Способ количественного определенияпировиноградной кислоты

 

О П И С А Н И Е ()853497

ИЗОБРЕТЕН ИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

Союз Советских

Социалистических

Респубпик (6l ) Дополнительное к авт. свил-ву— (22) Заявлено 08. 08. 79 (21) 2807390/23-04 (51) М. КЛ.

Ъ с присоединением заявки Ж

G 01 М 21/78

Государстееииый комитет (23) Приоритет по делам изобретеиий и открытий

Опубликовано 07.08.81, Бктллетень М 29 (53) УДК543,432 (088. 8) Дата опубликования описания 17.08.81 (72) Автор изобретения

Т.А.Телегина

Ордена Ленина институт биохимии имени А .Н.Баха

1 (71) Заявитель (54) СПОСОБ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ

ПИРО ВИНОГРАДНОЙ КИСЛОТЫ

Изобретение относится к аналитической химии, а именно к способам количественного определения пировиноградной кислоты.

Известен способ количественного определения пировиноградной кислоты путем обработки анализируемой пробы трихлоруксусной кислотой и центрифугирования. Полученный супер«татан обрабатывают раствором 2,4-динитрофенилто гидразина в присутствии соляной кислоты и этилацетатом, отделяют этилацетатный слой, обрабатывают гидроокисью натрия и фотометрируют Pl) .

Недостатком способа явгяется «,,из15 кая точность — ошибка определения

2-4Х.

Наиболее близким к предлагаемому способу по технической сущности и достигаемому результату является способ т количественного определения пировиноградной кислоты путем «бработки анализируемой пробы раствором п-диметиламинобензальцегида в этаноле и раствором гидроокиси натрия при нагревании с последующим спектрофотометрировах.ем полученного при этом раствора Г21 °

Недостатком этого способа является невысокая избирательность, поскольку определению мешают сахара, альдегиды, аскорбиновая кислота,кетоны.

Целью изобретения является повышение избирательности определения.

Поставленная цель достигается тем, что к раствору, полученному после обработки анализируемой пробы раствором п-диметиламинобензальдегида в этаноле и раствором гидроокиси натрия при нагревании, добавляют соляную кислоту до рН 5,9-6,0 и пропускают его через колонку с окисью алюминия с последующим элюированием п-диметиламинобензальпировиноградной-кислоты раствором гидроокиси натрия и -спектрофотометрированием элюата.

Отличительными признаками способа являются добавление к полученному ра85349

ВНИИПИ Заказ 5641/18 Тираж 907 Подписное

Филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул,Проектная, 4 створу соляной кислоты до рН 5,9-6,0 и пропускание его через колонку с окисью алюминия, последующее элюирование и-диметиламинобензальпировиноградной кислоты раствором гидроокиси натрия и спектрофотометрирование элюата.

Предлагаемый способ дает возможность строго количественно определять содержание пирувата в биологических объектах за счет использования стадии выделения производного пирувата на колонке с окисью алюминия.

Пример. К исследуемому образцу (l мл бесцветного, безбелкового 15 фильтрата) приливают 0 3%-ный раствор п-диметиламинобензальдегида в эуаноле (2 мл) и 25%-ный водный раствор гидроокиси натрия (1 мл). Смесь выдерживают 75 мин в водяной бане при >0

37 С, охлаждают ледяной водой, сразу же доводят рН до 6 разбавленной со.ляной кислотой и тотчас наносят на колоуку с окисью алюминия (1х3) см (то же для рН 5,9). 25

Колонку промывают этанолом для удаления избытка реактива и производных нейтральных карбонильных соединений (объем этанола составляет 8-10 объемов сорбента). Производное пи- З0 рувата элюируют с колонки 5%-ным водным раствором гидроокиси натрия и сразу же измеряют поглощение щелочного элюата при 410 нм против контроля на реактувы. Контроль, в 35 котором вместо исследуемого образца берут l мл воды, обрабатывают по той же схеме, что и опытный образец. Содержание пировиноградной кислоты рассчитывают по калибровочному графику. 40

Для построения калибровочного графика 1 мл аликвоты водных растворов пировиноградной кислоты, приготовленных в концентрациях 25; 50;.100; 200; 400 мкм, обрабатывают, как 45 описано в приведенном вьппе примере, элюируют с колонки с окисью „алюминия

4 мл 5%-ной гидроокиси натрия и измеряют поглощение при 410 нм против контролей, в которых вместо пировино- 50 градной кислоты берут воду.

При концентрации раствора пировиноградной кислоты 25; 50; 100; 200;

400 мкм поглощение при 410 нм .соста7 4

1вляет 0,075; 0,15; 0,31; 0,62; 1,24 соответственно.

Калибровочный график, полученный таким образом, представляет собой прямую линию, которая проходит через нуль. Поглощение для 0,1 м раствора пировиноградной кислоты равно 0,31 °

Предлагаемый способ позволяет количественно и с достаточной избирательностью определить содержание пировиноградной кислоты в биологических объектах за счет использования стадии выделения производного пирувата на колонке с окисью алюминия и удаления при этом мешающих определению производных нейтральных карбонильных соединений.

Такой способ прост в исполнении не требует дорогостоящих реактивов и,оборудования и может быть воспроизведен в лабораторных условиях. Ошибка определения способа — 0,46%.

Предлагаемый способ может найти широкое применение для научных целей в биохимии и медицинской биохимии.

Формула изобретения

Способ количественного определения пировиноградной кислоты путем обработки анализируемой пробы раствором и-диметиламинобензальдегида в этаноле и раствором гидроокиси натрия при нагревании„ включающий спектрофотометрирование, отличающийся тем, что, с целью повышения избирательности определения, к полученному раствору добавляют соляную кислоту до рН 5,9-6,0 и пропускают его через колонку с окисью. алюминия с последующим элюированием п-диметиламинобензальпировиноградной кислоты раствором гидроокиси натрия и спектрофотометрированием элюата.

Источники информации принятые во внимание при экспертизе

1. Коренман И.М..Фотометрический анализ. М., "Химия", 1970, с. 132.

2. М.Kagenra, V.Ohkura, Т.Momose

Chromatography determination of

piruvat acid - Chem. апд Pharm., 1971, 19, р. 2241 -2246 (прототип).