигидро токсинбималеинат. Отсасывают, промы

30 мл диэтилового эфира и тотчас выс вают над пятиокисью фосфора в вакуу эксикаторе. Получают 6,55 r (93,5О/р от рии) d -чистого, белого, кристалличес дигидроэрготоксинбималеината со степ чистоты 97,9 /о.

Приведены морфологические сво"

Claviaps purpurea штамм У МЕТ РА на различных агаровых средах 1 — 3 культивирования в течение 14 дней в ках Петри при 24 С.

Среда 1 (3"/о сахарозы, 0,001О/q Fe

zs 7Н20, 0,3 NANO>, 1 /o воды набухания курузы, 0,1 К2НРО4, 3 /p arapa, О, MoS0, 7НгО, рН 6,8 — 6,9). Форма кол выпуклая, компактная, беспорядочная правильная) и сильно складчатая, ни сторона гладкая, не отстает от дна пл зо . ны. Диаметр колонии 1,0 — 1,5 см. Окр колоний: верхняя сторона от светло-ко невого до фиолетового, край белый, ни сторона коричневая, край светло-коричн

Среднее спорообразование (Vers por

35 46,3 10 конидий/колония.

Среда 2 (15"/д пивного сусла, 0,1 /о рата аммония, 0,5О/р дрожжевого экстр

3 /0 агара, 0,5(NH4) 2ÐÎ, рН 6,0). Ф колонии: середина выпуклая с кратерооб ным опусканием, край радиально скла

4о тый, агар пророс, колония отстает от пластины. Диаметр колонии 2 — 3 см. Ок ка колонии: верхняя и нижняя стороны ло-коричневые. Среднее спорообразов

34,1 106 конидий/колония.

4 Среда 3 (2 /о глюкозы, 50 /о водного тофельного экстракта, Зо/р агара, рН

Форма колонии: середина выпукла кратерообразным спуском (опускани агар пророс, колония отстает от пластины. Диаметр колонии 1,5 — 2, so Окраска колонии: верхняя сторона ро-фиолетовая, нижняя сторона сер ричневая.. Среднее спорообразование

10 конидий/колония.

Приведена микроскопическая характ тика конидий и гиф. Конидии во всех чаях имеют эллипсоидную форму с ра рами 6 — 10 ит (большая ось), соответс но 4 — 8 ит (малая ось). Субстратные имеют длину до 200 ит и диаметр 4—

845827

Формула изобретения

Составитель С. Малютина

Редактор Л. Тюрина Техред A. Бойкас Корректор С. Корниенко

Заказ 5421/48 Тираж 687 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж вЂ” 35, Раушская наб., д. 4/5

Филиал ППП «Патент», r. Ужгород, ул. Проектная, 4

В случае пузырчатых вздутий диаметр составляет 8 — 16 ит. Образуются воздушные гифы, их длина выше 200 ит и их диаметр составляет только 2 — 4 ит.

Предлагаемый способ позволяет увеличить выход целевого продукта.

1. Способ получения алкалоидов спорыньи путем выращивания продуцента штамма

Claviceps purpurea на питательной среде с последующей экстракцией целевого продукта органическим растворителем, отличающийся тем, что, с целью повышения выхода целевого продукта, в качестве продуцента используют штамм У МЕТ PA 130 Claviceps

purpurea (Fr) Tul, экстракции подвергают культуральную жидкость или мицелий и фильтрат культуральной жидкости, экстракцию ведут низшим эфиром алкилкарбоновой кислоты при рН 8 — 9, экстракт концентрируют, осаждают из него хлороформом кристаллический аддукт эргометрин-хлороформ и переводят его в соль, а алкалоидный фильтрат после выделения эргометрина подвергают хроматогвафической очистке, элюируют, выделяют из элюата эрготоксин, далее переводят его в аддукт эрготоксин-ароматический углеводород и гидрируют.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что в качестве низшего эфира алкилкарбоновой кислоты используют этилацетат.

3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что к культуральной жидкости перед экстракцией низшим эфиром алкилкарбоновой кислоты предварительно добавляют 10 вес.о/о сульфата аммония, экстрагируют этилацета"О том при рН 8 — 9 и отделяют экстракт.

4. Способ по п. 1, отличающийся тем, что культуральную жидкость перед экстракцией низшим эфиром алкилкарбоновой кислоты разбавляют водой, отфильтровывают мицелий, фильтрат экстрагируют этилацетатом или хлористым метиленом при рН 8 — 9 и отделяют экстракт.

5. Способ по п. 1, отличающийся тем, что мпцелий предварительно экстрагируют ацетоном, полученный экстракт подкисляют

20 до р 1 2 — 3, очищают петролейным эфиром и отделяют водную фазу экстракта.

Источники информации принятые во внимание при экспертизе

1. Патент Вел и кобр ита ни и № 1158380, кл. С 02 С, опублик. 1969.